本發(fā)明涉及活性成分提取技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種從打碗花葉中提取酵母菌抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
食品腐敗微生物會引起食品發(fā)生化學(xué)或物理性質(zhì)變化，從而使食品失去原有的營養(yǎng)價(jià)值、組織性狀及色、香、味。植物性和動物性食品原料在收獲、運(yùn)輸、加工和貯藏過程中，都會受到微生物的污染。在能引起食品腐敗變質(zhì)的微生物中，起主要作用的，除了我們熟知的一些細(xì)菌和霉菌外，酵母菌也扮演著非常重要的角色。
在高濃度糖分的糖漿、果醬、濃縮果汁等食品中，使其變質(zhì)起主要作用的有魯氏酵母、羅氏酵母、蜂蜜酵母、意大利酵母、異常漢遜氏酵母、漢氏德巴利氏酵母、膜醭畢赤氏酵母等。酵母菌對多數(shù)糖有分解作用，部分菌種還能氧化有機(jī)酸，具有耐高濃度糖和鹽的特性，通常在果汁、煉乳中引起腐敗。如煉乳球擬酵母、球擬酵母使煉乳罐頭產(chǎn)氣而膨脹，嚴(yán)重時(shí)發(fā)生爆裂。它們在果汁、果醬中繁殖后，改變內(nèi)容物的風(fēng)味，并產(chǎn)生汁液渾濁和沉淀，當(dāng)大量產(chǎn)一氧化碳后，使容器膨脹和爆裂。而假絲酵母屬是引起充氣或不充氣軟飲料產(chǎn)生渾濁的腐敗菌之一。其中，啤酒酵母（saccharomycescerevisiae）是常見的酵母菌，細(xì)胞呈圓形或橢圓性，有的有假絲，主要分布在果皮、果汁、果園土壤中。啤酒酵母是面包生產(chǎn)和酒精發(fā)酵最重要的屬，同時(shí)也引起食品的腐敗，產(chǎn)生酒精和二氧化碳。由此可見，酵母菌對食品腐敗的作用不可小視。
目前，人們在生產(chǎn)應(yīng)用中，為了防止酵母菌對食品的破壞作用，通常把一些抗生素，如鏈霉素、放線菌酮、制霉菌素等作為酵母菌抑制劑添加到食品中。很顯然，如果人體長時(shí)間過量食用抗生素，肯定對身體造成巨大傷害。山梨酸是國際糧農(nóng)組織和衛(wèi)生組織推薦的高效安全的防腐保鮮劑，但是對酵母菌的抑制作用有限，在實(shí)際生產(chǎn)過程中必須添加很多的山梨酸，才能真正達(dá)到預(yù)期的效果，經(jīng)濟(jì)上不是很劃算。因此，開發(fā)更多廉價(jià)、有效、作用更少的酵母菌抑制劑供食品工業(yè)選擇使用就顯得尤為重要。
我國中藥資源豐富，從天然植物中尋找新的低毒、高效的酵母菌抑制劑一直是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。打碗花，又叫打破碗花，為毛莨科銀蓮花屬植物。打碗花在生產(chǎn)應(yīng)用上主要用于殺蟲，具有土農(nóng)藥的美稱，在四川、湖南等地打碗花被廣泛應(yīng)用于殺滅蛆蟲和孑孓。打碗花中的活性成分主要為原白頭翁素，具有抗小麥赤霉病和水稻白葉枯病的功能。然而，通過本發(fā)明實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，打碗花的乙醇抽提物對酵母菌等真菌具有抑制活性，且活性成分穩(wěn)定，與原白頭翁素不同，易于制備與保存。
超臨界萃取兼有精餾和固液萃取的特點(diǎn)，利用壓力和溫度對超臨界流體溶解能力的影響而進(jìn)行物質(zhì)的分離。超臨界二氧化碳流體具有安全無殘留等優(yōu)點(diǎn)，是應(yīng)用最多的超臨界流體，被廣泛應(yīng)用于活性物質(zhì)的制備或精煉中。
現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號為cn103705555b的中國發(fā)明專利，公開了一種基于超臨界提取的制備性分離青楓葉中黃酮的方法，青楓葉經(jīng)烘干、粉碎，過篩為提取原料，提取原料裝入超臨界萃取釜中萃取，萃取溫度為20-40℃，co2流體壓力為20-40mpa，夾帶劑乙醇流速0.10-0.40ml/min下，萃取時(shí)間為1-3h，萃取物用甲醇吸收，ab-8樹脂層析、乙醇洗脫，濃縮后濃縮液，濃縮液再用聚酰胺層析，乙醇洗脫，濃縮干燥，就從青楓葉中得到淡黃色粉末的黃酮提取物，該方法制備簡單，提取的黃酮提取物純度較高，主要含有ⅳ苷元-槲皮素，黃酮類化合物含量約為75-80%。該方法中采用甲醇作為萃取物的溶劑，甲醇對人的神經(jīng)系統(tǒng)傷害很大，具有明顯的麻醉作用，可引起腦水腫。對視神經(jīng)和視網(wǎng)膜有特殊的選擇作用，易引起視神經(jīng)萎縮，導(dǎo)致雙目失明。所以該方法提取得到的黃酮安全度有待提高。
現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號為cn102742920b的中國發(fā)明專利，公開了一種從野棉花干葉中提取酵母菌抑制劑的方法，屬于中草藥活性成分的提取領(lǐng)域。該方法的工藝步驟如下：a、將野棉花的干葉粉碎后加入乙醇，室溫下震蕩分離出上清液，再將上清液濃縮干燥得乙醇浸膏；b、將乙醇浸膏分散于蒸餾水中，再加入己烷震蕩萃取3～4次，收集水相萃取物；c、將水相萃取物濃縮后，上mci-gel反相樹脂層析柱，用水-甲醇梯度洗脫，收集具有活性的甲醇洗脫峰流份，經(jīng)濃縮干燥后即得到酵母菌抑制劑。該方法工藝簡單、操作方便，環(huán)保，成本低；所提取得到的酵母抑菌劑的抑菌活性強(qiáng)、純度高；濃度為10mg/ml時(shí)對酵母菌的抑菌圈直徑為14～16mm。但該方法在提取過程中活性物質(zhì)損失大，提取的活性物質(zhì)量少。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種提取率高、得到的活性物質(zhì)純度高、抑菌效果好、活性物質(zhì)損失小、無溶劑殘留、綠色安全的從打碗花葉中提取酵母菌抑制劑的方法。
本發(fā)明針對背景技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：
從打碗花葉中提取酵母菌抑制劑的方法，具體步驟為：
1）預(yù)處理：將打碗花洗凈，干燥，粉碎，加入無水乙醇，打碗花粉末：乙醇體積比為1:8~15。超聲波助溶，超聲波頻率為240~270w，超聲時(shí)間為25~32min。過濾，取濾液，旋蒸干燥，得到打碗花活性物質(zhì)粗粉。醇提輔以超聲助溶，超聲波能使體系宏觀流動加快并且顆粒固體之間的碰撞加快，使得傳質(zhì)的邊界層部分變得極為細(xì)薄，傳質(zhì)速率得到了顯而易見的增強(qiáng)。能夠穿透打碗花細(xì)胞的細(xì)胞壁，讓乙醇以最快的速度進(jìn)入到植物細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，以便于溶解出其中的活性物質(zhì)。超聲提取能夠明顯的縮短其提取的時(shí)間，并且提取的條件適中溫和，使得提取產(chǎn)率有了明顯提高；
2）超臨界提?。簩⒋蛲牖ɑ钚晕镔|(zhì)粗粉置于二氧化碳超臨界萃取釜中，乙醇為夾帶劑，超臨界萃取壓力為25~31mpa，溫度為34~38℃，夾帶劑乙醇流速為0.2~0.4ml/min，萃取1.2~2.0h，co2流速為4~5l/h。含有活性物質(zhì)的超臨界co2進(jìn)入解析釜，調(diào)節(jié)溫度和壓強(qiáng)，分離壓力為10~12mpa，分離溫度為32~35℃，得到的物質(zhì)即為打碗花活性物質(zhì)粉末。采用超臨界二氧化碳流體提取技術(shù)提取打碗花活性物質(zhì)，對環(huán)境友好，無溶劑殘留，提取時(shí)間短，提取效率高；
3）超濾：將步驟2得到的活性物質(zhì)乙醇溶液進(jìn)行超濾，超濾膜孔徑為2~4kda，取滯留液，真空濃縮，得到濃縮液。超濾可除去溶于乙醇并分子量小于2~4kda的雜質(zhì)，分離效果好，并且不會造成打碗花活性物質(zhì)的流失；
4）大孔樹脂吸附：將大孔樹脂裝柱平衡后對步驟3得到的濃縮液進(jìn)行梯度洗脫。洗脫時(shí)間、洗脫液成分及其百分比和流速分別為：0~5min，超純水+硫酸鎂，流速為0.18~0.22bv/h；5~15min，90%超純水+10%異丙醇+硫酸鎂，流速為0.18~0.22bv/h；15~25min，70%超純水+30%異丙醇+硫酸鎂，流速為0.18~0.22bv/h；25~40min，100%異丙醇，流速為0.18~0.22bv/h；40~50min，60%超純水，40%異丙醇+硫酸鎂，流速為0.18~0.22bv/h，硫酸鎂加入量為洗脫液質(zhì)量的1/10000~1/15000。收集具有活性的100%異丙醇洗脫峰流份。硫酸鎂能夠有效的提高打碗花活性成分的掛柱率，使活性物質(zhì)損失小，避免了部分活性物質(zhì)在未加異丙醇的時(shí)候就洗脫下來，造成活性物質(zhì)的浪費(fèi)，提高了活性物質(zhì)的提取率；
5）透析、干燥：將洗脫液旋蒸濃縮后置于透析袋中透析，旋蒸濃縮至原來體積的1/300~1/400，透析袋孔徑為2~4kda，取滯留液，去除打孔樹脂吸附過程中加入的硫酸鎂，旋蒸濃縮，冷凍干燥，得到酵母菌抑制劑。最后得到的酵母菌抑制劑中打碗花活性成分純度高、抑菌效果好、無溶劑殘留、綠色安全。本發(fā)明對打碗花活性成分的提取率高，采用的溶劑對人健康無危害，綠色健康，提取效率高，整個(gè)制備過程耗費(fèi)的時(shí)間短；成本低廉，操作步驟簡單，適合工廠化生產(chǎn)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：醇提輔以超聲助溶，超聲波能使體系宏觀流動加快并且顆粒固體之間的碰撞加快，使得傳質(zhì)的邊界層部分變得極為細(xì)薄，傳質(zhì)速率得到了顯而易見的增強(qiáng)。能夠穿透打碗花細(xì)胞的細(xì)胞壁，能夠讓乙醇以最快的速度進(jìn)入到植物細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，以便于溶解出其中的活性物質(zhì)。超聲提取能夠明顯的縮短其提取的時(shí)間，并且提取的條件適中溫和，使得提取產(chǎn)率有了明顯提高；采用超臨界二氧化碳流體提取技術(shù)提取打碗花活性物質(zhì)，對環(huán)境友好，無溶劑殘留，提取時(shí)間短，提取效率高；超濾可除去溶于乙醇并分子量小于2~4kda的雜質(zhì)，分離效果好，并且不會造成打碗花活性物質(zhì)的流失；洗脫液中加入硫酸鎂，能夠有效的提高打碗花活性成分的掛柱率，避免了部分活性物質(zhì)在未加異丙醇的時(shí)候就洗脫下來，造成活性物質(zhì)的浪費(fèi)，提高了活性物質(zhì)的提取率；最后得到的酵母菌抑制劑中打碗花活性成分純度高、抑菌效果好、無溶劑殘留、綠色安全。本發(fā)明對打碗花活性成分的提取率高，采用的溶劑對人健康無危害，綠色健康，提取效率高，整個(gè)制備過程耗費(fèi)的時(shí)間短；成本低廉，操作步驟簡單，適合工廠化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例
下面通過實(shí)施例對本發(fā)明方案作進(jìn)一步說明：
實(shí)施例1：
從打碗花葉中提取酵母菌抑制劑的方法，具體步驟為：
1）預(yù)處理：將打碗花洗凈，干燥，粉碎，加入無水乙醇，打碗花粉末：乙醇體積比為1:8~15。超聲波助溶，超聲波頻率為240~270w，超聲時(shí)間為25~32min。過濾，取濾液，旋蒸干燥，得到打碗花活性物質(zhì)粗粉。醇提輔以超聲助溶，超聲波能使體系宏觀流動加快并且顆粒固體之間的碰撞加快，使得傳質(zhì)的邊界層部分變得極為細(xì)薄，傳質(zhì)速率得到了顯而易見的增強(qiáng)。能夠穿透打碗花細(xì)胞的細(xì)胞壁，讓乙醇以最快的速度進(jìn)入到植物細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，以便于溶解出其中的活性物質(zhì)。超聲提取能夠明顯的縮短其提取的時(shí)間，并且提取的條件適中溫和，使得提取產(chǎn)率有了明顯提高；
2）超臨界提取：將打碗花活性物質(zhì)粗粉置于二氧化碳超臨界萃取釜中，乙醇為夾帶劑，超臨界萃取壓力為25~31mpa，溫度為34~38℃，夾帶劑乙醇流速為0.2~0.4ml/min，萃取1.2~2.0h，co2流速為4~5l/h。含有活性物質(zhì)的超臨界co2進(jìn)入解析釜，調(diào)節(jié)溫度和壓強(qiáng)，分離壓力為10~12mpa，分離溫度為32~35℃，得到的物質(zhì)即為打碗花活性物質(zhì)粉末。采用超臨界二氧化碳流體提取技術(shù)提取打碗花活性物質(zhì)，對環(huán)境友好，無溶劑殘留，提取時(shí)間短，提取效率高；
3）超濾：將步驟2得到的活性物質(zhì)乙醇溶液進(jìn)行超濾，超濾膜孔徑為2~4kda，取滯留液，真空濃縮，得到濃縮液。超濾可除去溶于乙醇并分子量小于2~4kda的雜質(zhì)，分離效果好，并且不會造成打碗花活性物質(zhì)的流失；
4）大孔樹脂吸附：將大孔樹脂裝柱平衡后對步驟3得到的濃縮液進(jìn)行梯度洗脫。洗脫時(shí)間、洗脫液成分及其百分比和流速分別為：0~5min，超純水+硫酸鎂，流速為0.18~0.22bv/h；5~15min，90%超純水+10%異丙醇+硫酸鎂，流速為0.18~0.22bv/h；15~25min，70%超純水+30%異丙醇+硫酸鎂，流速為0.18~0.22bv/h；25~40min，100%異丙醇，流速為0.18~0.22bv/h；40~50min，60%超純水，40%異丙醇+硫酸鎂，流速為0.18~0.22bv/h，硫酸鎂加入量為洗脫液質(zhì)量的1/10000~1/15000。收集具有活性的100%異丙醇洗脫峰流份。硫酸鎂能夠有效的提高打碗花活性成分的掛柱率，避免了部分活性物質(zhì)在未加異丙醇的時(shí)候就洗脫下來，造成活性物質(zhì)的浪費(fèi)，提高了活性物質(zhì)的提取率；
5）透析、干燥：將洗脫液旋蒸濃縮后置于透析袋中透析，旋蒸濃縮至原來體積的1/300~1/400，透析袋孔徑為2~4kda，取滯留液，去除打孔樹脂吸附過程中加入的硫酸鎂，旋蒸濃縮，冷凍干燥，得到酵母菌抑制劑。最后得到的打碗花活性成分純度高、抑菌效果好、無溶劑殘留、綠色安全。本發(fā)明對打碗花活性成分的提取率高，采用的溶劑對人健康無危害，綠色健康，提取效率高，整個(gè)制備過程耗費(fèi)的時(shí)間短；成本低廉，操作步驟簡單，適合工廠化生產(chǎn)。
實(shí)施例2：
從打碗花葉中提取酵母菌抑制劑的方法，最優(yōu)選步驟為：
1）預(yù)處理：將打碗花洗凈，干燥，粉碎，加入無水乙醇，打碗花粉末：乙醇體積比為1:11。超聲波助溶，超聲波頻率為255w，超聲時(shí)間為29min。過濾，取濾液，旋蒸干燥，得到打碗花活性物質(zhì)粗粉。醇提輔以超聲助溶，超聲波能使體系宏觀流動加快并且顆粒固體之間的碰撞加快，使得傳質(zhì)的邊界層部分變得極為細(xì)薄，傳質(zhì)速率得到了顯而易見的增強(qiáng)。能夠穿透打碗花細(xì)胞的細(xì)胞壁，讓乙醇以最快的速度進(jìn)入到植物細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，以便于溶解出其中的活性物質(zhì)。超聲提取能夠明顯的縮短其提取的時(shí)間，并且提取的條件適中溫和，使得提取產(chǎn)率有了明顯提高；
2）超臨界提?。合葘⒋蛲牖ɑ钚晕镔|(zhì)粗粉置于已保溫至40℃的二氧化碳超臨界萃取釜中，然后開啟二氧化碳高壓泵以4.6l/h的流速向萃取釜中注入二氧化碳?xì)怏w。將萃取釜內(nèi)壓力升至28mpa，溫度為37℃，并通過調(diào)節(jié)萃取釜至解析釜間的閥門保持壓力不變，乙醇為夾帶劑，流速為0.31ml/min，萃取1.8h。含有活性物質(zhì)的超臨界二氧化碳進(jìn)入溫度為33℃，壓力為10mpa的解析釜內(nèi)，在解析釜內(nèi)二氧化碳?xì)怏w與打碗花活性物質(zhì)分離，打碗花活性物質(zhì)沉至解析釜底，間歇釋放獲得打碗花活性物質(zhì)；在停止萃取、釋放萃取釜內(nèi)壓力后取出釜內(nèi)打碗花活性物質(zhì)粉末。二氧化碳?xì)怏w進(jìn)高壓泵加壓至28mpa，重新進(jìn)入萃取釜，循環(huán)使用。采用超臨界二氧化碳流體提取技術(shù)提取打碗花活性物質(zhì)，對環(huán)境友好，無溶劑殘留，提取時(shí)間短，提取效率高；
3）超濾：將步驟2得到的活性物質(zhì)乙醇溶液進(jìn)行超濾，超濾膜孔徑為3kda，取滯留液，真空濃縮，得到濃縮液。超濾可除去溶于乙醇并分子量小于3kda的雜質(zhì)，分離效果好，并且不會造成打碗花活性物質(zhì)的流失；
4）大孔樹脂吸附：將xda-1大孔樹脂裝柱平衡后對步驟3得到的濃縮液進(jìn)行梯度洗脫。洗脫時(shí)間、洗脫液成分及其百分比和流速分別為：0~5min，超純水+硫酸鎂，流速為0.26bv/h；5~15min，90%超純水+10%異丙醇+硫酸鎂，流速為0.26bv/h；15~25min，70%超純水+30%異丙醇+硫酸鎂，流速為0.26bv/h；25~40min，100%異丙醇，流速為0.26bv/h；40~50min，60%超純水，40%異丙醇+硫酸鎂，流速為0.26bv/h，硫酸鎂加入量為洗脫液質(zhì)量的1/12000。收集具有活性的100%異丙醇洗脫峰流份。硫酸鎂能夠有效的提高打碗花活性成分的掛柱率，避免了部分活性物質(zhì)在未加異丙醇的時(shí)候就洗脫下來，造成活性物質(zhì)的浪費(fèi)，提高了活性物質(zhì)的提取率；
5）透析、干燥：將洗脫液旋蒸濃縮后置于透析袋中透析，旋蒸濃縮至原來體積的1/360，透析袋孔徑為3kda，取滯留液，去除打孔樹脂吸附過程中加入的硫酸鎂，旋蒸濃縮，冷凍干燥。最后得到的酵母菌抑制劑中打碗花活性成分純度高、抑菌效果好、無溶劑殘留、綠色安全。本發(fā)明對打碗花活性成分的提取率高，采用的溶劑對人健康無危害，綠色健康，提取效率高，整個(gè)制備過程耗費(fèi)的時(shí)間短；成本低廉，操作步驟簡單，適合工廠化生產(chǎn)。
6）抗菌活性測試：
a.供試菌株包括：大腸桿菌(escherichiacoliatcc25922)，鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimuriumatcc14028)，金黃色葡萄球菌(staphylpcoccusaureusatcc25923)，枯草芽孢桿菌(bacillussubtilisatcc21216)，蠟狀芽孢桿菌(bacilluscereusatcc10231)，側(cè)孢芽孢桿菌(bacilluslaterosporusatcc64)，黃曲霉（aspergillusflavusatcc204304），黑曲霉（aspergillusnigeratcc16404），根霉（rhizopusoryzaeatcc9363），青霉（pencicilliumcitrinumatcc14994），白色念珠菌(candidaalbicansatcc10231)，啤酒酵母菌（saccharomycescerevisiaeatcc9763）。本測試中的實(shí)驗(yàn)菌株由四川大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。
b.細(xì)菌固體培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其主要組成成分如下：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化鈉0.5g，瓊脂2g，水100ml，滅菌前用濃度2mnaoh調(diào)ph值為7.2~7.4。真菌及酵母培養(yǎng)基為土豆培養(yǎng)基，其主要組成成分如下：去皮后的馬鈴薯200g，蔗糖20g，水1000ml，瓊脂20g。
c.抗菌活性測定采用牛津杯法。牛津杯在121℃條件下高壓滅菌20min，冷卻干燥備用；將受試物用95%甲醇溶液稀釋成10mg/ml溶液并用0.22μm細(xì)菌濾器過濾除菌備用；將牛津杯放置于已冷卻的含菌雙碟平板表面，吸取200μl的受試物稀釋液分別注入牛津杯中，然后放入37℃培養(yǎng)36h，觀察各平板抑菌圈直徑大小。每組4個(gè)平板，每個(gè)平板放置2個(gè)牛津杯，重復(fù)3次，用游標(biāo)卡尺測定并記錄結(jié)果，抑菌圈直徑取平均值。
d.測試結(jié)果分析：
表1實(shí)施例2酵母菌抑制劑抗菌活性結(jié)果：
測試濃度為10mg/ml，每個(gè)平板注入200μl，每個(gè)平板含提取物2mg。用95%甲醇溶解提取物，故采用95%甲醇做陰性對照。10mg/ml青霉素和鏈霉素分別作為細(xì)菌、霉菌及酵母的陽性對照。
由上表可以看出，打碗花提取物對細(xì)菌無抑制作用，真菌中除對黑曲霉有抑制作用外，其它幾種真菌沒有影響；對酵母菌的抑菌作用明顯，效果和鏈霉素差不多。因此，該打碗花提取物可以作為理想的酵母菌抑制劑應(yīng)用到含高濃度糖分的食品中。
本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。
以上所述的實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。