1.一種蘋果酵素的制備方法,其特征在于所述的制備方法即以新鮮成熟度好的蘋果為主材料,以畢赤酵母菌Pichia kudriavzevii PKD 3001和植物乳桿菌Lactobacillus plantarum C2001為第一次發(fā)酵菌株、滬釀1.01醋酸菌為第二次發(fā)酵菌株通過兩次發(fā)酵制備而成,該制備方法具體包括以下步驟:
(1)、菌種的選取
所用的植物乳桿菌Lactobacillus plantarum C2001,是2016年1月18日于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的,其保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2016045的植物乳桿菌Lactobacillus plantarum C2001冷凍干燥管;
所用的畢赤酵母菌Pichia kudriavzevii PKD 3001,是2016年9月29日于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的,其保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2016537的畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD 3001冷凍干燥管;
所用的滬釀1.01醋酸菌為巴氏醋酸桿菌巴氏亞種Acetobacter pasteurianus subsp. Pasteurianus De Ley et Frateur,購(gòu)買自上海市釀造科學(xué)研究所;
(2)、發(fā)酵原料液的制備;
將新鮮、成熟度好的蘋果用自來水清洗干凈后經(jīng)吹干、去核、用榨汁機(jī)進(jìn)行榨汁、用100目紗布過濾得到蘋果汁,然后與純凈水混合,得到原料混合物,其中蘋果汁與純凈水的比例,按體積百分比計(jì)算,蘋果汁:純凈水5-20%:80-95%;
在上述所得的原料混合物中再加入為原料混合物總重量1-5%的葡萄糖,經(jīng)1mol/L食用碳酸鈉水溶液調(diào)pH值為5.0-7.0,然后于105℃滅菌10min得到發(fā)酵原料液;
(3)、菌種活化
用接種環(huán)取無菌水溶解的冷凍干燥管保存的畢赤酵母亞種Pichia kudriavzevii PKD 3001菌種一環(huán)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上劃線,在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,得到平板活化畢赤酵母菌菌種;
用接種環(huán)取無菌水溶解的冷凍干燥管保存的植物乳桿菌Lactobacillus plantarumC2001菌種一環(huán)在乳酸菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上劃線,在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,得到平板活化植物乳桿菌菌種;
用接種環(huán)取無菌水溶解的滬釀1.01醋酸菌菌種一環(huán)在醋酸菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上劃線,在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,得到平板活化醋酸菌菌種;
(4)、種子培養(yǎng)
用接種環(huán)取步驟(3)所得的平板活化畢赤酵母菌菌種一環(huán)接入裝有50ml 麥芽浸粉肉湯液體培養(yǎng)基的250ml規(guī)格的三角瓶中,置于溫度30℃的培養(yǎng)箱中,然后控制轉(zhuǎn)速為120rpm,恒溫培養(yǎng)36h,離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗后,加入50mL 0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體,得到畢赤酵母菌種子液,每毫升畢赤酵母菌種子液中含畢赤酵母菌種1×106-1×109 cfu;
用接種環(huán)取步驟(3)所得的平板活化植物乳桿菌菌種一環(huán)接入裝有50ml 乳酸菌肉湯培養(yǎng)基的250ml規(guī)格的三角瓶中,置于溫度37℃的培養(yǎng)箱中,恒溫培養(yǎng)36h,離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗后,加入50mL 0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體,得到植物乳桿菌種子液,每毫升植物乳桿菌種子液中含植物乳桿菌種1×107-1×1010 cfu;
用接種環(huán)取步驟(3)所得的平板活化醋酸菌菌種一環(huán)接入裝有50ml醋酸菌液體培養(yǎng)基的250ml規(guī)格的三角瓶中,置于溫度30℃的培養(yǎng)箱中,然后控制轉(zhuǎn)速為120rpm,恒溫培養(yǎng)36h,離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗后,加入50mL 0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體,得到醋酸菌種子液,每毫升醋酸菌種子液中含醋酸菌種1×106-1×108 cfu;
(5)、發(fā)酵培養(yǎng)
首先,將畢赤酵母菌種子液和植物乳桿菌種子液按體積比,即畢赤酵母菌種子液:植物乳桿菌種子液1:1-5的比例進(jìn)行混合,得到畢赤酵母菌和植物乳桿菌混合種子液;
然后,按步驟(2)所得的發(fā)酵原料液體積的1-5%的比例,在步驟(2)所得的發(fā)酵原料液中加入上述所得的畢赤酵母菌和植物乳桿菌混合種子液,控制溫度為25-35℃、轉(zhuǎn)速100-200rpm進(jìn)行恒溫發(fā)酵12-48h,得到第一次發(fā)酵液;
然后,按第一次發(fā)酵液體積的1-10%的比例,在第一次發(fā)酵液中加入醋酸菌種子液,控制溫度25-35℃、轉(zhuǎn)速100-200rpm進(jìn)行第二次發(fā)酵12-36h,得到第二次發(fā)酵液;
(6)、滅菌
將步驟(5)所得的第二次發(fā)酵液于121℃下殺菌20min,然后灌裝,即得到蘋果酵素。
2.如權(quán)利要求1所述的一種蘋果酵素的制備方法,其特征在于步驟(2)中發(fā)酵原料液的制備中,所述原料混合物,其中蘋果汁與純凈水的比例,按體積百分比計(jì)算,蘋果汁:純凈水為5%:95%;
在上述所得的原料混合物中再加入為原料混合物總重量3%的葡萄糖,經(jīng)1mol/L食用碳酸鈉水溶液調(diào)pH值為7.0,然后于105℃滅菌10min得到發(fā)酵原料液;
步驟(5)發(fā)酵培養(yǎng)中:
首先,將畢赤酵母菌種子液和植物乳桿菌種子液按體積比,即畢赤酵母菌種子液:植物乳桿菌種子液為1:1的比例進(jìn)行混合,得到畢赤酵母菌和植物乳桿菌混合種子液;
然后,按步驟(2)所得的發(fā)酵原料液體積的2%的比例,在步驟(2)所得的發(fā)酵原料液中加入上述所得的畢赤酵母菌和植物乳桿菌混合種子液,控制溫度為25℃、轉(zhuǎn)速200rpm進(jìn)行第一發(fā)酵24h,得到第一次發(fā)酵液;
然后,按第一次發(fā)酵液體積的5%的比例,在第一次發(fā)酵液中加入醋酸菌種子液,控制溫度30℃、轉(zhuǎn)速100rpm進(jìn)行二次發(fā)酵12h,得到第二次發(fā)酵液。
3.如權(quán)利要求1所述的一種蘋果酵素的制備方法,其特征在于步驟(2)發(fā)酵原料液的制備中:所述原料混合物,其中蘋果汁與純凈水的比例,按體積百分比計(jì)算,蘋果汁:純凈水為10%:90%;
在上述所得的原料混合物中再加入為原料混合物總重量1%的葡萄糖,經(jīng)1mol/L食用碳酸鈉水溶液調(diào)pH值為5.0,然后于105℃滅菌10min得到發(fā)酵原料液;
步驟(5)發(fā)酵培養(yǎng)中:
首先,將畢赤酵母菌種子液和植物乳桿菌種子液按體積比,即畢赤酵母菌種子液:植物乳桿菌種子液為1:2的比例進(jìn)行混合,得到畢赤酵母菌和植物乳桿菌混合種子液;
然后,按步驟(2)所得的發(fā)酵原料液體積的1%的比例,在步驟(2)所得的發(fā)酵原料液中加入上述所得的畢赤酵母菌和植物乳桿菌混合種子液,控制溫度為30℃、轉(zhuǎn)速100rpm進(jìn)行第一次發(fā)酵12h,得到第一次發(fā)酵液;
然后,按第一次發(fā)酵液體積的1%的比例,在第一次發(fā)酵液中加入醋酸菌種子液,控制溫度25℃、轉(zhuǎn)速150rpm進(jìn)行第二次發(fā)酵24h,得到第二次發(fā)酵液。
4.如權(quán)利要求1所述的一種蘋果酵素的制備方法,其特征在于步驟(2)發(fā)酵原料液的制備中:所述原料混合物,其中蘋果汁與純凈水的比例,按體積百分比計(jì)算,蘋果汁:純凈水為20%:80%;
在上述所得的原料混合物中再加入為原料混合物總重量5%的葡萄糖,經(jīng)1mol/L食用碳酸鈉水溶液調(diào)pH值為6.2,然后于105℃滅菌10min得到發(fā)酵原料液;
步驟(5)發(fā)酵培養(yǎng)中:
首先,將畢赤酵母菌種子液和植物乳桿菌種子液按體積比,即畢赤酵母菌種子液:植物乳桿菌種子液為1:5的比例進(jìn)行混合,得到畢赤酵母菌和植物乳桿菌混合種子液;
然后,按步驟(2)所得的發(fā)酵原料液體積的5%的比例,在步驟(2)所得的發(fā)酵原料液中加入上述所得的畢赤酵母菌和植物乳桿菌混合種子液,控制溫度為35℃、轉(zhuǎn)速130rpm進(jìn)行第一次發(fā)酵48h,得到第一次發(fā)酵液;
然后,按第一次發(fā)酵液體積的10%的比例,在第一次發(fā)酵液中加入醋酸菌種子液,控制溫度35℃、轉(zhuǎn)速200rpm進(jìn)行第二次發(fā)酵36h,得到第二次發(fā)酵液。
5.如權(quán)利要求1、2、3或4的制備方法所得的一種蘋果酵素。
6.如權(quán)利要求1、2、3或4的制備方法所得的一種蘋果酵素在抑制痤瘡丙酸桿菌中的應(yīng)用。