本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，重點(diǎn)是植物乳桿菌發(fā)酵大麥粉提取物的降脂活性及其片劑的制備方法。

背景技術(shù)：

由于生活節(jié)奏與飲食的變化，導(dǎo)致全球肥胖人口比例逐年增加，并使?fàn)I養(yǎng)型肥胖成為侵害國民健康最主要的非傳染性慢性疾病之一。因此，如何控制代謝綜合征的發(fā)生就成為各國研究的熱點(diǎn)問題。肥胖和胰島素抵抗作為代謝綜合征的主要表現(xiàn)，因此對于肥胖和胰島素抵抗的預(yù)防或干預(yù)就顯得極為重要。而鑒于減肥和改善胰島素抵抗的藥物普遍具有一定的毒副作用，尋找天然安全產(chǎn)物以防治肥胖和改善胰島素抵抗，就具有更大的意義和市場需求。而通過天然活性因子激活棕色脂肪組織(BAT)解耦連產(chǎn)熱以減輕肥胖的途徑，具有既治標(biāo)又治本、既安全又有效的優(yōu)勢，因此而蘊(yùn)藏巨大的應(yīng)用潛力。

近年來全谷物的健康功能已受到各國的廣泛關(guān)注。大麥含有豐富的β-葡聚糖、功能蛋白、黃酮、多酚類化合物等多種活性成分，具有調(diào)節(jié)血糖、降血脂、降低膽固醇和改善肥胖等功能。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物加工(發(fā)酵)技術(shù)與傳統(tǒng)谷物的結(jié)合顯露出其前所未有的活力，已有研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)谷物經(jīng)發(fā)酵后其品質(zhì)明顯改善，功能活性顯著提高，應(yīng)用范圍也得到了拓寬，具有顯著的開發(fā)潛力。

關(guān)于大麥發(fā)酵的研究，日本專利WO2007034958公開了一種脫殼大麥的乙醇提取物、堿提取物和發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，其活性成分具有抑制血管生成的作用，但并未研究其對肥胖及預(yù)防肥胖的影響。

中國專利CN201310264094.9公開了乳酸菌發(fā)酵大麥提取物的制備方法及其抗腫瘤作用。乳酸菌發(fā)酵大麥提取物能夠有效的抑制腫瘤的生長，但并未研究其對代謝綜合征的作用。

中國專利CN201510073680.4公開了乳酸菌發(fā)酵大麥提取物及其制備方法與用途，通過乳酸菌發(fā)酵大麥，可以實(shí)現(xiàn)營養(yǎng)的生物轉(zhuǎn)化。乳酸菌發(fā)酵大麥提取物可作為抑制肥胖及改善胰島素抵抗的功能食品或食品原料。

文章UCP1:its involvement and utility in obesity(UCP1在肥胖中的涉及和功能)，International journal of obesity,2008,32:S32-S38，指出BAT在能量平衡和脂代謝中扮演重要角色，因為其可以被活性天然產(chǎn)物激活而消耗脂肪。國內(nèi)外有諸多研究指出活性天然物質(zhì)能通過UCP1代謝通路激活BAT線粒體消耗脂肪產(chǎn)熱，減輕試驗體肥胖。由于大多天然產(chǎn)物的降脂活性成分不明確，所以開發(fā)一種即能調(diào)節(jié)人體脂代謝，且活性成分明確的功能產(chǎn)品十分必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了乳酸菌發(fā)酵大麥提取物片劑的制備方法與用途，因其具有改善“三高”病癥、減緩胰島素抵抗、減少體脂肪量和促進(jìn)白色脂肪棕色化的效果。乳酸菌發(fā)酵大麥提取物片劑是一款效果明確、服用方便且安全無毒的片劑，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂的功能。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的的。

(1)植物乳桿菌發(fā)酵大麥粉提取物(LFBE)的制備：發(fā)酵初始pH＝5、固液比為1:7(g/mL)、每克大麥粉添加植物乳桿菌的量為7×10⁷cfu～9×10⁷cfu、發(fā)酵溫度為31～34℃、發(fā)酵時間為24～28h。以此工藝進(jìn)行發(fā)酵后，8000rpm/min離心得到的提取物為LFBE；

(2)LFBE的穩(wěn)定化處理：每100mL LFBE加入1g～2gβ-環(huán)糊精，以包埋LFBE內(nèi)活性成分，40℃水浴10min～15min，期間不斷攪拌至發(fā)酵液澄清；

(3)β-環(huán)糊精包埋LFBE凍干粉的制備：采用冷凍干燥法對經(jīng)穩(wěn)定化處理的LFBE進(jìn)行干燥，所得干燥提取物為β-環(huán)糊精包埋植物乳桿菌發(fā)酵大麥提取物凍干粉(BLFBE)；

(4)LFBE片劑制備：向BLFBE中添加1.5％～2％的羧甲基纖維素鈉與0.5％～1％的維生素C后，經(jīng)超微粉碎后，加入1.0％～1.5％的硬脂酸鎂，混合均勻，選用12mm模具壓片，壓力控制在500kg，每片重約0.45g～0.55g。

本發(fā)明得到的LFBE片劑具有激活BAT進(jìn)行線粒體解耦連產(chǎn)熱，以消耗多余能量的作用。

本發(fā)明得到的LFBE片劑具有促使白色脂肪棕色化，以消耗多余能量的作用。

本發(fā)明得到的LFBE片劑具有抑制肥胖及改善胰島素抵抗的功能。

本發(fā)明有益效果：

(1)本發(fā)明所述的乳酸菌發(fā)酵大麥提取物片劑的制備方法，其工藝簡單，成本低，適于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

(2)本發(fā)明所述的乳酸菌發(fā)酵大麥提取物片劑具有明顯的調(diào)脂降糖的益生功能，故特別適用于肥胖與高血糖患者的輔助治療。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述三組SD大鼠十周內(nèi)的體重變化圖。

圖2為本發(fā)明所述三組SD大鼠十周內(nèi)的攝食量變化圖。

圖3為本發(fā)明所述三組SD大鼠分別在0周和10周的口服糖耐量結(jié)果圖。

圖4為本發(fā)明所述三組SD大鼠BAT組織脂肪切片及其細(xì)胞直徑大小圖。

圖5為本發(fā)明所述三組SD大鼠BAT內(nèi)有關(guān)脂代謝基因表達(dá)水平和UCP1蛋白表達(dá)量圖。

圖6為本發(fā)明所述三組SD大鼠附睪脂肪內(nèi)有關(guān)脂代謝基因表達(dá)水平和UCP1蛋白表達(dá)量圖。

(注：圖1-6中：NC：正常組；HFD：高脂飲食組；LFBE：乳酸菌發(fā)酵大麥提取物片劑組)

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖以及具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。

1.LFBE片劑的制備

(1)選用植物乳桿菌dy-1(該菌株已經(jīng)獲批中國發(fā)明專利，專利號為ZL201310261606.6，發(fā)明名稱為一種發(fā)酵谷物的乳酸菌及其用途)，發(fā)酵揚(yáng)飼麥3號大麥粉，發(fā)酵工藝為：發(fā)酵初始pH＝5、固液比為1:7(g/mL)、每克大麥粉添加植物乳桿菌的量為7×10⁷cfu～9×10⁷cfu、發(fā)酵溫度為31～34℃、發(fā)酵時間為24～28h。以此工藝進(jìn)行發(fā)酵后，8000r/min離心得到的提取物為植物乳桿菌發(fā)酵大麥提取物(LFBE)；

(2)LFBE的穩(wěn)定化處理：每100mL LFBE加入1.5g～2gβ-環(huán)糊精，40℃水浴10-15min，期間不斷攪拌至發(fā)酵液澄清；

(3)β-環(huán)糊精包埋植LFBE凍干粉的制備：采用冷凍干燥法對經(jīng)β-環(huán)糊精穩(wěn)定化處理的LFBE進(jìn)行干燥，所得干燥提取物為β-環(huán)糊精包埋植物乳桿菌發(fā)酵大麥提取物凍干粉(BLFBE)；

(4)LFBE片劑制備：向BLFBE中添加1.5％～2％的羧甲基纖維素鈉與0.5％～1％的維生素C后，經(jīng)超微粉碎后，加入1.0％～1.5％的硬脂酸鎂，混合均勻，選用12mm模具壓片，壓力控制在500kg，每片重約0.45g～0.55g。

2.動物實(shí)驗設(shè)計

清潔級健康SD大鼠24只，56周齡，180～200g左右，雄性，購于江蘇大學(xué)實(shí)驗動物中心，試驗過程符合江蘇省實(shí)驗動物管理委員會和國家實(shí)驗動物福利保護(hù)的規(guī)定，大鼠飼養(yǎng)于江蘇大學(xué)實(shí)驗動物中心動物房：室溫(25±2)℃，相對濕度(55±5)％，12h/12h光照，自由獲取食物和飲水。SD大鼠適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分為3組。第一組為正常組(Normal Control,NC)，喂基礎(chǔ)飼料，同時灌胃生理鹽水；第二組為高脂飲食組(High Fat Diet,HFD)，喂高脂飼料(73％基礎(chǔ)飼料、12％豬油、10％白砂糖以及5％蛋黃粉)，同時灌胃生理鹽水；第三組為LFBE組，飼喂高脂飼料(73％基礎(chǔ)飼料、12％豬油、10％白砂糖以及5％蛋黃粉)，同時灌胃800mg/kg/d的LFBE。

3.試驗方法

各組試驗大鼠均口服BLFBE片劑10周，每天一次，記錄每組大鼠周體重變化。在第1和第10周測定口服糖耐量；末次灌胃后禁食8h，次日，采用水合氯醛麻痹，腹主動脈取血，3500r/min離心10min分離血清，-20℃保存。解剖大鼠取出附睪脂肪組織(EAT)、腹部脂肪組織(AAT)和棕色脂肪組織(BAT)，用生理鹽水漂凈、濾干后稱重，保存在—80℃。

血脂水平的測定：采用全自動生化分析儀測定大鼠血清中甘油三醋(TG)、總膽固醇(Tc)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和胰島素含量。

口服糖耐量測試(OGTT)方法：對空腹大鼠經(jīng)口灌胃葡萄糖2g/kg，分別于0、0.5、1、2h時斷尾取血，采用強(qiáng)生one-touChBasiC血糖儀測定血糖水平。

使用CFX96^TM Real-Time PCR Detection System擴(kuò)增儀進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。按照SYBR Premix Ex Taq^TM kit(Takara Bio，大連，中國)說明應(yīng)體系，反應(yīng)總體積為25μl，其中含有12.5μl SYBR Premix Ex Taq(2×)，2.0μl反轉(zhuǎn)示反應(yīng)產(chǎn)物，0.5μl前引物，0.5μl后引物，引物序列見表3-2。最后用無菌水補(bǔ)足25μl。實(shí)時PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30s，然后以95℃5s和60℃30s進(jìn)行40個循環(huán)。使用β-actin作為內(nèi)對照，待測基因的量通過2^-ΔΔt法確定，ΔΔt＝(t_RNA-t_β-actin)_對照組-(t_RNA-t_β-actin)_{實(shí)驗組}。

表1 RT-PCR引物表

BAT中UCP1蛋白表達(dá)水平：取不同組大鼠的BAT 0.5g，在冰浴條件下剪成碎塊，并加入液氮迅速研磨成粉，加入0.5mL組織裂解液，放置冰上裂解20min，用組織勻漿機(jī)進(jìn)行組織勻漿，4℃12000g/min離心5min，取上清液，用BCA法測定上清液的蛋白濃度。每個樣品加入5×上樣緩沖液，100℃下加熱5min使其變性，上樣，10％SDS-PAGE(聚丙烯酞胺凝膠電泳)電泳分離，先恒壓80V，再恒壓100V。將膠取出，連同PVDF膜和濾紙一塊放在轉(zhuǎn)運(yùn)液中浸潤，做好標(biāo)記，然后按照裝置說明組裝好海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿的“三明治”狀，置于轉(zhuǎn)運(yùn)儀上，加入轉(zhuǎn)運(yùn)液，調(diào)穩(wěn)流200fnA，轉(zhuǎn)運(yùn)2h。將PVDF膜取出后置于TBST中洗滌3次，每次10min，再置于含有5％脫脂奶粉溶液中搖晃封閉90min；膜封閉后，用TBST洗滌3次，每次10min；再加入稀釋的一抗4℃孵育過夜；然后用TBST洗滌3次，每次10min；加入稀釋的二抗，室溫?fù)u晃2h；最后用TBST洗滌3次，每次10min。化學(xué)發(fā)光法(ECL)曝光顯色。

4.實(shí)驗結(jié)果

注:各組數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS14.0中ANOVA模塊對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，p<0.05認(rèn)為存在顯著性差異。

(1)大鼠血生化分析

表2為LFBE組大鼠血清中的TG、TC、HDL、LDL和胰島素水平。連續(xù)10周灌胃大鼠LFBE后，LFBE組大鼠的TG、TC、HDL、LDL和胰島素水平都明顯低于HFD組大鼠的水平，且接近NC組大鼠的水平，說明LFBE顯著降低有關(guān)肥胖指標(biāo)，具有緩解肥胖的作用。

表2大鼠血生化指標(biāo)

(2)大鼠脂肪組織重量

如表3所示，LFBE組大鼠的BAT重量是三組中最大的，約比HFD組和NC組大鼠高70％。同時，LFBE組AAT和EAT重量分別約低于HFD大鼠46.46％和35.79％。

表3大鼠脂肪組織重量

BAT作為大鼠重要的產(chǎn)熱組織，通過解偶聯(lián)ATP生成而產(chǎn)熱，質(zhì)量大的BAT理論上能產(chǎn)生較多能量。并且，LFBE組擁有較低AAT和EAT，說明LFBE促使LFBE組大鼠BAT生長并消耗體脂，減少白色脂肪重量。

(3)大鼠體重與攝食量變化

圖1為三組大鼠體重在十周內(nèi)的變化趨勢圖，圖2為三組大鼠攝食量在十周內(nèi)的變化趨勢圖。前四周內(nèi)，LFBE組與HFD組大鼠的體重沒有明顯差異，但自第六周之后，LFBE組大鼠體重的增長速率明顯低于HFD組大鼠，說明LFBE有效的抑制HFD組大鼠體重的增加。實(shí)驗期間，LFBE組大鼠的攝食量略低于HFD組大鼠的攝食量，但兩組攝食量無明顯差異。NC組大鼠的攝食量則一直保持在30～33g/day。

(4)大鼠口服糖耐量水平

大鼠肥胖模型建立時，三組大鼠的OGTT曲線如圖3(a)所示。HFD組和LFBE組的OGTT曲線未有明顯差別，且兩組的空腹血糖值都較高。口服葡萄糖后兩小時，兩組大鼠血糖值都停留在較高值，兩組糖耐量曲線下面積分別為13.81±0.12和13.34±0.57。NC組大鼠的OGTT曲線與前兩組相比，空腹血糖值和口服葡萄糖后血糖值都較低，其糖耐量曲線下面積顯著低于前兩組。在肥胖模型建立初期，HFD組和LFBE組都擁有較高的空腹血糖值以及較高的口服葡萄糖后血糖值，說明兩組大鼠都有一定程度的胰島素抵抗，這與建立肥胖模型的目的是相一致的。

圖3(b)為持續(xù)10周用800mg/Kg/D LFBE灌喂大鼠后的OGTT結(jié)果。HFD組和LFBE組的OGTT曲線出現(xiàn)明顯差別，LFBE組的空腹血糖和口服葡萄糖后2小時血糖值都明顯低于HFD組，且LFBE組糖耐量曲線下面積顯著低于HFD組。與第一次OGTT結(jié)果相比，NC組和HFD組的OGTT結(jié)果未有明顯差別。LFBE組OGTT結(jié)果與第一次比較，口服葡萄糖后2小時血糖值明顯下降，糖耐量曲線下面積降低10％。說明LFBE干預(yù)LFBE肥胖大鼠后，有效緩解大鼠的胰島素抵抗水平。

(5)大鼠BAT細(xì)胞直徑

如圖4所示，NC組、HFD組和LFBE組的BAT細(xì)胞直徑分別為99.531±12.60、299.44±32.75和124.24±11.58μm。HFD組大鼠BAT細(xì)胞直徑在三組中最大，其超過LFBE組141.02％。從三組BAT H&E染色切片圖能看出LFBE組BAT內(nèi)脂滴大小明顯小于HFD組BAT的細(xì)胞直徑，且與NC組BAT脂滴大小相近。以上結(jié)果說明，LFBE能顯著減少LFBE組大鼠BAT內(nèi)脂肪的積累。

(6)大鼠脂代謝基因表達(dá)水平

由圖5所示，BAT內(nèi)與脂肪代謝有關(guān)基因表達(dá)水平和其UCP1蛋白表達(dá)量。相對HFD組，LFBE組BAT的UCP1基因表達(dá)水平提高了2.225倍。同時，LFBE組BAT的PGC-1α、COX和β-3-AR基因表達(dá)水平相對HFD組也有顯著提高，但其cAMP基因表達(dá)水平?jīng)]有顯著提高。NC組、HFD組和LFBE組BAT的UCP1蛋白條帶相對濃度為0.347±0.0202、0.223±0.0133和0.483±0.036，說明LFBE顯著提高BAT內(nèi)UCP1的含量。UCP1基因表達(dá)水平與UPC1含量的升高，說明線粒體的解耦連反應(yīng)被激活，并通過UCP1相關(guān)代謝通路，刺激大鼠消耗體內(nèi)過多脂肪。

由圖5所示，EAT內(nèi)與脂肪代謝有關(guān)基因表達(dá)水平和其UCP1蛋白表達(dá)量。大鼠LFBE組EAT的β-3-AR、UCP1和COX基因表達(dá)水平較HFD組增加3.204、3.594和3.743倍，但其cAMP表達(dá)水平?jīng)]有顯著提高。NC組、HFD組和LFBE組EAT的UCP1條帶相對濃度為0.4415±0.023、0.469±0.0308和0.692±0.058。LFBE組EAT的UCP1含量相對高脂組都有顯著提高。LFBE組EAT的UCP1基因表達(dá)量與含量的升高，說明EAT出現(xiàn)棕色化，即LFBE激活A(yù)AT內(nèi)線粒體進(jìn)行解耦連產(chǎn)熱，消耗大鼠體內(nèi)多于能量。

綜上所述，與HFD組大鼠相比，LFBE能明顯降低飲食誘導(dǎo)型肥胖大鼠的體重及體內(nèi)脂肪組織重量，改善大鼠血清中膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白以及胰島素水平，降低大鼠OGTT水平，這些效果主要是LFBE通過激活BAT內(nèi)UCP1及其相關(guān)脂代謝途徑消耗大鼠體內(nèi)脂肪，并且誘導(dǎo)大鼠EAT出現(xiàn)棕色化而減少脂肪積累，以緩解大鼠肥胖。

所述實(shí)施例為本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，但本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式，在不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠做出的任何顯而易見的改進(jìn)、替換或變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。