本發(fā)明涉及一種海洋生物活性物質(zhì)的用途，具體涉及一種北太平洋魷魚纏卵腺抗氧化酶解寡肽的用途。

背景技術(shù)：

機體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物如超氧化物陰離子（o^2-）、h2o2、過氧化自由基（roo）和羥自由基（-oh）具有很強的氧化作用。正常生理情況下，體內(nèi)的抗氧化酶及非酶類因子可以將自由基有效地清除，從而維持自由基的平衡狀態(tài)。但在病理情況下，能迅速引起脂質(zhì)的過氧化造成細胞膜、dna和蛋白活性的損傷，從而導致多種人類疾病相關(guān)。因此，對體內(nèi)自由基的清除是防御機體疾病發(fā)生的一個重要途徑。由于合成的抗氧化劑多數(shù)存在安全隱患，因此，篩選高效、低毒抗氧化劑已成為生物學、醫(yī)學和食品科學研究的新趨勢。已有研究表明，來源于多種蛋白的活性肽都具有抗氧化活性，酶解方法是從蛋白中獲得生物活性肽的有效方法之一，作為一種提高蛋白質(zhì)活性功能和營養(yǎng)價值的方法已被廣泛應用。飲食當中的蛋白質(zhì)在腸道中主要以多肽和氨基酸的形式被吸收，多肽在機體抗氧化過程中起著重要的作用。近年來對海洋生物活性肽，特別是抗氧化活性肽的研究取得了很大進展。但海洋活性肽尚未形成規(guī)模產(chǎn)業(yè)，因此，借鑒陸地活性肽開發(fā)的酶工程技術(shù)，以海洋生物蛋白資源為原料，通過對酶解、制備等工藝的綜合研究，即可研制出陸地蛋白源和化學合成所無法生產(chǎn)的系列天然、高效、新穎的生物活性肽。

魷魚是世界上重要的海洋頭足類動物，其生長周期短、繁殖能力強和資源恢復迅速，是一種可持續(xù)的海洋漁業(yè)資源。近年來，隨著國內(nèi)外深海捕撈技術(shù)的發(fā)展，魷魚已成為我國主要的海洋捕撈和水產(chǎn)加工品種。目前，我國每年魷魚加工量高達40~50萬t，居世界第一位，加工品種主要為北太平洋魷魚、阿根廷魷魚和秘魯魷魚。魷魚因其肉質(zhì)細膩營養(yǎng)，風味鮮美，具有高蛋白低脂肪、富含人體所需的多種必須氨基酸，備受消費者青睞。在魷魚的加工過程中一般對其胴體進行加工，產(chǎn)生50％左右的內(nèi)臟等副產(chǎn)物，其中生殖腺（纏卵腺、精巢、卵巢等）占內(nèi)臟的20％，這些內(nèi)臟等副產(chǎn)物通常被加工成飼料，作為魚的誘餌；魷魚肝臟被提取魷魚油后掩埋；而得到的魷魚纏卵腺通常只作烹飪食用，生物附加值低并且未及時處理會對環(huán)境造成一定的污染。關(guān)于魷魚纏卵腺酶解多肽的提取目前尚未見報導。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有抗氧化功效的北太平洋魷魚纏卵腺抗氧化酶解寡肽。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為：

一種北太平洋魷魚纏卵腺抗氧化酶解寡肽的用途，該酶解寡肽的氨基酸序列為ala-tyr-ala-ser-ser，分子質(zhì)量為497.50da，即該酶解寡肽的分子結(jié)構(gòu)式為：

，

酶解寡肽用于制備抗氧化保健食品或食品添加劑的用途。含有該北太平洋魷魚纏卵腺抗氧化酶解寡肽0.01-0.5份、淫羊藿1-3份、黃芪1-5份、桑寄生1-10份、丹參10-20份、萊菔子1-10份、當歸1-10份、葛根3-20份的制劑，用于食品添加劑的用途。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種北太平洋魷魚纏卵腺抗氧化酶解寡肽的用途。同時，本發(fā)明所制備的北太平洋魷魚纏卵腺抗氧化酶解寡肽是天然原料經(jīng)酶解制得，安全、無毒副作用，抗氧化活性顯著，北太平洋魷魚纏卵腺抗氧化酶解寡肽可以作為抗氧化藥品、功能食品進行進一步研發(fā)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1抗氧化酶解寡肽氨基酸分子結(jié)構(gòu)式；

圖2為本發(fā)明實施例1超濾組分3-5kd分子段在280nm處的吸光度（吸光度-管數(shù)）；

圖3為本發(fā)明圖2中不同峰的dpph清除率；

圖4為本發(fā)明實施例1酶解多肽不同分子段的超氧陰離子清除率；

圖5為本發(fā)明實施例1酶解多肽不同分子段對dpph的清除率；

圖6為本發(fā)明實施例1酶解多肽不同分子段的還原能力；

圖7為本發(fā)明實施例1酶解多肽不同分子段的羥自由基清除率；

圖8為本發(fā)明實施例1峰ⅰ在280nm處高效液相色譜圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。

實施例1：

一種北太平洋魷魚纏卵腺抗氧化酶解寡肽，該酶解寡肽的分子結(jié)構(gòu)為：

，

即該酶解寡肽的氨基酸序列為ala-tyr-ala-ser-ser,分子質(zhì)量為497.50da。

北太平洋魷魚纏卵腺抗氧化酶解寡肽的制備方法，具有如下步驟：

1）取北太平洋魷魚纏卵腺搗碎勻漿，以活性酶在最適酶解溫度及ph值條件下，加蛋白酶、保溫進行酶解；然后滅活，在0~4^oc、6000~12000r/min的條件下離心，取上清；

2）取上清液，超濾截留分子量為3-5kd分子段的超濾組分待用；

3）取所述的超濾組分進行瓊脂糖凝膠層析分離，收集280nm處出現(xiàn)三個峰中的第一個峰的組分；

4）取所述的第一個峰的組分過hplc進一步分離得到北太平洋魷魚纏卵腺抗氧化酶解寡肽，其分子結(jié)構(gòu)為：

。

上述活性酶為堿性蛋白酶，優(yōu)選的，酶解溫度位于40～50℃之間、水解時間在5～7h之間、ph在8.0～10.0之間、加酶量位于2500～3500u/g、料液比位于1：3～1：5。

優(yōu)選的酶解的條件為：溫度50℃、酶解時間7h、加酶量3500u/g、ph值9.0、料液比為1：6為最佳酶解條件

步驟3）所述的洗脫的條件為：柱尺寸：10×300-310mm；柱料：瓊脂糖；柱料顆粒大小：10±2μm；上樣量：500μl；流動相：超純水；洗脫液流速：0.5ml/min；檢測波長：280nm；自動收集體積：3.2ml/管。

一種北太平洋魷魚纏卵腺抗氧化酶解寡肽的用途，該酶解寡肽的氨基酸序列為ala-tyr-ala-ser-ser，分子質(zhì)量為497.50da，即該酶解寡肽的分子結(jié)構(gòu)式為：

，

酶解寡肽用于制備抗氧化保健食品或食品添加劑的用途。含有該北太平洋魷魚纏卵腺抗氧化酶解寡肽0.01-0.5份、淫羊藿1-3份、黃芪1-5份、桑寄生1-10份、丹參10-20份、萊菔子1-10份、當歸1-10份、葛根3-20份的制劑，用于食品添加劑的用途。

實施例2：

材料與方法

供試材料

北太平洋魷魚纏卵腺購置于本地水產(chǎn)企業(yè)；堿性蛋白酶購置于亞太恒信生物科技（北京）有限公司；dpph購置于西亞試劑；菲洛嗪、鄰二氮菲、三氯化鐵、磷酸氫二鈉購置于阿拉丁試劑公司；其余試劑均為分析純，購置于國藥集團化學試劑有限公司。

主要儀器

ssw-420-2s恒溫水浴鍋，上海民儀電子有限公司；bsa124s型電子天平，德國sartoriusag公司；ds-1組織搗碎機，上海標本模型廠；phs-250ph計，上海理達儀器廠；cf16rxⅱ型高速低溫離心機，日本日立公司；direct-q5uv-r型超純水系統(tǒng)，美國millipore公司；cogentuscale型超濾系統(tǒng)，美國millipore公司；alpha1-4/ldplus型冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；紫外分光光度計（752fc），上海光譜儀器有限公司；agilent-1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

方法

單因素實驗

選用堿性蛋白酶進行酶解試驗，考慮酶解溫度、酶解時間、加酶量、溶液ph和料液比。水解工藝如下:

魷魚纏卵腺搗碎→勻漿→1mol/l氫氧化鈉調(diào)ph值→保溫→加酶后水解→滅酶(90℃加熱15min)→離心(10000r/min、15min)→上清液定容→氨基氮含量(aan)測定。

當溫度位于40～50℃之間、水解時間在5～7h之間、ph在8.0～10.0之間、加酶量位于2500～3500u/g、料液比位于1：3～1：5時水解效果較好，得到的游離ann量最多，水解程度越高。然而，溫度50℃、酶解時間7h、加酶量3500u/g、ph值9.0、料液比為1：6為最佳酶解條件。

sephadexg-25分離純化結(jié)果

取3-5kd分子段凍干樣品進行瓊脂糖凝膠sephadexg-25層析，于280nm處出現(xiàn)三個峰，即峰ⅰ、峰ⅱ和峰ⅲ，分別收集三個峰組分經(jīng)冷凍干燥后檢測其對dpph清除率，得出峰ⅰ有較好的清除能力，見圖3，取峰ⅰ分子段進行hplc的純化。

hplc分離、純度檢測及目標肽序列測定結(jié)果

峰ⅰ經(jīng)hplc色譜柱制備結(jié)果如圖8所示，保留時間約為18min時，出現(xiàn)單一峰，峰高為161.2，經(jīng)氨基酸序列儀n端序列檢測，其氨基酸序列為ala-tyr-ala-ser-ser（ayass），相對分子質(zhì)量為497.50da，其結(jié)構(gòu)式如下：

經(jīng)瓊脂糖凝膠g-25層析后，得出三個峰，根據(jù)對dpph清除率的測定，得出峰ⅰ效果明顯確，對dpph的清除率達61.8%，后經(jīng)hplc分離純化并經(jīng)氨基酸序列儀n端序列檢測，得到目標肽的氨基酸序列為ala-tyr-ala-ser-ser。北太平洋魷魚纏卵腺通過酶解可獲得抗氧化活性較好的寡肽，可開發(fā)魷魚副產(chǎn)品的精深加工,提高生物附加值具有重要的意義。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。

sequencelisting

<110>浙江海洋大學

<120>一種北太平洋魷魚纏卵腺抗氧化酶解寡肽的用途

<130>zjou-yzs-20161203

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>5

<212>prt

<213>人工合成

<400>1

alatyralaserser

15