本發(fā)明涉及一種半乳甘露聚糖改性蛋白微膠囊壁材的制備方法及其應用，屬于食品添加劑微膠囊技術領域。

背景技術：

辣椒紅色素是一種從辣椒中提取出來的天然色素，主要成分是辣椒紅素和辣椒玉紅素。由于其良好的著色性，色彩鮮艷，廣泛用于各種食品添加。辣椒紅色素不會對人體造成副作用，并且具有營養(yǎng)保健、防輻射等特殊功效，已經被美國faq、英國、who及中國認定為無限制使用的天然食品添加劑，在醫(yī)藥、食品、化妝品、飼料等行業(yè)廣泛應用。

但是辣椒紅色素是一種油溶性的物質，不溶于水，在食品加工過程中較難與其他物質均勻混合。在高溫、強光照、cu2+、fe2+等條件下，辣椒紅色素也不如其他人工色素穩(wěn)定性好。而微膠囊技術是把少量物質包裹在聚合物薄膜中的技術，現在微膠囊技術已經廣泛應用于藥物、食品研發(fā)中。微膠囊技術有著極大的優(yōu)越性：一、微膠囊技術可以改變芯材的狀態(tài)，將液體的芯材粉末化，便于儲存和運輸；二、有效地降低外界環(huán)境對芯材的影響，延長芯材的活性，維持芯材的穩(wěn)定性，延長產品架貨期；三、可以根據實際的需求，人為地釋放芯材。由于微膠囊技術的這些優(yōu)點，已使之成為21世紀重點研發(fā)的新興技術，特別是香精香料和油溶性物質研究最為廣泛。通過微膠囊技術可以將液體狀的辣椒紅色素變成水溶性的粉末，大大提高辣椒紅色素的應用范圍。

應用美拉德反應，不添加任何化學試劑，在控制的條件下，使蛋白質的分子中氨基酸側鏈的自由氨基與多糖的還原性羰基末端反應得到共價復合物。從現在已知的文獻來看，蛋白質和多糖進行美拉德反應主要有兩種方法，濕法接枝和干法接枝。kato首次提出了用干法制備蛋白－多糖復合物，發(fā)現其產物具有更好的乳化性及乳化穩(wěn)定性。本發(fā)明是使用酪蛋白、大豆分離蛋白分別與半乳甘露聚糖進行美拉德反應，以提高酪蛋白和大豆分離蛋白的溶解性、乳化活性及乳化穩(wěn)定性。酪蛋白自身很容易在水中形成膠束，這是因為酪蛋白自身的疏水性，所以，在酪蛋白上接枝多糖是很有必要的，這樣可以增加它的親水性，并形成前述的聚電解質絡合物膠束的殼。大豆分離蛋白本身就具有一定的乳化性，但是為了提高它的溶解性，所以接枝多糖是一個很好的選擇。

并以半乳甘露聚糖與酪蛋白和大豆分離蛋白進行美拉德反應后的產物，通過噴霧干燥來包埋辣椒紅色素，制成辣椒紅色素微膠囊。這種微膠囊粉末不僅方便運輸儲存，而且能夠讓不溶于水的辣椒紅色素能夠溶于水中，使其在食品應用中能夠更好地與其他基材混合在一起，到更好的著色效果。而且辣椒紅色素微膠囊能夠避免辣椒紅色素被外界的光熱所破壞，保持辣椒紅色素的活性。并且整個過程條件溫和，且使用的壁材都是安全可食用的材料，沒有造成化學污染，可達到讓消費者更加放心、高效使用辣椒紅色素的目的。

技術實現要素：

本發(fā)明提供了一種半乳甘露聚糖改性蛋白微膠囊壁材的制備方法及其應用具體設計以酪蛋白、大豆分離蛋白與半乳甘露聚糖為原料，采用干法美拉德反應，將酪蛋白、大豆分離蛋白與半乳甘露聚糖進行接枝反應，在將蛋白多糖共聚物通過噴霧干燥技術包埋辣椒紅素，可更廣泛的應用于食品藥品領域。

本發(fā)明采用的技術方案如下：一種半乳甘露聚糖改性蛋白的制備方法，包括下述步驟：

半乳甘露聚糖改性蛋白的制備：將酪蛋白/大豆分離蛋白與半乳甘露聚糖以一定的質量比溶于0.2mol/l的磷酸緩沖溶液中。置于磁力攪拌上，不斷攪拌直至溶解(或呈現均勻狀態(tài))。冷凍干燥48h。將冷凍干燥后的樣品磨細，得到干粉。取適量干粉，置于裝有飽和溴化鉀溶液的干燥器內放入真空恒溫干燥箱中反應22-26小時，溫度為45-75℃。

步驟中大豆分離蛋白與半乳甘露聚糖的摩爾比1-2:1，優(yōu)選為1:2，酪蛋白與半乳甘露聚糖的摩爾比3-1：1-3，優(yōu)選1:1。

步驟中磷酸鹽緩沖液的ph為3-11，大豆分離蛋白改性優(yōu)選為7，酪蛋白改性優(yōu)選為8，制備成蛋白均勻溶液的濃度為1％。

步驟中反應容器中的相對濕度為40％-80％，優(yōu)選為79％。

半乳甘露聚糖改性蛋白的制備方法可以用于食品添加劑膠囊化中。

半乳甘露聚糖改性蛋白的制備方法在辣椒紅素膠囊化中的應用，包括下述步驟：

(1)半乳甘露聚糖改性蛋白的制備：將酪蛋白/大豆分離蛋白與半乳甘露聚糖以一定的質量比溶于0.2mol/l的磷酸緩沖溶液中。置于磁力攪拌上，不斷攪拌直至溶解(或呈現均勻狀態(tài))。冷凍干燥48h。將冷凍干燥后的樣品磨細，得到干粉。取適量干粉，置于裝有飽和溴化鉀溶液的干燥器內放入真空恒溫干燥箱中反應22-26小時，溫度為45-75℃。

(2)將制備好的美拉德反應產物溶于蒸餾水中，充分攪拌，使其溶解20min；在辣椒紅色素中加入少量單硬脂酸甘油酯，充分混合。將壁材溶液倒入芯材溶液中，攪拌均勻，形成最初的乳狀液。乳狀液中，壁材/芯材為1:1，總固體濃度為4％(w/v)。將初乳液在10000r/min下剪切10min，形成均勻地乳狀液，再將乳狀液進行噴霧干燥，最后在噴霧干燥的收集瓶中收集粉末即為辣椒紅色素微膠囊。

本發(fā)明的有益效果：通過美拉德反應在酪蛋白和大豆分離蛋白上接枝上半乳甘露聚糖，得到一種性能更加優(yōu)良的微膠囊壁材。采用的噴霧干燥技術，可將辣椒紅色素包裹在一個封閉的環(huán)境中，能夠有效的延長產品的架貨期并可以更加放心地應用于食品藥品領域。半乳甘露聚糖本身具有較好的乳化性能，與蛋白反應后可以明顯提高蛋白的乳化性。并且半乳甘露聚糖是一種天然的多糖，具有很多種生理功能，這樣的多糖應用在食品中可以增加食品的營養(yǎng)價值和保健功能。所以用半乳甘露聚糖與酪蛋白和大豆分離蛋白進行美拉德反應得到的壁材具有廣闊的研究價值。

附圖說明

圖1是緩沖溶液的ph值對接枝度的影響，a.大豆分離蛋白，b.酪蛋白；

圖2是底物配比對接枝度的影響，a.大豆分離蛋白，b.酪蛋白；

圖3是蛋白濃度對接枝度的影響，a.大豆分離蛋白，b.酪蛋白；

圖4是反應時間對接枝度的影響及褐變程度的測定；a.大豆分離蛋白的接枝度與時間的關系，b.酪蛋白的接枝度與時間的關系，c.大豆分離蛋白的褐變程度與時間的關系，d.酪蛋白的褐變程度與時間的關系。

圖5是不同反應時間共聚物與蛋白的溶解度變化；

圖6是接枝物以及原料的紅外譜圖分析；

圖7是大豆分離蛋白和酪蛋白及其接枝物的熱重分析；

圖8是zeta電位隨溶液ph的變化情況；

圖9是壁材/芯材比例與包埋率的關系，a是大豆分離蛋白，b是酪蛋白；

圖10是進風溫度對包埋率的影響，a是大豆分離蛋白，b是酪蛋白；

圖11是辣椒紅色素微膠囊的熱重分析情況。

具體實施方法

實施例1

本實施例中蛋白-多糖美拉德反應，半乳甘露聚糖改性蛋白的制備包括以下步驟：

將酪蛋白/大豆分離蛋白與半乳甘露聚糖以一定的質量比(1:2)溶于0.2mol/lph＝7的磷酸緩沖溶液中。置于磁力攪拌上，不斷攪拌直至溶解(或呈現均勻狀態(tài))，蛋白的終濃度為1％。冷凍干燥48h。將冷凍干燥后的樣品磨細，得到干粉。取適量干粉，置于裝有飽和溴化鉀溶液(相對濕度為79％)的干燥器內放入真空恒溫干燥箱中反應24h，溫度為60℃。

實施例2

本實施例中辣椒紅色素微膠囊的制備方法，包括以下步驟：

(1)將酪蛋白/大豆分離蛋白與半乳甘露聚糖以一定的質量比(1:2)溶于0.2mol/lph＝7的磷酸緩沖溶液中。置于磁力攪拌上，不斷攪拌直至溶解(或呈現均勻狀態(tài))，蛋白的終濃度為1％。冷凍干燥48h。將冷凍干燥后的樣品磨細，得到干粉。取適量干粉，置于裝有飽和溴化鉀溶液(相對濕度為79％)的干燥器內放入真空恒溫干燥箱中反應24h，溫度為60℃。

(2)將制備好的美拉德反應產物溶于蒸餾水中，充分攪拌，使其溶解20min；在辣椒紅色素中加入少量單硬脂酸甘油酯，充分混合。將壁材溶液倒入芯材溶液中，攪拌均勻，形成最初的乳狀液。乳狀液中，壁材/芯材為1:1，總固體濃度為4％(w/v)。將初乳液在10000r/min下剪切10min，形成均勻地乳狀液，再將乳狀液進行噴霧干燥，最后在噴霧干燥的收集瓶中收集粉末即為辣椒紅色素微膠囊。

1.蛋白-多糖干熱改性中的影響因素

1.1緩沖溶液的ph值對接枝度的影響

反應溫度控制在60℃，大豆分離蛋白與半乳甘露聚糖的摩爾比為1:2，酪蛋白與半乳甘露聚糖的摩爾比為1:1，反應時間24h，相對濕度均為79％。緩沖溶液ph對接枝度的影響如圖1所示

1.2底物配比對接枝度的影響

反應溫度控制在60℃，大豆分離蛋白與半乳甘露聚糖的ph值為7，酪蛋白與半乳甘露聚糖的ph值為8，反應時間24h，相對濕度均為79％。底物配比對接枝度的影響如圖2所示

1.3蛋白濃度對接枝度的影響

選取不同蛋白濃度(0.2％，0.4％，0.6％，0.8％，1.0％，1.2％，1.4％)的反應產物，檢測其接枝度，結果如圖3所示。

1.4反應溫度對接枝度的影響

選取不同溫度(45℃,60℃,75℃)的產物檢測其接枝度及褐變程度，結果如下表1。

表1.反應溫度與接枝度的關系

1.5相對濕度對接枝度的影響

通過不同飽和鹽溶液來控制不同的相對濕度，將蛋白多糖混合物分別置于不同相對濕度(40％，65％，79％)干燥器中，反應溫度控制在60℃，反應時間均控制在24h；大豆分離蛋白與半乳甘露聚糖配比1:2，ph值為7；酪蛋白與半乳甘露聚糖配比為1:1，ph值為8.相對濕度對接枝度的影響如表2所示

表2.相對濕度與接枝度的關系

1.6反應時間對接枝度的影響及褐變程度的測定

選取不同時間(6℃，12℃，18℃，24℃，30℃，36℃，48℃)的產物檢測其接枝度及褐變程度，結果如圖4。

有圖1-4及表1-2可以得出，半乳甘露聚糖改性蛋白的最佳制備條件，最佳條件見表3。

表3.半乳甘露聚糖改性蛋白的最佳制備條件

2.半乳甘露聚糖改性蛋白的表征

2.1美拉德反應產物溶解性分析

準確稱取一定量不同反應時間(0h、6h、12h、24h、36h、48h)的美拉德反應產物溶解在蒸餾水中，在室溫中攪拌1h，10000r/min離心10min，取上層清夜，用考馬斯亮藍法測定上清液中的蛋白含量，標準曲線為y＝0.580x+0.01930。以蛋白質在相對濕度為79％，溫度為60℃的反應器中反應0h、6h、12h、24h、36h、48h作為對比組。美拉德反應共聚物與單獨單筆在不同反應時間溶解度的變化結果如圖5。

2.2反應產物紅外光譜分析

采用kbr壓片法進行紅外測定。取少量樣品與kbr混合后在研缽中充分研磨后，壓成薄片，在紅外光譜儀上進行紅外光譜測定，測定分辨率為4cm-1，波數4000cm-1～400cm-1，掃描次數為32次。美拉德反應共聚物和單糖、單蛋白的紅外光譜分析情況，如圖6所示。

2.3大豆分離蛋白和酪蛋白及其接枝物相關的熱重分析

取適量美拉德反應產物及母體蛋白、半乳甘露聚糖，利用同步熱分析儀進行熱重分析。分析條件：起止溫度：25℃-600℃，升溫程序：20℃/min。載氣：n2；載氣流量：20ml/min。大豆分離蛋白和酪蛋白及其接枝物相關的熱重分析情況，如圖7所示。

2.4zeta電位隨溶液ph的變化情況

共聚物和蛋白的zeta電位隨溶液ph的變化情況，如圖8所示。

3辣椒紅色素微膠囊的制備

3.1噴霧干燥法制備辣椒紅色素微膠囊

將制備好的美拉德反應產物溶于蒸餾水中，充分攪拌，使其溶解20min；在辣椒紅色素中加入少量單硬脂酸甘油酯，充分混合。將壁材溶液倒入芯材溶液中，攪拌均勻，形成最初的乳狀液。乳狀液中，壁材/芯材為1:1，總固體濃度為4％(w/v)。將初乳液在10000r/min下剪切10min，形成均勻地乳狀液，再將乳狀液進行噴霧干燥，最后在噴霧干燥的收集瓶中收集粉末即為辣椒紅色素微膠囊。

3.2步驟

3.2.1辣椒紅色素標準曲線的繪制

稱取0.100g的辣椒紅色素，溶在正己烷溶液中，定容到100ml，取10.0ml定容到100ml，得到濃度為0.1mg/ml的辣椒紅色素標準溶液。

辣椒紅色素標準曲線的繪制

分別取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml的標準溶液于6支比色管中，用正己烷定容到10.0ml。以正己烷為空白，測定以上6個樣品吸光度，色素含量為橫坐標，樣品吸光度為縱坐標制成辣椒紅色素的標準曲線。標準曲線為y＝0.05550x-0.0054。

3.2.2辣椒紅色素微膠囊中辣椒紅色素的含量測定

稱取0.20g左右的樣品，溶于正己烷中，直至正己烷顏色不再加深。以正己烷為空白，測定樣品的吸光度，在標準曲線中讀取辣椒中色素的含量。計算公式如下：

含量(g/g)＝c×10-3×k/m

式中：c為溶液中辣椒紅色素的含量，k為稀釋倍數，m為樣品總質量。

3.2.3壁材與芯材比例對包埋率的影響

選用不同的壁材/芯材比例(0.5:1，1:1，2:1)通過噴霧干燥包埋辣椒紅色素，測定包埋后辣椒紅色素微膠囊中的辣椒紅色素含量，計算其包埋率與壁材/芯材比例之間的關系。壁材/芯材比例與包埋率的關系如圖9所示

從圖中可以看出，在一定程度上增加壁材的用量可以提高包埋率，這是因為壁材含量的增加可以促進在包埋過程中壁材的成膜速率，加快對芯材的包裹，增加膜的厚度，防止膜破裂，減少芯材在包埋過程中的流失。但是當壁材的含量超過一定比例后，反而會降低包埋率，這是因為壁材過多，導致微膠囊的霧化速率下降，延長時間，導致膜破裂，芯材因而流失。所以選擇壁材/芯材比例為1:1較為合適。

3.2.4進風溫度對包埋率的影響

噴霧干燥的進風溫度對包埋效果有很大的影響，增大進風溫度可以提高包埋速率，一定程度上可以提高包埋率。但是溫度過高會使微膠囊在形成過程中破裂，這是因為溫度過高，干燥速率過快，水分流失較快，微膠囊表面穩(wěn)定的玻璃態(tài)結構遭到破壞。但是溫度過低，會使微膠囊干燥不完全，水分含量大，儲存時間減少。而且，辣椒紅色素長時間在高溫環(huán)境下也會變性。從圖10可以看出在170℃和180℃下，包埋率相差不大，所以最適宜的進風溫度為170℃。

3.2.5辣椒紅色素微膠囊的熱重分析

取適量微膠囊粉末，利用同步熱分析儀進行熱重分析。分析條件：升溫程序：20℃/min，起止溫度：25℃-600℃。載氣：n2；載氣流量：20ml/min。圖11是辣椒紅色素微膠囊的熱重分析圖，本課題使用到的辣椒紅色素是辣椒紅色素溶于大豆油的產品，成分比較復雜，所以較難分析加熱分解成何物。從圖11a中也可以看出，大豆分離蛋白接枝物制備的辣椒紅色素微膠囊的熱穩(wěn)定性更好。從圖11b中可以看出，酪蛋白接枝物制備的辣椒紅色素微膠囊的熱穩(wěn)定性更好，在240℃以后才開始分解。