本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，且特別涉及一種靈芝三萜的提取方法及靈芝保健品。
背景技術(shù)：
靈芝(Ganoderma lucidum)是擔(dān)子菌綱、多孔菌科、靈芝屬(Ganoderma)真菌，常用其子實(shí)體，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材和藥用真菌。藥理研究表明，靈芝具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗衰老、提高機(jī)體耐缺氧能力等活性，其主要功效成分為靈芝三萜和靈芝多糖。靈芝三萜是其中一種主要的成分，具有明顯的護(hù)肝排毒、抗氧化、抗菌抗炎、抗HIV病毒、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、抑制膽固醇合成、降低血小板聚集、抑制組胺釋放和調(diào)節(jié)免疫等作用，可以廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和保健品中。
由于靈芝三萜存在于靈芝的細(xì)胞壁中，靈芝子實(shí)體細(xì)胞壁成分主要是幾丁質(zhì)，結(jié)構(gòu)復(fù)雜、堅(jiān)硬，且耐酸堿，造成細(xì)胞內(nèi)有效物質(zhì)的充分吸收受到很大程度上的阻礙。目前，通常采用有機(jī)溶劑法提取靈芝三萜，通常需要較長(zhǎng)的提取時(shí)間并消耗大量的提取溶劑，同時(shí)大量有機(jī)溶劑的使用會(huì)給人體和環(huán)境帶來(lái)不利的影響。另外，由于靈芝子實(shí)體結(jié)構(gòu)緊密，活性成分附著在細(xì)胞內(nèi)側(cè)，傳統(tǒng)的熱水浸提法時(shí)間長(zhǎng)、耗能高，活性成分提取物得率低。而單純的使用超聲輔助提取或者乙醇回流提取等方法提取的三萜得率也較低；采用超臨界CO2萃取所需的設(shè)備投入較大、操作難度和生產(chǎn)成本也較高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種靈芝三萜的提取方法，此提取方法操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)，且靈芝三萜的提取率較高。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種靈芝保健品，包括由上述提取方法提取而得的靈芝三萜，該靈芝保健品的保健效果好，且原料為天然產(chǎn)物，毒副作用小。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題是采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
本發(fā)明提出一種靈芝三萜的提取方法，其包括以下步驟：粉碎靈芝子實(shí)體，與纖維素酶、半纖維素酶和木瓜蛋白酶混合后酶解，得酶解物；向酶解物中加入93-97wt％的乙醇-水溶液并于75-85℃條件下回流提取1-3h，過(guò)濾，濃縮濾液得上樣物，于D101大孔吸附樹(shù)脂層析柱中對(duì)上樣物進(jìn)行脫鹽和洗脫，收集洗脫后的液體，去除有機(jī)相，得靈芝三萜。
本發(fā)明還提出一種靈芝保健品，包括由上述提取方法提取所得的靈芝三萜。
本發(fā)明較佳實(shí)施例的靈芝三萜的提取方法和靈芝保健品的有益效果是：通過(guò)對(duì)靈芝子實(shí)體進(jìn)行粉碎，增加了原料與酶和提取劑之間的接觸面積，提高酶解和提取速度。以纖維素酶、半纖維素酶和木瓜蛋白酶共同作為酶解過(guò)程中的酶，不僅利于細(xì)胞壁輸送、破裂，使細(xì)胞內(nèi)的化合物游離出來(lái)，還能水解植物中的蛋白，促使細(xì)胞釋放更多的三萜物質(zhì)。以乙醇-水溶液為提取劑，既能保證浸出速度快、浸出物的純度高、雜質(zhì)少，而且還能降低成本?；亓鳒囟群突亓鲿r(shí)間分別為75-85℃和1-3h，不僅可避免因回流時(shí)間過(guò)短或溫度過(guò)低造成的有效物質(zhì)溶出率低，回流時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高又會(huì)使得植物細(xì)胞中的油脂、鞣質(zhì)等雜質(zhì)過(guò)多的溶出，增大分離純化的難度等缺陷，還可進(jìn)一步提高三萜物質(zhì)的提取率并保持三萜物質(zhì)的活性最佳。過(guò)濾后用D101大孔吸附樹(shù)脂層析柱對(duì)上樣物進(jìn)行脫鹽和洗脫，該類(lèi)型層析柱吸附量高、填料顆粒均勻、機(jī)械強(qiáng)度好、不易破碎且殘留物少，對(duì)有機(jī)物選擇性好，分離、純化、除雜的效果佳，故可提高靈芝三萜的純度。該提取方法簡(jiǎn)單、條件溫和、易操作、成本低、耗時(shí)短且得率高。含有上述靈芝三萜的靈芝保健品，毒副作用小，保健效果好。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買(mǎi)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的靈芝三萜及其提取方法進(jìn)行具體說(shuō)明。
本發(fā)明實(shí)施例提供的靈芝三萜的提取方法，以靈芝子實(shí)體為原料，提取過(guò)程中可先對(duì)原料進(jìn)行前處理，即靈芝子實(shí)體粉碎，以增加原料與酶和提取劑之間的接觸面積，提高酶解和提取速度。粉碎粒度例如可以為30-50目，該粒度范圍內(nèi)原料中的有效成分溶出率較大。原料優(yōu)選采自新鮮靈芝的子實(shí)體，此條件下的靈芝子實(shí)體中的有效成分含量最高，有利于提高后續(xù)提取物中有效成分的含量。
作為優(yōu)選的，在粉碎步驟之前，還可以對(duì)靈芝子實(shí)體進(jìn)行除雜、清洗和干燥等工序。其中除雜和清洗可避免其它雜質(zhì)對(duì)提取效果的干擾，干燥可部分破壞原料的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，利于提取。其中，干燥的溫度例如可以選擇為20-45℃，優(yōu)選為37℃。在此優(yōu)選條件下，原料中的活性成分可最大程度的保留并不被高溫破壞。
較佳的，本發(fā)明實(shí)施例采用酶解法對(duì)靈芝子實(shí)體進(jìn)行酶解，即利用活性酶的特異性來(lái)水解酶所對(duì)應(yīng)的特定物質(zhì)。因靈芝三萜存在于靈芝的細(xì)胞壁中，靈芝子實(shí)體細(xì)胞壁成分主要是幾丁質(zhì)，結(jié)構(gòu)復(fù)雜及堅(jiān)硬，且耐酸堿，造成細(xì)胞內(nèi)有效物質(zhì)的充分吸收受到很大程度上的阻礙。近年來(lái)，酶工程技術(shù)在中草藥活性成分的提取中得到顯著應(yīng)用，選用適當(dāng)?shù)拿缸饔糜谥兴幉牧?，可以通過(guò)酶反應(yīng)溫和地分解細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)中的纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等成分，破壞細(xì)胞壁的致密構(gòu)造，引起細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生局部疏松、膨脹、崩潰等變化，減小細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)等傳質(zhì)屏障對(duì)有效成分從胞內(nèi)向提取介質(zhì)擴(kuò)散的傳質(zhì)阻力，從而有利于有效成分的溶出。又因纖維素和半纖維素是細(xì)胞壁的主要成分，用纖維素酶和半纖維素酶處理，能使其細(xì)胞壁疏松、破裂，有利于細(xì)胞內(nèi)的化合物游離出來(lái)。此外，蛋白酶能水解植物中的蛋白，促使細(xì)胞釋放更多的三萜，故本發(fā)明實(shí)施例中優(yōu)選采用復(fù)合酶對(duì)原料進(jìn)行酶解，以在固定時(shí)間內(nèi)對(duì)多種物質(zhì)同時(shí)進(jìn)行酶解，提高酶解效率。其中復(fù)合酶例如可以包括纖維素酶、半纖維素酶和木瓜蛋白酶，也可以包括菠蘿蛋白酶和果膠酶中的至少一種。具體的，例如可以將粉碎后的靈芝子實(shí)體與纖維素酶、半纖維素酶和木瓜蛋白酶混合，并于pH為5-6、溫度為36-45℃的條件下酶解1-3h。為了提高酶解效率，本發(fā)明實(shí)施例中優(yōu)選酶活分別為45000-55000u/g、150000-250000u/g、750000-850000u/g的纖維素酶、半纖維素酶和木瓜蛋白酶。在提高酶解效率的同時(shí)為了避免出現(xiàn)酶浪費(fèi)的現(xiàn)象，優(yōu)選的，酶解過(guò)程中加入的纖維素酶與靈芝子實(shí)體的重量比為2-4:100，半纖維素酶與靈芝子實(shí)體的重量比為3-5:100，木瓜蛋白酶與靈芝子實(shí)體的重量比為2-4:100。此外，因酶解時(shí)間過(guò)短或酶解溫度過(guò)低會(huì)造成有效物質(zhì)溶出率低，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或酶解溫度過(guò)高又會(huì)使得植物細(xì)胞中的油脂、鞣質(zhì)等雜質(zhì)過(guò)多的溶出，增大分離純化的難度，故酶解時(shí)間優(yōu)選為2h，酶解溫度優(yōu)選為37℃。此外，在酶解過(guò)程中，還可以對(duì)酶解體系進(jìn)行適當(dāng)攪拌，以提高有效物質(zhì)的溶出率。因本發(fā)明實(shí)施例中所用酶的最適pH在5-6范圍內(nèi)，為了調(diào)節(jié)酶解體系的pH，還可以向該體系中加入磷酸緩沖液進(jìn)行調(diào)節(jié)。
作為優(yōu)選的，本發(fā)明實(shí)施例中例如可以采用高溫滅酶活方法停止酶解反應(yīng)，即可以將酶解體系置于85-100℃的水中加熱8-15min，較佳的，可以將酶解體系置于90℃的水中加熱10min，此條件下，可以使酶解產(chǎn)物的得率最高，避免酶解不充分的情況。
為了避免靈芝子實(shí)體中脂肪類(lèi)物質(zhì)對(duì)提取三萜物質(zhì)的影響，還可以在酶解前對(duì)靈芝子實(shí)體進(jìn)行脫脂處理，即于粉碎后的靈芝子實(shí)體中加入乙醚或石油醚進(jìn)行脫脂，脫脂后再與纖維素酶、半纖維素酶和木瓜蛋白酶混合，較佳的，靈芝子實(shí)體與乙醚或石油醚的比例為1g:150-250mL，此比例條件下，乙醚或石油醚對(duì)靈芝子實(shí)體的脫脂效果最佳。
酶解后，為了進(jìn)一步提高三萜物質(zhì)的提取率，例如還可以對(duì)酶解所得的酶解物進(jìn)行乙醇回流提取。具體的，可以向酶解物中加入質(zhì)量濃度為93-97％的乙醇-水溶液，并于75-85℃條件下回流提取1-3h。其中，有機(jī)溶劑選自乙醇-水溶液，既能保證提取速度快、提取物的純度高、雜質(zhì)少，而且成本低。優(yōu)選的，乙醇-水溶液中乙醇的質(zhì)量濃度為95％，此質(zhì)量分?jǐn)?shù)下乙醇溶液的極性適中，使得靈芝子實(shí)體中的絕大部分有效成分易溶于該溶液中，提取較快且雜質(zhì)較少。此外，有機(jī)溶劑還可以是甲醇-水溶液等。為了使三萜物質(zhì)的活性最佳，本發(fā)明實(shí)施例中回流提取的溫度優(yōu)選為80℃。
回流提取后，例如可以對(duì)提取物進(jìn)行過(guò)濾以去除殘?jiān)瑵饪s濾液得到上樣物。其中，過(guò)濾可以是抽濾，也可以是離心過(guò)濾等方式。
進(jìn)一步的，對(duì)上樣物進(jìn)行純化。優(yōu)選的，本發(fā)明實(shí)施例中的上樣方法優(yōu)選為濕法上樣，即將上樣物溶解于溶劑后再進(jìn)行上樣，以提高純化效果。具體的，可以按料液比例如1g:1-6mL將上樣物分散于水中，得到上樣溶液，繼而采用色譜法中的柱層析方法對(duì)上樣溶液進(jìn)行純化分離。具體而言，色譜法是利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配，以流動(dòng)相對(duì)固定相中的混合物進(jìn)行洗脫，混合物中不同的物質(zhì)會(huì)以不同的速度沿固定相移動(dòng)，最終達(dá)到分離的效果。作為優(yōu)選的，本實(shí)施例中的層析柱選用大孔吸附樹(shù)脂層析柱，其吸附的實(shí)質(zhì)為一種物體高度分散或表面分子受作用力不均等而產(chǎn)生的表面吸附現(xiàn)象，這種吸附性能是由于范德華引力或生成氫鍵的結(jié)果。同時(shí)由于大孔吸附樹(shù)脂的多孔結(jié)構(gòu)使其對(duì)分子大小不同的物質(zhì)具有篩選作用。通過(guò)上述這種吸附和篩選原理，有機(jī)化合物根據(jù)吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附樹(shù)脂上經(jīng)一定溶劑洗脫而達(dá)到分離、純化、除雜、濃縮等不同目的。
較佳的，上述的大孔吸附樹(shù)脂層析柱中的填料優(yōu)選為D101填料，其實(shí)質(zhì)為苯乙烯型非極性共聚體。該類(lèi)型的填料吸附量高、顆粒均勻、機(jī)械強(qiáng)度好、不易破碎且殘留物少，且對(duì)有機(jī)物選擇性好。本實(shí)施例中用其可以對(duì)上樣物起到脫鹽的作用。
進(jìn)一步的，向大孔吸附樹(shù)脂層析柱中加入洗脫劑，并對(duì)上樣溶液進(jìn)行等度洗脫。其中，洗脫劑例如可以選自94-96wt％醇-水溶液，綜合考慮成本及分離效果，優(yōu)選為95wt％的乙醇-水溶液。較佳的，洗脫劑與上樣物的比例可以為400-1000mL:1g，洗脫劑的流速可以是0.5-0.8mL/min，此比例和流速下活性成分的分離效果和提取率均最佳。此外，還可以采用香草醛-高氯酸法輔助檢測(cè)洗脫液中是否含有靈芝三萜。
收集洗脫后的液體，干燥后除去該液體中的有機(jī)相等物質(zhì)，得到靈芝三萜。其中，干燥可以是將洗脫后的液體減壓濃縮后進(jìn)行冷凍干燥。作為優(yōu)選的，本發(fā)明實(shí)施例中例如可以將洗脫后的液體于50-53℃的水浴、轉(zhuǎn)速為50-55轉(zhuǎn)/min、以及真空度為0.07-0.09MPa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，該條件下進(jìn)行的減壓濃縮，有利于在回收溶劑時(shí)避免三萜物質(zhì)的結(jié)構(gòu)受到破壞。用紫外分光光度計(jì)對(duì)靈芝三萜含量進(jìn)行測(cè)定，以重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，本發(fā)明實(shí)施例中該靈芝三萜的重量例如占靈芝子實(shí)體重量的1-5％。
上述的靈芝三萜可以用于制備靈芝保健品，用于睡眠保健等功效。據(jù)此本發(fā)明還涉及一種靈芝保健品，該保健品包括采用上述方法提取而得的靈芝三萜，由于通過(guò)上述方法制得的靈芝三萜純度高，因此該靈芝保健品具有保健效果好，毒副作用小的特點(diǎn)。
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
實(shí)施例1
將1g新鮮靈芝子實(shí)體粉碎至粒度為30目，以重量比為100:2:3:2與酶活分別為45000u/g、150000u/g和750000u/g的纖維素酶、半纖維素酶和木瓜蛋白酶混合，于pH為5、溫度為36℃的條件下酶解3h后，將酶解體系置于85℃的水中加熱15min，向酶解物中加入93wt％的乙醇-水溶液，并于75℃條件下回流提取3h。對(duì)提取物進(jìn)行抽濾，濃縮濾液得到上樣物。按料液比1g:1mL將上樣物分散于水中，得到上樣溶液。采用填料為D101的大孔吸附樹(shù)脂層析柱對(duì)上樣物進(jìn)行脫鹽，并以400mL:1g的比例向該層析柱中加入94wt％的乙醇-水溶液作為洗脫劑，對(duì)上樣物進(jìn)行等度洗脫，洗脫流速為0.5mL/min。收集洗脫后的液體，于50℃的水浴、轉(zhuǎn)速為50轉(zhuǎn)/min、以及真空度為0.07MPa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后再進(jìn)行冷凍干燥，得靈芝三萜，稱(chēng)量計(jì)重得該靈芝三萜的重量占靈芝子實(shí)體重量的1.2％。
實(shí)施例2
將1g新鮮靈芝子實(shí)體進(jìn)行除雜、清洗，于20℃下干燥后粉碎至粒度為50目，以1g:150mL的比例向子實(shí)體中加入乙醚進(jìn)行脫脂。以重量比為100:4:5:4將脫脂后的子實(shí)體與酶活分別為55000u/g、250000u/g和850000u/g的纖維素酶、半纖維素酶和木瓜蛋白酶混合，于pH為6、溫度為45℃的條件下酶解1h后，將酶解體系置于100℃的水中加熱8min，向酶解物中加入97wt％的乙醇-水溶液，并于85℃條件下回流提取1h。對(duì)提取物進(jìn)行離心過(guò)濾，濃縮濾液得到上樣物。按料液比1g:6mL將上樣物分散于水中，得到上樣溶液。采用填料為D101的大孔吸附樹(shù)脂層析柱對(duì)上樣物進(jìn)行脫鹽，并以1000mL:1g的比例向該層析柱中加入96wt％的乙醇-水溶液作為洗脫劑，對(duì)上樣物進(jìn)行等度洗脫，洗脫流速為0.8mL/min。收集洗脫后的液體，于53℃的水浴、轉(zhuǎn)速為55轉(zhuǎn)/min、以及真空度為0.09MPa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后再進(jìn)行冷凍干燥，得靈芝三萜，稱(chēng)量計(jì)重得該靈芝三萜的重量占靈芝子實(shí)體重量的1.5％。
實(shí)施例3
將1g新鮮靈芝子實(shí)體進(jìn)行除雜、清洗，于45℃下干燥后粉碎至粒度為40目，以1g:250mL的比例向子實(shí)體中加入石油醚進(jìn)行脫脂。以重量比為100:3:4:3將脫脂后的子實(shí)體與酶活分別為50000u/g、200000u/g和800000u/g的纖維素酶、半纖維素酶和木瓜蛋白酶混合，于pH為5.5、溫度為40.5℃的條件下酶解2h后，將酶解體系置于92.5℃的水中加熱11.5min，向酶解物中加入95wt％的乙醇-水溶液，并于80℃條件下回流提取2h。對(duì)提取物進(jìn)行抽濾過(guò)濾，濃縮濾液得到上樣物。按料液比1g:3.5mL將上樣物分散于水中，得到上樣溶液。采用填料為D101的大孔吸附樹(shù)脂層析柱對(duì)上樣物進(jìn)行脫鹽，并以700mL:1g的比例向該層析柱中加入95wt％的乙醇-水溶液作為洗脫劑，對(duì)上樣物進(jìn)行等度洗脫，洗脫流速為0.65mL/min。收集洗脫后的液體，于51.5℃的水浴、轉(zhuǎn)速為53轉(zhuǎn)/min、以及真空度為0.08MPa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后再進(jìn)行冷凍干燥，得靈芝三萜，稱(chēng)量計(jì)重得該靈芝三萜的重量占靈芝子實(shí)體重量的2.0％。
實(shí)施例4
將1g新鮮靈芝子實(shí)體進(jìn)行除雜、清洗，于32.5℃下干燥后粉碎至粒度為40目，以1g:200mL的比例向子實(shí)體中加入乙醚進(jìn)行脫脂。以重量比為100:3將脫脂后的子實(shí)體與菠蘿蛋白酶混合，加入磷酸緩沖液調(diào)節(jié)混合體系的pH為5.5，將該體系于40.5℃的條件下酶解2h后，將酶解體系置于92.5℃的水中加熱11.5min，向酶解物中加入95wt％的甲醇-水溶液，并于80℃條件下回流提取2h。對(duì)提取物進(jìn)行抽濾過(guò)濾，濃縮濾液得到上樣物。按料液比1g:3.5mL將上樣物分散于水中，得到上樣溶液。采用填料為D101的大孔吸附樹(shù)脂層析柱對(duì)上樣物進(jìn)行脫鹽，并以700mL:1g的比例向該層析柱中加入95wt％的乙醇-水溶液作為洗脫劑，對(duì)上樣物進(jìn)行等度洗脫，洗脫流速為0.65mL/min。收集洗脫后的液體，于51.5℃的水浴、轉(zhuǎn)速為53轉(zhuǎn)/min、以及真空度為0.08MPa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后再進(jìn)行冷凍干燥，得靈芝三萜，稱(chēng)量計(jì)重得該靈芝三萜的重量占靈芝子實(shí)體重量的0.8％。
實(shí)施例5
將1g新鮮靈芝子實(shí)體進(jìn)行除雜、清洗，于37℃下干燥后粉碎至粒度為40目，以1g:200mL的比例向子實(shí)體中加入石油醚進(jìn)行脫脂。以重量比為100:3將脫脂后的子實(shí)體與果膠酶混合，加入磷酸緩沖液調(diào)節(jié)混合體系的pH為5.5，將該體系于37℃的條件下酶解2h后，將酶解體系置于90℃的水中加熱10min，向酶解物中加入95wt％的乙醇-水溶液，并于80℃條件下回流提取2h。對(duì)提取物進(jìn)行離心過(guò)濾，濃縮濾液得到上樣物。按料液比1g:4mL將上樣物分散于水中，得到上樣溶液。采用填料為D101的大孔吸附樹(shù)脂層析柱對(duì)上樣物進(jìn)行脫鹽，并以800mL:1g的比例向該層析柱中加入95wt％的乙醇-水溶液作為洗脫劑，對(duì)上樣物進(jìn)行等度洗脫，洗脫流速為0.65mL/min。收集洗脫后的液體，于52℃的水浴、轉(zhuǎn)速為55轉(zhuǎn)/min、以及真空度為0.09MPa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后再進(jìn)行冷凍干燥，得靈芝三萜，稱(chēng)量計(jì)重得該靈芝三萜的重量占靈芝子實(shí)體重量的0.9％。
實(shí)施例6
將1g新鮮靈芝子實(shí)體進(jìn)行除雜、清洗，于37℃下干燥后粉碎至粒度為40目，以1g:200mL的比例向子實(shí)體中加入乙醚進(jìn)行脫脂。以重量比為100:3:4:3:1:1將脫脂后的子實(shí)體與酶活分別為50000u/g、200000u/g和800000u/g的纖維素酶、半纖維素酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和果膠酶混合，加入磷酸緩沖液調(diào)節(jié)混合體系的pH為5.5，將該體系于37℃的條件下酶解2h后，將酶解體系置于90℃的水中加熱10min，向酶解物中加入95wt％的乙醇-水溶液，并于80℃條件下回流提取2h。對(duì)提取物進(jìn)行離心過(guò)濾，濃縮濾液得到上樣物。按料液比1g:4mL將上樣物分散于水中，得到上樣溶液。采用填料為D101的大孔吸附樹(shù)脂層析柱對(duì)上樣物進(jìn)行脫鹽，并以800mL:1g的比例向該層析柱中加入95wt％的乙醇-水溶液作為洗脫劑，對(duì)上樣物進(jìn)行等度洗脫，洗脫流速為0.65mL/min。收集洗脫后的液體，于52℃的水浴、轉(zhuǎn)速為55轉(zhuǎn)/min、以及真空度為0.09MPa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后再進(jìn)行冷凍干燥，得靈芝三萜，稱(chēng)量計(jì)重得該靈芝三萜的重量占靈芝子實(shí)體重量的2.5％。
重復(fù)實(shí)施上述實(shí)施例1-6，提取足夠多的靈芝三萜，并以按上述各實(shí)施例提取所得的靈芝三萜分別作為試驗(yàn)組1-6，以普通提取方法中的有機(jī)溶劑法提取和超聲法提取所得的靈芝三萜作為對(duì)照組1和對(duì)照組2，分別對(duì)1g靈芝子實(shí)體所提取出的靈芝三萜占靈芝子實(shí)體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和純度進(jìn)行對(duì)比，其結(jié)果如表1所示：
表1靈芝三萜的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和純度
由表1可以看出，以同一重量的靈芝子實(shí)體作為原料，通過(guò)本發(fā)明實(shí)施例的提取方法所提取出的靈芝三萜的含量比普通提取方法所提取出的靈芝三萜的含量要高。其原因在于本發(fā)明實(shí)施例中通過(guò)結(jié)合酶解法和乙醇回流對(duì)原料中的活性物質(zhì)進(jìn)行酶解和提取，并在酶解過(guò)程中同時(shí)采用纖維素酶、半纖維素酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行混合酶解，提高了酶解效果和提取率。此外，通過(guò)采用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)提取物進(jìn)行脫鹽和洗脫，進(jìn)一步對(duì)提取物進(jìn)行了分離和純化，提高了提取所得的靈芝三萜的純度。對(duì)比實(shí)施例1-6所提取而得的靈芝三萜，可以看出，實(shí)施例4和實(shí)施例5中靈芝三萜的得率低于其余4組實(shí)施例中靈芝三萜的得率，其原因在于實(shí)施例4和實(shí)施例5的酶解過(guò)程只采用了菠蘿蛋白酶和果膠酶中的單一酶進(jìn)行酶解，而其余4組實(shí)施例中均采用的是復(fù)合酶進(jìn)行酶解，提高了酶解效果；實(shí)施例6所提取出的靈芝三萜得率和純度均最高，其原因在于，該實(shí)施例中，酶解過(guò)程中將纖維素酶、半纖維素酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和果膠酶共同作用，充分酶解了靈芝子實(shí)體中的三萜物質(zhì)，此外，該實(shí)施例中復(fù)合酶的酶活較高，且各物質(zhì)的加入量適中、配比的當(dāng)，酶解、提取和純化等過(guò)程中各參數(shù)也為最優(yōu)值，故該實(shí)施例所備出的靈芝三萜的得率和純度均最高。
將上述各實(shí)施例1-6獲得的靈芝三萜分別制成靈芝保健品，將分別包括由實(shí)施例1-6所制備出的靈芝三萜的靈芝保健品作為試驗(yàn)組1-6，以市售的靈芝保健品做對(duì)照組，在含有等量靈芝三萜的條件下，隨機(jī)調(diào)研100人，18-25歲年齡段的30％，26-40歲年齡段的40％，41-60歲年齡段的20％，61-80歲年齡段的10％為受試者，受試者分別口服試驗(yàn)組和對(duì)照組中的靈芝保健品，對(duì)比口服2h后，受試者的睡眠發(fā)生率，其結(jié)果如表2所示：
表2靈芝保健品對(duì)不同年齡段人群的睡眠發(fā)生率
由表2可以看出，試驗(yàn)組的靈芝保健品較對(duì)照組的靈芝保健品對(duì)不同年齡段人群的睡眠發(fā)生率均更高，說(shuō)明試驗(yàn)組的靈芝保健品起到的促進(jìn)睡眠的效果更好。其中，實(shí)施例6的靈芝保健品促進(jìn)睡眠效果最為顯著，其原因在于該實(shí)施例保健品所含的靈芝三萜的純度最高。
綜上所述，本發(fā)明實(shí)施例的靈芝三萜的提取方法簡(jiǎn)單、條件溫和、易操作、成本低、耗時(shí)短且得率高。含有該提取方法提取出的靈芝三萜的靈芝保健品保健效果好，毒副作用小。
以上所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。