本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用和飼料發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及一種由產(chǎn)朊假絲酵母菌和植物乳桿菌組成的飼料發(fā)酵劑及在飼料原料發(fā)酵上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
飼料原料經(jīng)微生物發(fā)酵后，原料中的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等大分子物質(zhì)被微生物酶水解為氨基酸、脂肪酸、糖等小分子物質(zhì)，提高了產(chǎn)品的營養(yǎng)價值和消化性能；而原料中難消化的脹氣性寡糖和抗?fàn)I養(yǎng)因子可被發(fā)酵除去或降低。因此，發(fā)酵飼料具有適口性好、營養(yǎng)價值高、安全、無污染等特點(diǎn)。飼喂發(fā)酵飼料不僅能提高飼料的消化利用率、促進(jìn)養(yǎng)殖生物生長，還能降低排泄物中氮、磷含量，減少對環(huán)境的污染。發(fā)酵飼料中的有益微生物還能調(diào)節(jié)養(yǎng)殖生物腸道菌群，維持腸道微生態(tài)平衡，提高動物免疫力、減少疾病發(fā)生，降低死亡率，可減少或避免抗生素的使用，提高產(chǎn)品品質(zhì)，利于綠色健康生態(tài)養(yǎng)殖的發(fā)展。
發(fā)酵飼料在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用已經(jīng)比較成熟，而在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用則處于起步階段。酵母菌和乳酸菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用作水質(zhì)調(diào)節(jié)劑，也有用作拌料飼喂的研究報道，未見用于飼料或飼料原料發(fā)酵的研究報道。產(chǎn)朊假絲酵母和植物乳桿菌是飼料添加劑中允許添加的微生物菌種，產(chǎn)朊假絲酵母的菌體蛋白高、代謝產(chǎn)物豐富，有氨基酸、有機(jī)酸、肽等，常被用作畜禽飼料蛋白，在水產(chǎn)上可替代部分魚粉。植物乳桿菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸、乙酸、 丙酸和細(xì)菌素等多種物質(zhì)，這些物質(zhì)除具有殺毒抑菌作用外，還具有調(diào)節(jié)腸道菌群、促進(jìn)消化吸收等功能，常用于牛奶等奶制品及飼料發(fā)酵當(dāng)中。本發(fā)明將產(chǎn)朊假絲酵母和植物乳桿菌混合制備一種飼料發(fā)酵劑，并將其用于飼料原料的發(fā)酵，以提高飼料的適口性和營養(yǎng)價值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明公開了一種由產(chǎn)朊假絲酵母和植物乳桿菌及其發(fā)酵產(chǎn)物組成的飼料發(fā)酵劑。該飼料發(fā)酵劑由產(chǎn)朊假絲酵母和植物乳桿菌的發(fā)酵液等比例混合而成；所述的產(chǎn)朊假絲酵母保藏號：CGMCC2.281；植物桿菌保藏號：CGMCC1.511，產(chǎn)朊假絲酵母菌的濃度達(dá)到3.0×108-5.0×108CFU/mL，植物乳桿菌濃度達(dá)到1.0×109-5.0×109CFU/mL。
本發(fā)明進(jìn)一步公開了由產(chǎn)朊假絲酵母和植物乳桿菌及其發(fā)酵產(chǎn)物組成的飼料發(fā)酵劑按以下步驟進(jìn)行：
（1）產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵：將處于對數(shù)生長期的產(chǎn)朊假絲酵母菌菌種按5%接種量接種到滅菌YPD液體培養(yǎng)中，25-28℃振蕩培養(yǎng)20-24h。
（2）植物乳酸菌發(fā)酵：將處于對數(shù)生長期的植物乳桿菌菌種按10%接種量接種到裝有90%MRS滅菌培養(yǎng)基的玻璃輸液瓶中，30-34℃靜置培養(yǎng)24-30h。
（3）混合發(fā)酵劑：將發(fā)酵好的產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵液和植物乳桿菌發(fā)酵液按體積比1:1混合得到飼料發(fā)酵劑。
本發(fā)明更進(jìn)一步公開了飼料發(fā)酵劑在飼料原料發(fā)酵中的應(yīng)用，它是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
（1）飼料原料有以下組合： a）豆粕、葡萄糖1.0％、K2HPO40.2%，b）花生粕、葡萄糖1.0％、K2HPO40.2%，c)豆粕20%、麩皮80%、葡萄糖1.0％、K2HPO40.2%，d）豆粕20%、豆皮80%、葡萄糖1.0％、K2HPO40.2%，e）全價料、葡萄糖1.0％、K2HPO40.2%。
（2）上述原料的料水比為7:3，接菌量5%，接種混勻后置于密閉容器中室溫（20-30℃）發(fā)酵，發(fā)酵2d后取樣，測pH、乳酸菌、酵母菌含量。
（3）將發(fā)酵好的物料即為微生物發(fā)酵飼料，可直接投喂，也可風(fēng)干裝入袋中。
本發(fā)明更進(jìn)一步公開了采用飼料發(fā)酵劑制備的微生物發(fā)酵飼料在調(diào)節(jié)魚蝦腸道微生物菌群方面的應(yīng)用。特別是在降低細(xì)菌總數(shù)、弧菌總數(shù)和弧菌有害菌的比例，增加有益菌的比例方面的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：處理組的細(xì)菌總數(shù)和弧菌總數(shù)低于對照組，弧菌僅占總細(xì)菌數(shù)的12.3%，而對照組的弧菌總數(shù)占24.0%。
本發(fā)明曾經(jīng)考察過芽胞桿菌、乳酸菌、酵母菌三種菌混合作為飼料發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，由于飼料原料發(fā)酵后pH值降低，芽胞桿菌基本不生長；也考察了以芽胞桿菌、乳酸菌、酵母菌的單一菌種作為發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，飼料發(fā)酵后的氣味、色澤和有效活菌濃度等指標(biāo)，不如乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵。上述試驗(yàn)主要解決了混合發(fā)酵劑的組成問題。
本發(fā)明公開的飼料發(fā)酵劑及在飼料發(fā)酵上的應(yīng)用與現(xiàn)有技術(shù)相比，所具有的積極效果在于：
（1）本發(fā)明采用產(chǎn)朊假絲酵母、植物乳桿菌、葡萄糖、磷酸氫二鉀與豆粕、麩皮、花生粕、豆皮、全價料混合，在室溫和開放的條件下即可完成發(fā)酵，操作工藝簡單、成本低，利于規(guī)模推廣。
（2）本發(fā)明提供的菌種在生長、產(chǎn)酸、抑菌等方面表現(xiàn)良好的性能，發(fā)酵時間短、所需溫度低，即室溫（20-30℃）2d即可完成發(fā)酵，發(fā)酵后的飼料pH降低到4.02以下，發(fā)酵后的飼料有效活菌濃度高，在不風(fēng)干的情況下室溫放置30d無雜菌生長。
（3）本發(fā)明采用簡單工藝即可使產(chǎn)朊假絲酵母和植物乳桿菌在飼料原料中迅速增殖，并使適口性差、營養(yǎng)價值低的飼料原料發(fā)酵成酸香可口的微生物飼料，具有誘食效果并能提高飼料營養(yǎng)價值和消化吸收率，調(diào)節(jié)魚蝦腸道微生物菌群。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下的實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不限制本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神對其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)由權(quán)利要求來限定。所述的產(chǎn)朊假絲酵母保藏號：CGMCC2.281；植物桿菌保藏號：CGMCC1.511。
所述的YPD培養(yǎng)基用來培養(yǎng)酵母菌，主要成分及含量為酵母膏10g/L，葡萄糖20g /L，蛋白胨20g/L；MRS培養(yǎng)基用來培養(yǎng)乳酸菌，主要成分及含量為蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，檸檬酸氫二銨2g/L，乙酸鈉5g/L，磷酸氫二鉀2g/L，硫酸鎂0.58g/L，硫酸錳0.25g/L，吐溫80 1mL/L。
實(shí)施例1
一種飼料發(fā)酵劑，其特征在于該飼料發(fā)酵劑由產(chǎn)朊假絲酵母和植物乳桿菌的發(fā)酵液等比例混合而成；所述的產(chǎn)朊假絲酵母保藏號：CGMCC2.281；植物桿菌保藏號：CGMCC1.511，產(chǎn)朊假絲酵母菌的濃度達(dá)到3.0×108-5.0×108CFU/mL，植物乳桿菌濃度達(dá)到1.0×109-5.0×109CFU/mL；其制備步驟如下：
（1）產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵液制備
將斜面保存的酵母菌菌種，接種于新鮮的YPD培養(yǎng)基平板上于25℃培養(yǎng)48h。從平板上挑取一環(huán)，接種于裝有100mL種子培養(yǎng)基的250mL的錐型瓶中，25℃，150r/min搖床，振蕩培養(yǎng)24h。
（2）植物乳桿菌發(fā)酵液制備
將穿刺培養(yǎng)的乳酸菌菌種，接種于新鮮的乳酸菌培養(yǎng)基平板上于30℃厭氧培養(yǎng)72h。從平板上挑取一環(huán)，接種于裝有45mL種子培養(yǎng)基的50mL的厭氧瓶中，30℃，靜置培養(yǎng)48h，再將其以10%的接種量接種于裝500mL培養(yǎng)基的輸液瓶中，30℃靜置培養(yǎng)24h。
（3）飼料發(fā)酵劑的制備
將產(chǎn)朊假絲酵母菌發(fā)酵液和植物乳桿菌發(fā)酵液以1:1混合，既得飼料發(fā)酵劑。
按上述方法制得的飼料發(fā)酵劑，產(chǎn)朊假絲酵母菌的濃度達(dá)到3.8×108CFU/mL以上，植物乳桿菌濃度達(dá)到2.5×109CFU/mL以上。
實(shí)施例2
飼料發(fā)酵劑在飼料原料發(fā)酵中的應(yīng)用，操作步驟如下：
（1）飼料原料有以下組合：a）豆粕、葡萄糖1.0％、K2HPO40.2%，b）花生粕、葡萄糖1.0％、K2HPO40.2%，c)豆粕20%、麩皮80%、葡萄糖1.0％、K2HPO40.2%，d）豆粕20%、豆皮80%、葡萄糖1.0％、K2HPO40.2%，e）全價料、葡萄糖1.0％、K2HPO40.2%。
（2）上述原料的料水比為7:3，將葡萄糖和K2HPO4加入水中溶解，并按5%接種量將飼料發(fā)酵劑加入水中，得混合物A，將A加入發(fā)酵原料中，攪拌均勻的混合物B。
（3）將B裝入密閉性好的塑料圓桶或塑料袋中，室溫（20-30℃）發(fā)酵，飼料原料散發(fā)明顯的酸香味完成發(fā)酵，一般只需2d，發(fā)酵后原料中乳酸菌濃度達(dá)到6.74×109CFU/g濕重以上，酵母菌濃度達(dá)到1.45×108CFU/g濕重以上，pH降到4.02以下（表1）。
表1 各處理發(fā)酵后的菌濃度
（4）發(fā)酵好的飼料可按比例加入到常規(guī)飼料中直接投喂，也可風(fēng)干后裝入袋中日后飼喂。
實(shí)施例3
飼料原料發(fā)酵后使用情況
方法：試驗(yàn)挑選外觀正常、體質(zhì)健壯的南美白對蝦作為實(shí)驗(yàn)用蝦，每個池（20m2）放養(yǎng)南美白對蝦5000尾，每天按體重 6%投餌，分四次投喂，對照組投喂常規(guī)飼料，處理組將發(fā)酵好的飼料按10%比例添加到常規(guī)飼料中飼喂。飼養(yǎng)期水溫（29±3）℃，連續(xù)充氣。試驗(yàn)第6周，取腸道，去除內(nèi)含物，用去離子水沖洗后濾紙吸干，稱重，搗碎，加入10mL無菌生理鹽水中勻漿，梯度稀釋后測細(xì)菌總數(shù)和弧菌數(shù)。
結(jié)果：從表2可知，添加發(fā)酵飼料的處理組，其細(xì)菌總數(shù)和弧菌總數(shù)低于對照組，弧菌僅占總細(xì)菌數(shù)的12.3%，而對照組的弧菌總數(shù)占24.0%。說明添加微生物發(fā)酵飼料能改善腸道菌群，降低有害菌的比例，從而增加有益菌的比例。
表2 各處理腸道細(xì)菌總數(shù)和弧菌總數(shù)
注：菌落總數(shù)以每克腸道的相應(yīng)微生物數(shù)量的對數(shù)表示，即lg( cfu/ g)。