本發(fā)明涉及葛根黃酮的改性，尤其涉及一種提高葛根黃酮抗氧化活性的方法。

背景技術：

黃酮類化合物是一類多酚類抗氧化劑，是葛根、補骨脂、黃芩、銀杏、沙棘、槐米等臨床常用中藥材的主要活性成分。該類化合物不僅數(shù)量眾多，而且結構復雜，具有許多重要的生理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、抗過敏、抗糖尿病并發(fā)癥等。

天然黃酮類化合物雖然生理活性豐富并且廣泛存在于自然界，但因其溶解性差、生物利用度不高等缺點而限制了它們的臨床應用。因此對自然界含量較高的天然黃酮進行結構修飾，使之達到成藥要求,是合理開發(fā)利用該類化合物的一條重要途徑。傳統(tǒng)化學催化的方法會使產(chǎn)物變得復雜，并且其使用的試劑不適合添加到食品中，其溶劑殘留問題將阻礙改性產(chǎn)物在食品等行業(yè)中的應用。而選擇酶做催化劑，因其選擇性強，反應條件溫和，產(chǎn)品更易被食品等行業(yè)接受而成為當前研究的熱點。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種提高葛根黃酮抗氧化活性的方法，采用一種風味水解酶β-葡萄糖苷酶對葛根黃酮粉進行水解處理，將葛根黃酮苷水解為具有更高抗氧化活性以及更好脂溶性的苷元，以拓展葛根黃酮粉在食品等行業(yè)的應用。

技術方案：本發(fā)明所述的提高葛根黃酮抗氧化活性的方法，包括：將葛根黃酮分散于緩沖液中，加入β葡萄糖苷酶進行反應，反應溫度為30-50℃；反應結束后過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，再對萃取液進行減壓蒸餾和干燥。

所述緩沖液的pH為4.5-6.5，優(yōu)選的，pH為5.5-6.0，更優(yōu)選的，pH為6.0。

所述的緩沖液為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液。本領域人員知曉，所述的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液通常根據(jù)pH要求由0.2M磷酸氫二鈉與0.1M檸檬酸按照不同比例混合而得。

將葛根黃酮分散于緩沖液中，料液比為1:2.5-1:20，優(yōu)選的，料液比為

1:5-1:10，更優(yōu)選的，料液比為1:5。

所述β葡萄糖苷酶的添加量為：每克葛根黃酮中添加50-400IUβ葡萄糖苷酶，優(yōu)選的，每克葛根黃酮中添加100-300IUβ葡萄糖苷酶，更優(yōu)選的，每克葛根黃酮中添加200IUβ葡萄糖苷酶。

為使反應進行完全，所述反應的時間為0.5-2.5h，優(yōu)選的，反應時間為1h，反應溫度為30-45℃。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：

與傳統(tǒng)的化學法相比，采用β葡萄糖苷酶對葛根黃酮進行處理，反應條件溫和，除了使用食品級乙酸乙酯外，無任何有機溶劑的加入，無有毒溶劑殘留。

采用β葡萄糖苷酶對葛根黃酮進行處理，有效提高了其抗氧化活性和脂溶性，拓展了其在食品等行業(yè)的應用。與未經(jīng)處理相比，DPPH自由基清除率由25.89％提高到92.53％，總還原力由0.139提高到0.704，羥基自由基清除率由3.19％提高到22.79％。衡量脂溶性的透光率從0.108提高到1.000，DPPH自由基清除率達同濃度維生素C的98.1％。

附圖說明

圖1為pH對產(chǎn)物抗氧化活性的影響；

圖2為料液比對產(chǎn)物抗氧化活性的影響；

圖3為酶添加量對產(chǎn)物抗氧化活性的影響；

圖4為溫度對產(chǎn)物抗氧化活性的影響；

圖5為水解時間對產(chǎn)物抗氧化活性的影響。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明，應理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領域技術人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權利要求所限定的范圍。

本發(fā)明具體實施方式中所用的β葡萄糖苷酶的酶活為100IU/g。

本發(fā)明具體實施方式中相關參數(shù)的測試方法如下：

1、羥基自由基清除率測定：

將樣品用乙醇配成5g/L溶液。取1.0mL，分別加入9.0mmol/L FeSO₄、9.0mmol/L水楊酸-乙醇各1.0mL，對照組以蒸餾水1.0mL代替樣品溶液。最后加8.8mmol/L H₂O₂啟動反應，37℃水浴反應0.5h后，以蒸餾水調零，在波長510nm下測定吸光度。以Vc作陽性對照品，臨用前用蒸餾水配制成與樣品溶液相同的質量濃度。同法操作，進行對照試驗。

清除率(％)＝([A₀-Ax-Ax₀)/A₀]×100計算清除率。

式中：A₀用蒸餾水代替水楊酸時測得的不同提取物濃度本底吸光度；

Ax為樣品吸光度值；

Ax₀為用水代替樣品測定的吸光度值。

2、DPPH自由基清除率測定：

將待測樣品用無水乙醇配成5g/L。用乙醇做溶劑將DPPH配制成濃度為1.183g/L乙醇溶液作為儲備液，臨用前用無水乙醇溶液稀釋成0.1183g/L。

測定：樣品溶液+溶液各2ml為Ai(為樣品抑制吸收值)；樣品溶液+無水乙醇2ml為Ac(為樣品對照)；DPPH溶液+無水乙醇各2ml為Aj(為無抑制吸收值)；4ml無水乙醇為無抑制吸收值對照。分別充分振蕩混勻，室溫靜止30min后在517nm處測定吸收值(每個值同時測定兩管)。

抑制率＝(Aj-Ai)*100％/Aj，結果以Vc作陽性對照。

3、總還原力測定：

將樣品用無水乙醇配成5g/L。取2.5mL樣品液，加入2.5mL 2.5mol/LpH6.6磷酸鹽緩沖液，再加入2.5mL 1％六氰合鐵酸鉀和0.2mL 1％蔗糖酯溶液；充分振蕩混勻；蓋上塞子將該試管置于50℃水浴鍋中保溫20min；取出試管進行快速冷卻,然后加入2.5mL 10％TCA,充分振蕩混勻后4 000r/min離心10min；取離心后的上清液2.5mL，加入2.5mL濃度25％甲醇和0.5mL 0.1％三氯化鐵,充分振蕩混勻，靜置10min后測定其在700nm處的吸光度值，用去離子水代替樣品的混合液進行還原力參比測定試驗。混合液的吸光度越強，表明還原力越強。

4、脂溶性測定：

稱取10mg干燥后的產(chǎn)品，溶于10mL氯仿中，超聲10min使其溶解，配成濃度為1g/L的溶液或懸液，在測之前再在震蕩器上震蕩混勻后用紫外分光光度計測定溶液或懸液在800nm下的透光率。

實施例1

稱取5g葛根黃酮粉，按料液比(g/mL)1:5加入pH5.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入5gβ葡萄糖苷酶，在40℃下水解1h。反應結束后，抽濾，濾液用50mL食品級乙酸乙酯萃取二次。將萃取液40℃減壓蒸餾去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

將真空干燥后的樣品用乙醇溶解，配成5g/L濃度，測定其DPPH自由基清除率為73.42％，總還原力0.375，羥基自由基清除率為12.47％。

實施例2

稱取5g葛根黃酮粉，按料液比(g/mL)1:5加入pH6檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入5gβ葡萄糖苷酶，在30℃下水解1h。反應結束后，抽濾，濾液用50mL食品級乙酸乙酯萃取二次。將萃取液40℃減壓蒸餾去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

將真空干燥后的樣品用乙醇溶解，配成5g/L濃度，測定其DPPH自由基清除率為61.59％，總還原力0.268，羥基自由基清除率為9.86％。

實施例3

稱取5g葛根黃酮粉，按料液比(g/mL)1:5加入pH6檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入5gβ葡萄糖苷酶，在45℃下水解1h。反應結束后，抽濾，濾液用50mL食品級乙酸乙酯萃取二次。將萃取液40℃減壓蒸餾去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

將真空干燥后的樣品用乙醇溶解，配成5g/L濃度，測定其DPPH自由基清除率為85.96％，總還原力0.452，羥基自由基清除率為18.47％。

實施例4

稱取5g葛根黃酮粉，按料液比(g/mL)1:5加入pH6檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入10gβ葡萄糖苷酶，在45℃下水解1h。反應結束后，抽濾，濾液用50mL食品級乙酸乙酯萃取二次。將萃取液40℃減壓蒸餾去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

將真空干燥后的樣品用乙醇溶解，配成5g/L濃度，測定其DPPH自由基清除率為92.53％，總還原力0.504，羥基自由基清除率為22.79％。

空白組：指未經(jīng)酶處理的原料樣品。

對照組1：指除不加酶外，其他操作參照實施例4。

對照組2：指以維生素C為對照品，用水配成5g/L濃度，按法測定DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率以及總還原力。

結果見表1。

表1

實施例5

稱取5g葛根黃酮粉，按料液比(g/mL)1:5加入不同pH檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入10gβ葡萄糖苷酶，在40℃下水解1h。反應結束后，抽濾，濾液用50mL食品級乙酸乙酯萃取二次。將萃取液40℃減壓蒸餾去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

pH分別設置為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，考察不同pH對產(chǎn)物抗氧化性能的影響，結果見圖1，pH為6.0時產(chǎn)物抗氧化性能最佳。

實施例6

緩沖液的pH為5.5，料液比分別設置為1:2.5,1:5,1:10,1:15,1:20，考察不同料液比對改性產(chǎn)物抗氧化性能的影響，其余實驗步驟同實施例5。

結果見圖2，料液比為1:5時產(chǎn)物抗氧化性能最佳。

實施例7

緩沖液的pH為6.0，在45℃下水解1h，調整β葡萄糖苷酶的添加量，每克葛根黃酮中分別添加50、100、200、300、400IUβ葡萄糖苷酶，考察不同酶量對產(chǎn)物抗氧化性能的影響，其余實驗步驟同實施例5。

結果見圖3，β葡萄糖苷酶的添加量為200IU/g時產(chǎn)物抗氧化性能最佳。

實施例8

緩沖液的pH為6.0，β葡萄糖苷酶的添加量為10g，水解1h，調整反應溫度分別設置為30、35、40、45以及50℃，考察不同反應溫度對改性產(chǎn)物抗氧化性能的影響，其余實驗步驟同實施例5。

結果見圖4，溫度為45℃時產(chǎn)物抗氧化性能最佳。

實施例9

緩沖液的pH為6.0，β葡萄糖苷酶的添加量為10g，在40℃分別反應0.5、1、1.5、2、2.5h，考察不同反應時間對改性產(chǎn)物抗氧化性能的影響，其余實驗步驟同實施例5。

結果見圖5，反應1h時產(chǎn)物抗氧化性能最佳。