本發(fā)明屬于預(yù)防調(diào)理養(yǎng)護(hù)品領(lǐng)域，特別涉及一種制備具有調(diào)理和增強(qiáng)人體免疫功能的發(fā)酵組合物及制法。
背景技術(shù)：
植物酵素一直是酵素類產(chǎn)品的暢銷品。植物酵素是將數(shù)十種不同的蔬果、谷類、海藻類及菇類等植物，經(jīng)自然發(fā)酵研制而成，保留了植物中的營養(yǎng)精華，含有人體需要的各種酵素、寡糖及多種維他命和礦物質(zhì)，又可產(chǎn)生豐富的SOD抗氧化酶成分，提高體內(nèi)抗氧化能力，進(jìn)而增強(qiáng)免疫力。
現(xiàn)有對(duì)酵素的傳統(tǒng)工藝和現(xiàn)代工藝都做了進(jìn)一步改良，同時(shí)也出現(xiàn)了一些添加益生菌的酵素以及酵素制備的保健食品。益生菌發(fā)酵果蔬，可激活果蔬中的有效功能成分，溶出更精華的活性功效物質(zhì)。但是，傳統(tǒng)的酵素工藝無法大范圍的靈活使用，或無功效性發(fā)酵組合物可在不同酵素的工業(yè)制備過程中靈活使用；為了提高酵素在促進(jìn)體內(nèi)新陳代謝、調(diào)理腸胃功能等方面的作用，以及適應(yīng)大范圍的使用，申請(qǐng)人對(duì)制備酵素的發(fā)酵物進(jìn)一步改良，并研制出提高酵素的功能性作用的配方。
此外，功能性低聚糖是一類具有生理活性、不被人體胃酸、胃酶降解，不在小腸吸收，可到達(dá)大腸部的低聚糖；低聚糖是益生元，是益生菌的生長的底物，具有促進(jìn)人體益生菌的增殖等生理功能。通過將益生菌和功能性低聚糖共同使用，兩者之間具有協(xié)同作用，能促進(jìn)對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)功能。益生菌和低聚糖之間的協(xié)作效應(yīng)，即是合生元中的益生素和益生元之間的協(xié)作效應(yīng)，它們相鋪相成，共同發(fā)揮作用，促進(jìn)有益菌生長增殖，抑制有害菌生長；研究表明，兩者使用可增加健康人糞便中雙歧桿菌的數(shù)量，但單獨(dú)服用益生菌并未見此效果。如專利CN106174179A涉及的酵素組合物，將益生菌和功能性低聚糖結(jié)合使用，并且添加中藥成分，達(dá)到其特定功效。但其配方的制備適用于個(gè)人直接服用，且固定的植物酵素原液再使用時(shí)無法滿足不同口味人的需求，且其制備方法粗糙，制備得的酵素泡騰片中中藥藥渣感強(qiáng)烈，口感不佳。
另一方面，現(xiàn)有的酵素桶，以水果、糖和水為原料制備植物酵素，使得植物酵素的在家庭即可制備，操作簡便。但是也有很多不足之處，1.酵素制備的時(shí)間仍然較長，而且容易制備失敗；2.制得的植物酵素功效不明確，使用者無法自己控制制備植物酵素的功效，現(xiàn)有的植物酵素對(duì)人體免疫功能的改善效果不佳；3.水果等植物中的低分子糖和多聚糖多數(shù)無法利用，不能轉(zhuǎn)化為特定功效的低聚糖。針對(duì)所述不足，申請(qǐng)人著力研究具有縮短酵素制備時(shí)間、使用便捷且具有調(diào)理和增強(qiáng)人體免疫功能的發(fā)酵組合物，即酵素包。同時(shí)為提高酵素的功能性，在現(xiàn)有技術(shù)的酵素發(fā)酵物中添加有效的藥食同源食材成分，使其制備的酵素能夠有效調(diào)節(jié)腸道菌群，增強(qiáng)免疫力，且具有功能作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種制備具有調(diào)理和增強(qiáng)人體免疫功能的發(fā)酵組合物，為直投式發(fā)酵菌劑，該發(fā)酵組合物將益生菌和功能性低聚糖結(jié)合使用，同時(shí)添加藥食同源食材成分，使該組合物在具有良好的腸道菌群調(diào)節(jié)功能的同時(shí)，能夠促進(jìn)小分子糖和多聚糖向低聚糖的轉(zhuǎn)化。用該發(fā)酵組合物制備的植物酵素起到調(diào)理和增強(qiáng)人體免疫功能的作用。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種制備具有調(diào)理和增強(qiáng)人體免疫功能的植物酵素的發(fā)酵組合物，為直投式植物酵素發(fā)酵菌劑，該發(fā)酵組合物包括如下重量份數(shù)的組分：多聚糖0.5～15份、功能性低聚糖3～22份、益生菌0.1～5份和藥食同源食材0.01～10份，
其中，所述多聚糖為酵母β-葡聚糖；
所述藥食同源食材主要由下列重量份的原料制備而成：10～45份的針葉櫻桃粉以及3～26份的蟲草頭孢菌粉；
所述發(fā)酵組合物的制備方法至少包括下述步驟：
將預(yù)定重量份數(shù)的多聚糖、功能性低聚糖和藥食同源食材制成的微粒細(xì)粉均勻混合殺菌，殺菌后與益生菌粉混合均勻，造粒，制得粉狀的發(fā)酵組合物。
該方案中，所述功能性低聚糖為選自殼聚糖、低聚木糖、魔芋甘露低聚糖、甘露低聚糖、乳酮糖、棉籽糖、大豆低聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚乳果糖、魔芋葡甘露糖、海藻糖、帕拉金糖和菊粉中的一種或幾種；
益生菌選自雙歧桿菌(Bifidobacterium)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus.Bulgaricus)、副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)和羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)中的一種或幾種；
益生菌和功能性低聚糖合理結(jié)合使用，兩者具有相互促進(jìn)作用，能夠倍增對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)功能，從而基于腸道菌群的作用發(fā)揮更好的增強(qiáng)免疫力；而結(jié)合酵母β-葡聚糖的使用能有效調(diào)整體內(nèi)消化道的微生態(tài)，促進(jìn)體內(nèi)有益菌的增殖及腸道內(nèi)有害物的排泄；能降低體內(nèi)膽固醇含量，降低體內(nèi)低密度脂蛋白含量，并增加高密度脂蛋白的含量；能提高機(jī)體抵抗病毒、細(xì)菌等感染的能力。配合針葉櫻桃粉以及蟲草頭孢菌粉的使用，可實(shí)現(xiàn)調(diào)理和增強(qiáng)人體免疫功能；針葉櫻桃不僅維C含量豐富，同時(shí)可提供維生素A、E、P、維生素B群，蛋白質(zhì)及多種人體必須的多種礦物微量元素；而蟲草頭孢菌粉對(duì)抗體的非特異性免疫功能具有一定的作用，而且還能顯著提高集體的特異性免疫能力，是一種良好的增強(qiáng)免疫藥物。另一方面，將發(fā)酵組合物制成粉狀，實(shí)現(xiàn)階段式生產(chǎn)，便于后期的直接投入使用或是家庭化使用。
進(jìn)一步地，所述藥食同源食材還包括下述重量份的原料制備而成：3～20份的茯苓、2～18份的枸杞、3～20份的桑葚、1～10份的銀耳、3～20份的大棗以及2～20份的蒲公英。
進(jìn)一步地，所述發(fā)酵組合物由重量份數(shù)為2～6份的酵母β-葡聚糖、5～10份的功能性低聚糖、1～3份的益生菌和0.5～1份的藥食同源食材組成；
其中，所述藥食同源食材由下列重量份的原料制備而成：20～35份的針葉櫻桃粉、8～14份的蟲草頭孢菌粉、9～15份的茯苓、6～12份的枸杞、9～15份的桑葚、4～7份的銀耳、6～12份的大棗以及9～15份的蒲公英。
本發(fā)明的發(fā)酵組合物的優(yōu)選方案，還包括重量份數(shù)為10～30份的抗性糊精，抗性糊精與其他組分共同使用，進(jìn)一步促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，保持腸道健康，并控制油脂和糖的吸收。
進(jìn)一步地，所述功能性低聚糖為低聚半乳糖；
所述益生菌為益生菌粉劑，由如下重量份數(shù)的粉劑均勻混合而成：雙歧桿菌45～60份、鼠李糖乳桿菌50～60份、干酪乳桿菌22～30份、嗜酸乳桿菌18～26份以及植物乳桿菌23～30份，所述益生菌粉劑的活菌含量為2×106～2×1010cfu/g；通過合理配置各類菌種和用量，優(yōu)化本專利產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)的菌種，能有效縮短發(fā)酵組合物在制備植物酵素的時(shí)間，且可使其制備出質(zhì)構(gòu)穩(wěn)定的植物酵素。
上述各類益生菌粉劑的來源：均為市售的的各類菌種的粉劑或通過將市售的各類菌種經(jīng)液體培養(yǎng)，離心收集和洗滌菌體后，干燥制備成活性粉劑。
本發(fā)明的發(fā)酵組合物其中一個(gè)優(yōu)選方案中，所述發(fā)酵組合物還包括重量份數(shù)為1～3份的酵母菌、1～3份的醋酸桿菌和1～5份的乳酸菌；
所述發(fā)酵組合物的制備方法還包括：
(1)將1/2量的所述粉狀的發(fā)酵組合物制成軟材，與所述重量份的乳酸菌混合均勻后進(jìn)行擠出造丸，制成丸芯；
(2)將1/2量的所述粉狀的發(fā)酵組合物與所述重量份的酵母菌和醋酸桿菌混合均勻，制成軟材物，備用；
(3)將制得的丸芯置于預(yù)先配制的包衣液中，進(jìn)行包衣；
(4)對(duì)包衣處理后的包衣丸芯在步驟(2)的軟材物中滾圓擠壓，再進(jìn)行干燥，即得丸狀發(fā)酵組合物；
其中，所述包衣液為由重量份數(shù)為0.4-10份的聚丙烯酸樹脂L100-55、0.1-2份的鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素以及0.05-0.2份蓖麻油加入適量純化水配制成的水分散體。
本發(fā)明所述發(fā)酵組合物的制備方法，包括以下步驟：
1)藥食同源食材的制備：
將所述重量份的茯苓粉碎，過60目篩，制得茯苓粉末；
將茯苓粉末和預(yù)定重量份的枸杞、桑葚、銀耳、大棗、蒲公英用8倍重量的水，在溫度80-90℃下保持4h，然后降溫至40℃，加2倍重量濃度為75％的乙醇回流4h，過濾，得第一濾液；添加濾渣3倍重量的水，在溫度80-90℃下保持2.5h，然后降溫至30℃，過濾，的第二濾液；合并濾液，減壓濃縮、冷凍干燥，低溫粉碎成粗粉；
將粗粉與針葉櫻桃粉、蟲草頭孢菌粉混合均勻，繼續(xù)粉碎成0.05-0.2mm的細(xì)粉；
2)將步驟1)中的細(xì)粉與乳化劑、水混合后用剪切機(jī)進(jìn)行3000-5000轉(zhuǎn)的高速剪切，邊攪拌邊滴加壁材單體進(jìn)行造壁，形成納米級(jí)的微粒；
3)將預(yù)定重量份數(shù)的功能性低聚糖、酵母β-葡聚糖、抗性糊精和步驟2)中的微粒均勻混合，通過換熱器進(jìn)行殺菌，條件為99℃，300s；
4)殺菌后混合物降溫至40-45℃，加入預(yù)定量的益生菌凍干劑，混合均勻后加入干法造粒機(jī)造粒，制得粉狀的發(fā)酵組合物，無菌打包即得。
上述方法制備的發(fā)酵組合物活菌率高，微粒處理的中藥細(xì)粉口感細(xì)膩，中藥微粒囊心通過溶解、滲透、擴(kuò)散等過程，透過膜壁緩緩釋放出來，具有很好的緩釋效果。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種具有調(diào)理和增強(qiáng)人體免疫功能的植物酵素，是針對(duì)個(gè)人或家庭自制植物酵素而制定的，該植物酵素的制備方法包括以下步驟：
(a)制備粉狀發(fā)酵組合物
(b)混合原料：凈選1kg的植物原料，與0.3～0.6kg重量的糖放入酵素桶內(nèi)，加入5～6L的純凈水，混合均勻，同時(shí)添加重量為20～50g的步驟(a)制備的發(fā)酵組合物至酵素桶內(nèi)，封蓋，于發(fā)酵溫度為28～30℃的環(huán)境中進(jìn)行避光發(fā)酵；
(c)發(fā)酵：對(duì)酵素桶內(nèi)的發(fā)酵物進(jìn)行每天早晚一次的攪拌，發(fā)酵5～8d后，過濾，即得植物酵素。
該方法簡單快捷，實(shí)現(xiàn)各種功能植物酵素的自制，該方法優(yōu)選使用酵素桶進(jìn)行制備，酵素桶選用市面銷售的即可；亦可使用密閉環(huán)境的器皿進(jìn)行制備。
本發(fā)明植物酵素的制備方法的另一個(gè)優(yōu)選方案，所述方法包括以下步驟：
a)制備粉狀的發(fā)酵組合物
b)植物提取液的制備：凈選3kg的植物原料，添加1kg重量的糖至植物原料中，并加入10L的純凈水，混合均勻，靜置浸提1～2d后，進(jìn)行高溫滅菌，過濾，得植物提取液；
c)植物酵素原液的制備：接種復(fù)合菌群至植物提取液中，混勻置于密閉環(huán)境，進(jìn)行避光發(fā)酵1～2個(gè)月，得到植物酵素原液；
其中接種量為8～12％；復(fù)合菌群為釀酒酵母、德氏乳桿菌乳亞種、植物乳桿菌、革蘭氏乳桿菌、嗜酸性乳桿菌和醋酸桿菌中的幾種；
d)植物酵素的制備：選用10L以上的大桶，添加天然麥芽糖125g、維生素C鈉5g、8L水以及植物原料0.5kg，加入150ml的植物酵素原液于密閉環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為28～30℃，每天放氣1～2次，發(fā)酵1～2d后；添加30g的步驟a)制備的發(fā)酵組合物，發(fā)酵溫度不變，繼續(xù)發(fā)酵3-4d，過濾，即得植物酵素。
該方式適用于工業(yè)生產(chǎn)，結(jié)合植物酵素原液初次發(fā)酵和本發(fā)明發(fā)酵組合物的二次發(fā)酵實(shí)現(xiàn)多級(jí)深層液態(tài)發(fā)酵；大大提高發(fā)酵效率。發(fā)酵過程中可釋放出封閉在中藥或植物結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物素，對(duì)植物原有的活性物質(zhì)進(jìn)行保留，植物中不溶性纖維變?yōu)榭扇苄陨攀忱w維提高原有植物的功效。
再一個(gè)植物酵素的制備方法的優(yōu)選方案，亦為雙層丸狀構(gòu)造的發(fā)酵組合物的使用方法，所述制備方法包括以下步驟：
I)制備丸狀的發(fā)酵組合物
II)植物提取液的制備：凈選3kg的植物原料，添加1kg重量的糖至植物原料中，并加入10L的純凈水，混合均勻，靜置浸提1～2d后，進(jìn)行高溫滅菌，過濾，得植物提取液；
III)植物酵素的制備：選用10L以上的大桶，添加天然麥芽糖125g、維生素C鈉5g、8L水以及植物提取液1kg，加入30g的步驟II)制備的丸狀的發(fā)酵組合物，于密閉環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵溫度為30～32℃，每天放氣1～2次；發(fā)酵1～2d后，插入導(dǎo)管通入空氣，每天通氣2-4次，每次10-30min，并控制發(fā)酵溫度為35～37℃；發(fā)酵5～7d后過濾，即得植物酵素。
該方法簡單快捷，實(shí)現(xiàn)各種功能植物酵素的自制，且發(fā)酵過程簡單深入，一次操作實(shí)現(xiàn)二級(jí)發(fā)酵，甚至多級(jí)發(fā)酵；制備得的植物酵素營養(yǎng)成分豐富，人體吸收率高，進(jìn)一步提高其功效。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：
本發(fā)明研制的發(fā)酵組合物為新型發(fā)酵產(chǎn)品，是用于制備酵素的“發(fā)酵菌包”，改良了直接添加益生菌制備植物酵素的傳統(tǒng)工藝，該菌包使用方便，可直接以顆粒劑的菌包在市面上售賣，亦可投入各類植物酵素的工業(yè)化生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)植物酵素的即配即用和多元化的功能性配置，極大地提高植物酵素的制備效率。
本發(fā)明的發(fā)酵組合物中添加的藥食同源食材組分具有其生理活性和保健作用，同時(shí)為益生菌在發(fā)酵中補(bǔ)充營養(yǎng)，具有較高的實(shí)用價(jià)值，而本發(fā)明的藥食同源食材成分具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力之功效；益生菌、功能性低聚糖以及藥食同源食材各組分之間配伍合理，療效明確，具有協(xié)同增效的作用。
本發(fā)明的植物酵素符合保健品的要求和發(fā)展趨勢，植物酵素可產(chǎn)生大量對(duì)人體有益的植物綜合酶，這些酶對(duì)人體的代謝和機(jī)能調(diào)整起著重要作用，同時(shí)還含有維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸、低聚糖等營養(yǎng)成分。本發(fā)明通過添加上述發(fā)酵組合物進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵組合物中的藥食同源食材成分經(jīng)益生菌轉(zhuǎn)換，由大分子變成小分子，極易被人體吸收；益生菌的添加可改善藥食同源食材口味，發(fā)酵過程中能分解毒性，實(shí)現(xiàn)真正的無毒副作用，同時(shí)該發(fā)酵組合物制備的植物酵素相較于傳統(tǒng)的中藥制劑，提高了藥效；此外，其作為日常飲品服用，從治本的角度改善脂質(zhì)代謝，顯著提高人體的特異性免疫能力，是一種良好的增強(qiáng)免疫的保健制劑。
此外，發(fā)酵組合物直接添加制備植物酵素的工藝過程簡單，成本低廉，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，相較于現(xiàn)有技術(shù)，縮短了制備和發(fā)酵的時(shí)間，且制備過程安全。
本發(fā)明的藥食同源食材原料成分的來源：
針葉櫻桃：為金虎尾科(Malpighiaceae)金虎尾屬(Malpighia)凹緣金虎尾(M.emarginata)的果實(shí)。本發(fā)明使用的是市售的針葉櫻桃粉。
蟲草頭孢菌粉：從天然冬蟲夏草新鮮標(biāo)本中分離得到的蟲草頭孢新菌株，采用生物工程技術(shù)精制而成。本發(fā)明使用的是市售的蟲草頭孢菌粉。
茯苓：本品為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。
枸杞：本品為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實(shí)。
桑葚：本品為?？浦参锷orus alba L.的干燥果穗。
銀耳：真菌類銀耳科銀耳屬植物銀耳Tremellafuciformis Berk.以子實(shí)體入藥。
大棗：本品為鼠李科棗屬植物棗Ziziphus jujuba Mill.var.inermis(Bunge)Rehd.的干燥成熟果實(shí)。
蒲公英：本品為菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.、堿地蒲公英Taraxacum sinicum Kitag.或同屬數(shù)種植物的干燥全草。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1發(fā)酵組合物
本實(shí)施例的發(fā)酵組合物的處方為：
多聚糖：酵母β-葡聚糖48g
功能性低聚糖：低聚半乳糖80g
益生菌粉劑：24g，其中每g益生菌粉中含雙歧桿菌4.5份、鼠李糖乳桿菌5份、干酪乳桿菌2.2份、嗜酸乳桿菌1.8份以及植物乳桿菌2.3份；
藥食同源食材成分：8g，其中每g提取物由下述重量份數(shù)的原料提取而成：針葉櫻桃粉2份、蟲草頭孢菌粉0.8份、茯苓0.9份、枸杞0.6份、桑葚0.9份、銀耳0.4份、大棗0.6份以及蒲公英0.9份；
抗性糊精80g。
制備方法：
1)藥食同源食材的制備：
將所述重量份的茯苓粉碎，過60目篩，制得茯苓粉末；
將茯苓粉末和預(yù)定重量份的枸杞、桑葚、銀耳、大棗、蒲公英用8倍重量的水，在溫度80-90℃下保持4h，然后降溫至40℃，加2倍重量濃度為75％的乙醇回流4h，過濾，得第一濾液；添加濾渣3倍重量的水，在溫度80-90℃下保持2.5h，然后降溫至30℃，過濾，的第二濾液；合并濾液，減壓濃縮、冷凍干燥，低溫粉碎成粗粉；
將粗粉與針葉櫻桃粉、蟲草頭孢菌粉混合均勻，繼續(xù)粉碎成0.05-0.2mm的細(xì)粉；
2)將步驟1)中的細(xì)粉與乳化劑、水混合后用剪切機(jī)進(jìn)行3000-5000轉(zhuǎn)的高速剪切，邊攪拌邊滴加壁材單體進(jìn)行造壁，形成納米級(jí)的微粒；
3)將預(yù)定重量份數(shù)的功能性低聚糖、酵母β-葡聚糖、抗性糊精和步驟2)中的微粒均勻混合，通過換熱器進(jìn)行殺菌，條件為99℃，300s；
4)殺菌后混合物降溫至40-45℃，加入預(yù)定量的益生菌凍干劑，混合均勻后加入干法造粒機(jī)造粒，制得粉狀的發(fā)酵組合物，無菌裝袋，每袋30g。
實(shí)施例2發(fā)酵組合物
本實(shí)施例的發(fā)酵組合物的處方為：
多聚糖：酵母β-葡聚糖40g
功能性低聚糖：低聚半乳糖100g
益生菌粉劑：20g，其中每g益生菌粉中含雙歧桿菌6份、鼠李糖乳桿菌6份、干酪乳桿菌3份、嗜酸乳桿菌2.6份以及植物乳桿菌3份；藥食同源食材成分：10g，其中每g提取物由下述重量份數(shù)的原料提取而成：針葉櫻桃粉3.5份、蟲草頭孢菌粉1.4份、茯苓1.5份、枸杞1.2份、桑葚1.5份、銀耳0.7份、大棗1.2份以及蒲公英1.5份。
制備方法：
1)藥食同源食材的制備：
將所述重量份的茯苓粉碎，過60目篩，制得茯苓粉末；
將茯苓粉末和預(yù)定重量份的枸杞、桑葚、銀耳、大棗、蒲公英用8倍重量的水，在溫度80-90℃下保持4h，然后降溫至40℃，加2倍重量濃度為75％的乙醇回流4h，過濾，得第一濾液；添加濾渣3倍重量的水，在溫度80-90℃下保持2.5h，然后降溫至30℃，過濾，的第二濾液；合并濾液，減壓濃縮、冷凍干燥，低溫粉碎成粗粉；
將粗粉與針葉櫻桃粉、蟲草頭孢菌粉混合均勻，繼續(xù)粉碎成0.05-0.2mm的細(xì)粉；
2)將步驟1)中的細(xì)粉與乳化劑、水混合后用剪切機(jī)進(jìn)行3000-5000轉(zhuǎn)的高速剪切，邊攪拌邊滴加壁材單體進(jìn)行造壁，形成納米級(jí)的微粒；
3)將預(yù)定重量份數(shù)的功能性低聚糖、酵母β-葡聚糖和步驟2)中的微粒均勻混合，通過換熱器進(jìn)行殺菌，條件為99℃，300s；
4)殺菌后混合物降溫至40-45℃，加入預(yù)定量的益生菌凍干劑，混合均勻后加入干法造粒機(jī)造粒，制得粉狀的發(fā)酵組合物，無菌裝袋，每袋30g。
實(shí)施例3發(fā)酵組合物
本實(shí)施例的發(fā)酵組合物的處方為：
多聚糖：酵母β-葡聚糖10g
功能性低聚糖：低聚半乳糖60g
益生菌粉劑：2g，其中每g益生菌粉中含雙歧桿菌5.5份、鼠李糖乳桿菌5.6份、干酪乳桿菌2.5份、嗜酸乳桿菌2份以及植物乳桿菌2.6份；
藥食同源食材成分：0.2g，其中每g提取物由下述重量份數(shù)的原料提取而成：針葉櫻桃粉1份、蟲草頭孢菌粉0.3份、茯苓0.3份、枸杞0.2份、桑葚0.3份、銀耳0.1份、大棗0.3份以及蒲公英0.2份；
抗性糊精：200g。
制備方法：按照實(shí)施例1的制備方法制備，制得粉劑，每袋30g。
實(shí)施例4發(fā)酵組合物
本實(shí)施例的發(fā)酵組合物的處方為：
多聚糖：酵母β-葡聚糖150g
功能性低聚糖：殼聚糖104g，甘露低聚糖116g；
益生菌粉劑：50g，其中每g益生菌粉中含雙歧桿菌5.5份、保加利亞乳桿菌2.4份、嗜酸乳桿菌1.7份以及植物乳桿菌2.4份；
藥食同源食材成分：100g，其中每g提取物由下述重量份數(shù)的原料提取而成：針葉櫻桃粉4.5份、蟲草頭孢菌粉3份、茯苓2份、枸杞1.8份、桑葚2份、銀耳1份、大棗2份以及馬蒲公英2份。
制備方法：按照實(shí)施例2的制備方法制備，制得粉劑，每袋30g。
實(shí)施例5發(fā)酵組合物
本實(shí)施例的發(fā)酵組合物的處方為：
多聚糖：酵母β-葡聚糖80g
功能性低聚糖：低聚木糖83g、大豆低聚糖粉61g、低聚果糖56g；
益生菌粉劑：20g，其中每g益生菌粉中含長雙歧桿菌4份、干酪乳桿菌1.8份、唾液乳桿菌0.9份、嗜酸乳桿菌1.5份以及植物乳桿菌2.2份；
藥食同源食材成分：50g，其中每g提取物由下述重量份數(shù)的原料提取而成：針葉櫻桃粉3.5份、蟲草頭孢菌粉1.6份、茯苓1.5份、枸杞1.2份、桑葚0.9份、銀耳0.7份、大棗0.6份以及蒲公英0.8份；
抗性糊精：300g
制備方法：按照實(shí)施例1的制備方法制備，制得粉劑，每袋30g。
實(shí)施例6發(fā)酵組合物
本實(shí)施例的發(fā)酵組合物的處方為：
多聚糖：酵母β-葡聚糖72g
功能性低聚糖：低聚木糖43g、甘露低聚糖40g、低聚果糖23g、低聚半乳糖22g以及海藻糖19g；
益生菌粉劑：10.1g，其中每g益生菌粉中含短雙歧桿菌2.3份、乳雙歧桿菌2份、鼠李糖乳桿菌2.4份、瑞士乳桿菌1.3份、布氏乳桿菌1份、保加利亞乳桿菌1.7份以及副干酪乳桿菌0.9份；
藥食同源食材成分：4.55g，其中每g提取物由下述重量份數(shù)的原料提取而成：針葉櫻桃粉2.1份、蟲草頭孢菌粉1.3份、茯苓0.8份、枸杞1.2份、桑葚1份、銀耳0.9份、大棗1.6份以及蒲公英1.2份；
抗性糊精70.5g。
制備方法：按照實(shí)施例1的制備方法制備，制得粉劑，每袋30g。
實(shí)施例7發(fā)酵組合物
本實(shí)施例的發(fā)酵組合物的處方為：
多聚糖：酵母β-葡聚糖48g
功能性低聚糖：低聚半乳糖80g
益生菌粉劑：24g，其中每g益生菌粉中含雙歧桿菌4.5份、鼠李糖乳桿菌5份、干酪乳桿菌2.2份、嗜酸乳桿菌1.8份以及植物乳桿菌2.3份；
藥食同源食材成分：8g，其中每g提取物由下述重量份數(shù)的原料提取而成：針葉櫻桃粉2份、蟲草頭孢菌粉0.8份。
制備方法：
1)將粗針葉櫻桃粉、蟲草頭孢菌粉混合均勻，繼續(xù)粉碎成0.05-0.2mm的細(xì)粉；
2)將步驟1)中的細(xì)粉與乳化劑、水混合后用剪切機(jī)進(jìn)行3000-5000轉(zhuǎn)的高速剪切，邊攪拌邊滴加壁材單體進(jìn)行造壁，形成納米級(jí)的微粒；
3)將預(yù)定重量份數(shù)的功能性低聚糖、酵母β-葡聚糖和步驟2)中的微粒均勻混合，通過換熱器進(jìn)行殺菌，條件為99℃，300s；
4)殺菌后混合物降溫至40-45℃，加入預(yù)定量的益生菌凍干劑，混合均勻后加入干法造粒機(jī)造粒，制得粉狀的發(fā)酵組合物，無菌裝袋，每袋30g。
實(shí)施例8發(fā)酵組合物
實(shí)施例1制成的粉劑發(fā)酵組合物32g；酵母菌1g；醋酸桿菌1g；乳酸菌1g；包衣液由聚丙烯酸樹脂L100-5520g、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素5g以及蓖麻油2.5g添加適量純化水配制；
制備方法：
(1)將1/2量的所述粉劑發(fā)酵組合物制成軟材，與所述重量份的乳酸菌混合均勻后進(jìn)行擠出造丸，制成丸芯；
(2)將1/2量的所述粉劑發(fā)酵組合物與所述重量份的酵母菌和醋酸桿菌混合均勻，制成軟材物，備用；
(3)將制得的丸芯置于預(yù)先配制的包衣液中，進(jìn)行包衣；
(4)對(duì)包衣處理后的包衣丸芯在步驟(2)的軟材物中滾圓擠壓，再進(jìn)行干燥，即得丸狀發(fā)酵組合物，包裝。
其中制得的丸粒直徑為4-7mm，丸芯直徑為2-5mm；優(yōu)選丸粒直徑5mm，丸芯直徑為2.8mm。
實(shí)施例9發(fā)酵組合物
本實(shí)施例的發(fā)酵組合物的處方為：
實(shí)施例3制成的粉劑發(fā)酵組合物23.1g；酵母菌3g；醋酸桿菌3g；乳酸菌5g；包衣液由聚丙烯酸樹脂L100-5510g、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素2g以及蓖麻油0.2g添加適量純化水配制；
制備方法：
(2)將1/2量的所述粉劑發(fā)酵組合物制成軟材，與所述重量份的乳酸菌混合均勻后進(jìn)行擠出造丸，制成丸芯；
(2)將1/2量的所述粉劑發(fā)酵組合物與所述重量份的酵母菌和醋酸桿菌混合均勻，制成軟材物，備用；
(3)將制得的丸芯置于預(yù)先配制的包衣液中，進(jìn)行包衣；
(4)對(duì)包衣處理后的包衣丸芯在步驟(2)的軟材物中滾圓擠壓，再進(jìn)行干燥，即得丸狀發(fā)酵組合物，包裝。
其中制得的丸粒直徑為4-7mm，丸芯直徑為2-5mm；優(yōu)選丸粒直徑5mm，丸芯直徑為2.8mm。
實(shí)施例10植物酵素
本實(shí)施例的植物酵素由下述方法制備而成：
a)發(fā)酵組合物的制備:按照實(shí)施例1的發(fā)酵組合物制備；
b)植物提取液的制備：凈選3kg的植物原料，添加1kg重量的糖至植物原料中，并加入10L的純凈水，混合均勻，靜置浸提1～2d后，進(jìn)行高溫滅菌，過濾，得植物提取液；
c)植物酵素原液的制備：接種復(fù)合菌群至植物提取液中，混勻置于密閉環(huán)境，進(jìn)行避光發(fā)酵2個(gè)月，得到植物酵素原液；
其中接種量為12％；復(fù)合菌群為植物乳桿菌、革蘭氏乳桿菌、嗜酸性乳桿菌和醋酸桿菌中；
d)植物酵素的制備：選用10L以上的大桶，添加天然麥芽糖125g、維生素C鈉5g、8L水以及植物原料0.5kg，加入150ml的植物酵素原液于密閉環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為28～30℃，每天放氣1～2次，發(fā)酵1～2d后；添加30g的步驟a)制備的發(fā)酵組合物，發(fā)酵溫度不變，繼續(xù)發(fā)酵3-4d，過濾，即得植物酵素。
其中，植物原料選用蘋果500g、大豆200g和西紅柿300g，洗凈切片使用。
感觀分析：該植物酵素色澤均勻，呈紅褐色，有濃郁的果香與發(fā)酵香氣，口感醇厚，酸甜適宜，入口不刺激，余味甘甜。
實(shí)施例11植物酵素
本實(shí)施例的植物酵素由下述方法制備而成：
a)發(fā)酵組合物的制備：按照實(shí)施例2的發(fā)酵組合物制備；
b)植物提取液的制備：凈選1kg的植物原料，添加0.3～0.6kg重量的糖至植物原料中，并加入5～6L的純凈水，混合均勻，靜置浸提1～2d后，進(jìn)行高溫滅菌，過濾，得植物提取液；
c)混合及初步發(fā)酵：添加重量為60g的步驟a)制備的發(fā)酵組合物至步驟b)中的植物提取液中，混勻置于密閉環(huán)境，保持發(fā)酵溫度28℃，進(jìn)行避光發(fā)酵，得到初步發(fā)酵液；
d)發(fā)酵液于密閉環(huán)境中進(jìn)行后熟7d，過濾，即得植物酵素。
其中，植物原料選用獼猴桃100g、草莓90g、山楂40g、芒果220g、胡蘿卜80g、白蘿卜140g、白菜150g、木耳80g以及蘑菇100g。
感觀分析：該植物酵素色澤均勻，呈深黃色與褐色之間，有濃郁的果香與發(fā)酵香氣，口感醇厚，酸甜適宜，入口不刺激，余味甘甜。
實(shí)施例12植物酵素
本實(shí)施例的植物酵素由下述方法制備而成：
a)發(fā)酵組合物的制備：按照實(shí)施例3的發(fā)酵組合物制備；
b)植物提取液的制備：凈選3kg的植物原料，添加1kg重量的糖至植物原料中，并加入10L的純凈水，混合均勻，靜置浸提1～2d后，進(jìn)行高溫滅菌，過濾，得植物提取液；
c)植物酵素原液的制備：接種復(fù)合菌群至植物提取液中，混勻置于密閉環(huán)境，進(jìn)行避光發(fā)酵1個(gè)月，得到植物酵素原液；
其中接種量為8～12％；復(fù)合菌群為釀酒酵母、德氏乳桿菌乳亞種、植物乳桿菌、革蘭氏乳桿菌、嗜酸性乳桿菌和醋酸桿菌中的幾種；
d)植物酵素的制備：選用10L以上的大桶，添加天然麥芽糖125g、維生素C鈉5g、8L水以及植物原料0.5kg，加入150ml的植物酵素原液于密閉環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為28～30℃，每天放氣1～2次，發(fā)酵1～2d后；添加30g的步驟a)制備的發(fā)酵組合物，發(fā)酵溫度不變，繼續(xù)發(fā)酵3-4d，過濾，即得植物酵素。
其中，植物原料選用百香果120g、柑橘200g、葡萄100g、山藥50g、南瓜220g、芹菜40g、空心菜50g、豆芽50g、海帶60g、紫菜40g以及金針菇70g。
感觀分析：該植物酵素色澤均勻，呈深褐色，有濃郁的果香與發(fā)酵香氣，口感醇厚，酸甜適宜，入口不刺激，余味甘甜。
實(shí)施例13植物酵素
本實(shí)施例的植物酵素由下述方法制備而成：
a)發(fā)酵組合物的制備：按照實(shí)施例5的發(fā)酵組合物制備；
b)植物提取液的制備：凈選1kg的植物原料，添加0.3～0.6kg重量的糖至植物原料中，并加入5～6L的純凈水，混合均勻，靜置浸提1～2d后，進(jìn)行高溫滅菌，過濾，得植物提取液；
c)混合及初步發(fā)酵：添加重量為30～60g的步驟a)制備的發(fā)酵組合物至步驟b)中的植物提取液中，混勻置于密閉環(huán)境，保持發(fā)酵溫度30℃，進(jìn)行避光發(fā)酵，得到初步發(fā)酵液；
d)發(fā)酵液于密閉環(huán)境中進(jìn)行后熟7d，過濾，即得植物酵素。
其中，植物原料選用蘋果500g、大豆200g和西紅柿300g。
感觀分析：該植物酵素色澤均勻，呈紅褐色，有濃郁的果香與發(fā)酵香氣，口感醇厚，酸甜適宜，入口不刺激，余味甘甜。
實(shí)施例14植物酵素
本實(shí)施例的植物酵素由下述方法制備而成：
a)發(fā)酵組合物的制備：按照實(shí)施例1的發(fā)酵組合物制備；
b)混合原料：凈選1kg的植物原料，與0.3～0.6kg重量的糖放入酵素桶內(nèi)，加入5～6L的純凈水，混合均勻，同時(shí)添加重量為20～50g的步驟a)制備的發(fā)酵組合物至酵素桶內(nèi)，封蓋，于發(fā)酵溫度為28～30℃的環(huán)境中進(jìn)行避光發(fā)酵；
c)發(fā)酵：對(duì)酵素桶內(nèi)的發(fā)酵物進(jìn)行每天早晚一次的攪拌，發(fā)酵4～6d后，過濾，即得植物酵素。
其中，植物原料選用蘋果500g、大豆200g和西紅柿300g。
感觀分析：該植物酵素色澤均勻，呈紅褐色，有濃郁的果香與發(fā)酵香氣，口感醇厚，酸甜適宜，入口不刺激，余味甘甜。
實(shí)施例15植物酵素
本實(shí)施例的植物酵素由下述方法制備而成：
I)按照實(shí)施例8制備丸狀的發(fā)酵組合物
II)植物提取液的制備：凈選3kg的植物原料，添加1kg重量的糖至植物原料中，并加入10L的純凈水，混合均勻，靜置浸提1～2d后，進(jìn)行高溫滅菌，過濾，得植物提取液；
III)植物酵素的制備：選用10L以上的大桶，添加天然麥芽糖125g、維生素C鈉5g、8L水以及植物提取液1kg，加入30g的步驟II)制備的丸狀的發(fā)酵組合物，于密閉環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵；發(fā)酵溫度為30～32℃，每天放氣1～2次；發(fā)酵1～2d后，插入導(dǎo)管通入空氣，每天通氣2-4次，每次10-30min，并控制發(fā)酵溫度為35～37℃；發(fā)酵5～7d后過濾，即得植物酵素。
其中，植物原料選用蘋果500g、大豆200g和西紅柿300g。
感觀分析：該植物酵素色澤均勻，呈紅褐色，有濃郁的果香與發(fā)酵香氣，口感醇厚，酸甜適宜，入口不刺激，余味甘甜。
對(duì)實(shí)施例8的丸狀發(fā)酵組合物發(fā)酵過程的觀察：丸狀發(fā)酵組合物在發(fā)酵過程中，丸粒外層組分在溶液中迅速溶解，隨后丸芯溶解緩慢，約1-2d后包衣膜逐漸消失，丸芯完全溶解。
對(duì)照實(shí)施例1植物酵素
本實(shí)施例的植物酵素由下述方法制備而成：
a)植物提取液的制備：凈選1kg的植物原料，添加0.3～0.6kg重量的糖至植物原料中，并加入5～6L的純凈水，混合均勻，靜置浸提1～2d后，進(jìn)行高溫滅菌，過濾，得植物提取液；
b)混合及初步發(fā)酵：接種復(fù)合益生菌至步驟b)中的植物提取液中，混勻置于密閉環(huán)境，保持發(fā)酵溫度30℃，進(jìn)行避光發(fā)酵，得到初步發(fā)酵液；
c)發(fā)酵液于密閉環(huán)境中進(jìn)行后熟7d，取部分發(fā)酵液過濾，做感觀分析；繼續(xù)后熟14d，取部分發(fā)酵液過濾，做感觀分析。
其中，復(fù)合益生菌為雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌以及植物乳桿菌；接種量為8％(質(zhì)量百分比)；
植物原料選用蘋果500g、大豆200g和西紅柿300g。
7天后的發(fā)酵液的感觀分析：該植物酵素色澤呈紅褐色，組織流動(dòng)性大、入口略有刺激、甜膩味較重；14天后的發(fā)酵液的感觀分析：該植物酵素色澤均勻，呈紅褐色，有濃郁的果香與發(fā)酵香氣，口感醇厚，酸甜適宜，入口不刺激，余味甘甜。可知，傳統(tǒng)方法制備的植物酵素需要的發(fā)酵時(shí)間比本發(fā)明植物酵素的發(fā)酵時(shí)間更長。
對(duì)照實(shí)施例2
本實(shí)施例的發(fā)酵組合物的處方與實(shí)施例1相同
發(fā)酵組合物制備方法：
(1)按照實(shí)施例1步驟1)制備藥食同源食材：
(2)將預(yù)定重量份數(shù)的藥食同源食材、功能性低聚糖、酵母β-葡聚糖、益生菌粉劑、抗性糊精均勻混合，將混合粉加入干法造粒機(jī)造粒，制得發(fā)酵組合物的顆粒劑，裝袋，每袋30g。
植物酵素制備方法：按照實(shí)施例10的方法制備得植物酵素。
(2)感觀分析：該植物酵素色澤不均，渾濁，有漂浮物，呈紅褐色，果香味較淡，入口不刺激。
試驗(yàn)例1發(fā)酵組合物的活菌存活檢測
將本發(fā)明實(shí)施例1、實(shí)施例8和對(duì)照實(shí)施例2制備的發(fā)酵組合物，用無菌水制備成活菌數(shù)為2×108CFU/mL的待測溶液，于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>
取保存好的10mL的待測溶液注入到試管1中，采用十倍逐級(jí)稀釋至10-8，取1mL稀釋液在平板上，將滅菌后冷卻至45℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注在平板(滅菌)上，迅速搖勻。再將裝有10mL的待測溶液的試管2置于80-90℃水浴鍋中加熱15-25min，取加熱后的待測溶液進(jìn)行十倍逐級(jí)稀釋至10-8，取1mL稀釋液在平板上，將滅菌后冷卻至45℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注在平板(滅菌)上并迅速搖勻。最后將加熱前和加熱后的平板均在35℃條件下培養(yǎng)24h，計(jì)算加熱前后的活菌數(shù)量。
結(jié)果表明，活菌存活率達(dá)到了分別為93.2％、94.1％和62％。
試驗(yàn)例2植物酵素的活菌存活檢測
1、模擬胃液及腸液的耐受試驗(yàn)
取100g/L的鹽酸16.4mL加蒸餾水稀釋，使pH值分別為1.5、2.5和3.5，取100mL稀鹽酸溶液，分別加入1g胃蛋白酶，使其充分溶解，得模擬胃液，微孔濾膜除菌(0.22μm)備用。取磷酸二氫鉀6.8g，加水500mL使溶解，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8；另取胰蛋白酶10g，加水100mL使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1000ml，得模擬腸液，微孔濾膜除菌(0.22μm)備用。
取1mL保存好的實(shí)施例10和實(shí)施例15植物酵素溶液加入到9mL的模擬胃液中(即十倍逐級(jí)稀釋)，并迅速在振蕩器上充分混勻，然后置于30-45℃靜置培養(yǎng)2-4h。分別在1h、2h、3h、4h的時(shí)候取出培養(yǎng)液并立即計(jì)數(shù)殘存活菌數(shù)，與原活菌數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，活菌存活率均為98％。然后取在人工胃液中消化不同時(shí)間的培養(yǎng)液各1mL，分別接種于9mL pH值為6.8的人工腸液中，置于30-45℃靜置培養(yǎng)2-4h，并分別在0、3、6、24h取樣，測定其活菌數(shù)，與原活菌數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果表明活菌存活率均為99％。
試驗(yàn)例3增強(qiáng)免疫力功效實(shí)驗(yàn)
1材料
1.1受試樣品為實(shí)施例10制得的植物酵素
1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及環(huán)境：SPF級(jí)KM雌性小鼠，體重18-22g；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室溫度：22～25℃，相對(duì)濕度：55～70％。
2方法與結(jié)果
按照人的日攝入量30ml/60kg bw(即0.5ml/1kg bw)擴(kuò)大5、10、30倍設(shè)置低、中、高三個(gè)劑量：2.5ml/kg bw、5ml/kg bw、15ml/kg bw；同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組。試驗(yàn)組采用蒸餾水調(diào)配好濃度后給予，陰性對(duì)照組直接給予蒸餾水，灌胃小鼠30天。
2.1ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
按規(guī)定劑量給各組試驗(yàn)小鼠連續(xù)灌胃30d后，頸椎脫臼處死小鼠，無菌取脾，制成單細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL)。將小鼠脾細(xì)胞懸液分別加入24孔培養(yǎng)板中，每個(gè)處理使用兩個(gè)復(fù)孔，每孔1mL，一孔加入50μLConA，另一孔加入的50μL雙蒸水作為對(duì)照，然后將培養(yǎng)板置于5％CO2，37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束前4h，加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1mL DMSO，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每孔分裝3個(gè)復(fù)孔，用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定OD值。用加孔的光密度值減去不加孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力。
淋巴細(xì)胞的增殖能力＝ConA孔OD值-對(duì)照孔OD值。
表1植物酵素對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響(n＝10)
由表1可見，與對(duì)照組比較，各劑量組OD值均高于對(duì)照組，且隨劑量增加而增加，其中高、中劑量組OD值與對(duì)照組值相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或P＜0.01)。這表明本發(fā)明的植物酵素具有增強(qiáng)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的作用，即具有增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫功能的作用。
2.2二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)試驗(yàn)
按規(guī)定劑量給各組試驗(yàn)小鼠連續(xù)灌胃30d后，小鼠腹部去毛，用1％DNFB丙酮麻油溶液50μL涂抹致敏，致敏后5d，小鼠右耳均勻涂抹1％DNFB丙酮麻油溶液10μL進(jìn)行攻擊，左耳涂抹丙酮麻油溶液作對(duì)照，攻擊后24h處死小鼠，剪下左右耳殼，于同一部位取直徑8mm的耳片稱重，左右耳片重量之差作為腫脹度。
表2植物酵素對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響(n＝10)
由表2可知，與對(duì)照組相比，本發(fā)明植物酵素的低劑量對(duì)小鼠耳腫脹度影響不明顯(P＞0.05)；中劑量和高劑量對(duì)小鼠耳腫脹度有明顯促進(jìn)升高作用(P＜0.05＝。植物酵素對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的耳腫脹度具有促進(jìn)作用，即具有增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫功能的作用。
2.3抗體生成細(xì)胞檢測
按規(guī)定劑量給各組試驗(yàn)小鼠連續(xù)灌胃30d后，每鼠腹腔注射2％(v/v)壓積SRBC0.2mL致敏。免疫5d后，將小鼠頸椎脫臼處死。取出脾臟，制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行溶血空斑試驗(yàn)。計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)，用空斑數(shù)/106脾細(xì)胞來表示抗體生成細(xì)胞數(shù)。
表3植物酵素對(duì)小鼠脾抗體生成細(xì)胞量的影響(n＝10)
由表3可知，與對(duì)照組比較，各劑量組空斑數(shù)均高于對(duì)照組，且隨劑量增加而增加，其中高、中劑量組空斑數(shù)與對(duì)照組值相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。這表明本發(fā)明物具有增強(qiáng)小鼠脾抗體生成細(xì)胞的能力，即具有增強(qiáng)小鼠體液免疫功能的作用。
2.4血清溶血素的測定
按規(guī)定劑量給各組試驗(yàn)小鼠連續(xù)灌胃30d后，每只小鼠腹腔注射5％雞紅細(xì)胞懸液0.2mL進(jìn)行免疫，免疫7天后，內(nèi)眥靜脈叢取血，室溫下放置1小時(shí)，用長針將凝固血與管壁分離，以2000r/min離心10min。取血清用生理鹽水稀釋100倍，取稀釋血清1mL，與5％雞紅細(xì)胞懸液0.5mL，10％補(bǔ)體(豚鼠血清，用生理鹽水配成10％)0.5mL混合，37℃保溫30min，0℃終止反應(yīng)。離心后，取上清液用分光光度計(jì)于540nm處比色，記錄光密度值。
表4植物酵素對(duì)小鼠血清溶血素生成的影響(n＝10)
由表4可見，與對(duì)照組相比，本發(fā)明各劑量組在小鼠血清溶血素生成的影響上均略高于對(duì)照組，但均無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。說明本發(fā)明物對(duì)小鼠血清溶血素的生成無顯著影響。
2.5小鼠碳廓清試驗(yàn)
按規(guī)定劑量給各組試驗(yàn)小鼠連續(xù)灌胃30d后，從小鼠的尾靜脈按0.1mL/10g量注射濃度為20％的墨汁，間隔2min、15min后，分別從小鼠內(nèi)眥靜脈叢取血20μL，加入到2mL的1％的Na2CO3溶液中。用光度計(jì)在600nm波長處分別測定值OD值，以Na2CO3溶液作空白對(duì)照。然后頸椎脫臼處死小鼠，取出肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面的血污，稱重。將測出的OD值、肝臟和脾臟重量代入公式，算出吞噬指數(shù)(以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力)。
表5植物酵素對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞碳廓清能力的影響(n＝10)
由表5可見，與對(duì)照組比較，本發(fā)明高、中、低劑量組對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞碳廓清能力的吞噬指數(shù)均具有明顯的升高作用(P＜0.05)。這說明本發(fā)明物具有促進(jìn)小鼠噬細(xì)胞的吞噬作用，可增強(qiáng)其非特異性免疫功能。
2.6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)
按規(guī)定劑量給各組試驗(yàn)小鼠連續(xù)灌胃30d后，向每只小鼠腹腔注射雞紅細(xì)胞懸液，激活小鼠巨噬細(xì)胞。4d后，頸椎脫臼法處死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank's液4mL/只，吸取腹腔洗液與等量的1％雞紅細(xì)胞混勻。吸取0.5mL混合液，加入玻片的瓊脂圈內(nèi)，放置孵箱內(nèi)37℃孵育20分鐘。孵育結(jié)束后用生理鹽水將未貼壁細(xì)胞沖掉，于甲醇液中固定1分鐘，Giemsa液染色15分鐘。用40X顯微鏡計(jì)數(shù)吞噬率和吞噬指數(shù)(吞噬率為每100個(gè)巨噬細(xì)胞中，吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞所占的百分率；吞噬指數(shù)為平均每個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的個(gè)數(shù))，并據(jù)此判定巨噬細(xì)胞的吞噬能力。
吞噬百分率＝(吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬細(xì)胞數(shù)÷計(jì)數(shù)的吞噬細(xì)胞數(shù))×100
吞噬指數(shù)＝被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)÷計(jì)數(shù)的吞噬細(xì)胞數(shù)
表6植物酵素對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞指數(shù)的影響(n＝10)
由表6可知，與對(duì)照組比較，本發(fā)明高、中、低劑量對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率與吞噬指數(shù)均具有明顯的升高作用(P＜0.05)。說明本發(fā)明物具有促進(jìn)小鼠噬細(xì)胞的吞噬作用，可增強(qiáng)其非特異性免疫功能。
2.7NK細(xì)胞活性測定試驗(yàn)。
按規(guī)定劑量給各組試驗(yàn)小鼠連續(xù)灌胃30d后，無菌取脾，制成單個(gè)細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為2×107/mL)，作為效應(yīng)細(xì)胞。取靶細(xì)胞(YAC-1細(xì)胞)和效應(yīng)細(xì)胞各100μL(效靶比50:1)，加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中；靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞2.5％Triton各100μL；上述各項(xiàng)均設(shè)三個(gè)重復(fù)孔，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培養(yǎng)箱中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)夜100μL，反應(yīng)3min，每孔加入1mol/L的HCl 30μL，在酶標(biāo)儀490nm處測定光密度值(OD)，按下列公式計(jì)算：
NK細(xì)胞活性％＝[(反應(yīng)空OD值-自然釋放空OD值)/(最大釋放空OD-自然釋放空OD值)]100％
表7植物酵素對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響(n＝10)
由表7可見，與對(duì)照組比較，各劑量組NK細(xì)胞活性值均高于對(duì)照組，且隨劑量增加而增加，其中高、中劑量組NK細(xì)胞活性值與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或P＜0.01)，這表明本發(fā)明物具有增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞活性的作用。
3、結(jié)論
根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范實(shí)施手冊(cè)》(2003版)中的有關(guān)增強(qiáng)免疫力試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)本發(fā)明的植物酵素具有促進(jìn)細(xì)胞免疫的功能的作用(小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)與遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性)；(2)本發(fā)明的植物酵素具有促進(jìn)體液免疫的功能的作用(抗體生成細(xì)胞檢測試驗(yàn)結(jié)果陽性)；(3)本發(fā)明的植物酵素具有促進(jìn)單核—巨噬細(xì)胞功能的作用(小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果均陽性)；(4)本發(fā)明的植物酵素具有促進(jìn)NK細(xì)胞活性的作用。因此，這表明本發(fā)明的植物酵素具有增強(qiáng)動(dòng)物免疫力的作用。
盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。