本發(fā)明涉及一種蘋果酵素及其制備方法與應(yīng)用，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：根據(jù)中國(guó)生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)的定義，酵素是指以果蔬或其他動(dòng)、植物等為原料，采用自然或人工接種微生物發(fā)酵工藝，后經(jīng)提取所制得的具有某些特定功能的發(fā)酵制品。酵素不僅保存了發(fā)酵原料中原有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如多酚類、黃酮類、花青素等，而且通過有益菌的發(fā)酵代謝產(chǎn)生了一些新的生物活性成分，如有機(jī)酸，氨基酸等。與發(fā)酵前相比，微生物的轉(zhuǎn)化使得這些小分子物質(zhì)更易于人體吸收。近十年，微生物酵素功能性制品產(chǎn)業(yè)在全球開始大規(guī)模興起，產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大。日本、臺(tái)灣等地區(qū)開始采用純種發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)。純種發(fā)酵是在成分單一的發(fā)酵基質(zhì)中，僅接入一種或幾種微生物，通過對(duì)該微生物的培養(yǎng)，得到純度較高的單一性產(chǎn)物。不同于自然發(fā)酵，其發(fā)酵時(shí)間短，易控制，十分適合酵素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。但是為使發(fā)酵順利進(jìn)行，要求人工擴(kuò)大的菌種不得被污染。因而對(duì)發(fā)酵設(shè)備和環(huán)境要求較高，要有嚴(yán)格的滅菌措施和空氣凈化系統(tǒng)。發(fā)酵用菌種也必須是經(jīng)嚴(yán)格研究后篩選出的最適合生產(chǎn)的菌種。蘋果酵素不僅保持了蘋果原初營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味，還將賦予其益生菌所產(chǎn)生的抗氧化活性，為消費(fèi)者提供新的功能性產(chǎn)品。但目前的水果酵素制作主要存在：發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，影響水果原料穩(wěn)定性；發(fā)酵菌種性能和穩(wěn)定性差，影響酵素中天然的活性物質(zhì)等問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是為了解決現(xiàn)有水果酵素生產(chǎn)過程中發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)影響酵素活性，菌種性能不穩(wěn)定等問題而提供一種蘋果酵素的制備方法，該蘋果酵素的制備方法具有生產(chǎn)過程中發(fā)酵時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的目的之二是提供上述一種制備方法所得的蘋果酵素，該蘋果酵素具有抗氧化活性高，且能有效抑制痤瘡丙酸桿菌生長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，適合應(yīng)用于飲料和化妝品領(lǐng)域。本發(fā)明采用的技術(shù)方案一種蘋果酵素，即以新鮮成熟度好的蘋果為主材料，以畢赤酵母菌PichiakudriavzeviiPKD3001和植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001為第一次發(fā)酵菌株、滬釀1.01醋酸菌為第二次發(fā)酵菌株通過兩次發(fā)酵制備而成，該制備方法具體包括以下步驟：（1）、菌種的選取本發(fā)明所用的植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001，是2016年1月18日于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的，其保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2016045的植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001冷凍干燥管；本發(fā)明所用的畢赤酵母菌PichiakudriavzeviiPKD3001，是2016年9月29日于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的，其保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2016537的畢赤酵母亞種PichiakudriavzeviiPKD3001冷凍干燥管；本發(fā)明所用的滬釀1.01醋酸菌為巴氏醋酸桿菌巴氏亞種Acetobacterpasteurianussubsp.PasteurianusDeLeyetFrateur，購(gòu)買自上海市釀造科學(xué)研究所；（2）、發(fā)酵原料液的制備將新鮮、成熟度好的蘋果用自來水清洗干凈后經(jīng)吹干、去核、用榨汁機(jī)進(jìn)行榨汁、用100目紗布過濾得到蘋果汁，然后與純凈水混合，得到原料混合物，其中蘋果汁與純凈水的比例，按體積百分比計(jì)算，蘋果汁：純凈水為5-20%：80-95%；在上述所得的原料混合物中再加入為原料混合物總重量1-5%的葡萄糖，經(jīng)1mol/L食用碳酸鈉水溶液調(diào)pH值為5.0-7.0，然后于105℃滅菌10min得到發(fā)酵原料液；（3）、菌種活化用接種環(huán)取無菌水溶解的冷凍干燥管保存的畢赤酵母亞種PichiakudriavzeviiPKD3001菌種一環(huán)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上劃線，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得到平板活化畢赤酵母菌菌種；用接種環(huán)取無菌水溶解的冷凍干燥管保存的植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001菌種一環(huán)在乳酸菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上劃線，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得到平板活化植物乳桿菌菌種；用接種環(huán)取無菌水溶解的滬釀1.01醋酸菌一環(huán)在醋酸菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上劃線，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得到平板活化醋酸菌菌種；（4）、種子培養(yǎng)用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化畢赤酵母菌菌種一環(huán)接入裝有50ml麥芽浸粉肉湯液體培養(yǎng)基的250ml規(guī)格的三角瓶中，置于溫度30℃的培養(yǎng)箱中，然后控制轉(zhuǎn)速為120rpm，恒溫培養(yǎng)36h，離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗后，加入50mL0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到畢赤酵母菌種子液，每毫升畢赤酵母菌種子液中含畢赤酵母菌種1×106-1×109cfu；用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化植物乳桿菌菌種一環(huán)接入裝有50ml乳酸菌肉湯培養(yǎng)基的250ml規(guī)格的三角瓶中，置于溫度37℃的培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)36h，離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗后，加入50mL0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到植物乳桿菌種子液，每毫升植物乳桿菌種子液中含植物乳桿菌種1×107-1×1010cfu；用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化醋酸菌菌種一環(huán)接入裝有50ml醋酸菌液體培養(yǎng)基的250ml規(guī)格的三角瓶中，置于溫度30℃的培養(yǎng)箱中，然后控制轉(zhuǎn)速為120rpm，恒溫培養(yǎng)36h，離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗后，加入50mL0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到醋酸菌種子液，每毫升醋酸菌種子液中含醋酸菌種1×106-1×108cfu；（5）、發(fā)酵培養(yǎng)首先，將畢赤酵母菌種子液和植物乳桿菌種子液按體積比，即畢赤酵母菌種子液：植物乳桿菌種子液為1：1-5的比例進(jìn)行混合，得到畢赤酵母菌和植物乳桿菌混合種子液；然后，按步驟（2）所得的發(fā)酵原料液體積的1-5%的比例，在步驟（2）所得的發(fā)酵原料液中加入上述所得的畢赤酵母菌和植物乳桿菌混合種子液，控制溫度為25-35℃、轉(zhuǎn)速100-200rpm進(jìn)行第一次發(fā)酵12-48h，得到第一次發(fā)酵液；然后，按第一次發(fā)酵液體積的1-10%的比例，在第一次發(fā)酵液中加入醋酸菌種子液，控制溫度25-35℃、轉(zhuǎn)速100-200rpm進(jìn)行第二次發(fā)酵12-36h，得到第二次發(fā)酵液；（6）、滅菌將步驟（5）所得的第二次發(fā)酵液于121℃下殺菌20min，然后灌裝，即得到蘋果酵素。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的一種蘋果酵素，由于制備采用的原料蘋果是純天然的，利用低溫殺菌、嚴(yán)格控制發(fā)酵溫度，有效的降低了蘋果酵素營(yíng)養(yǎng)成分的損失，最大限度保留了蘋果酵素活性。進(jìn)一步，本發(fā)明的一種蘋果酵素，由于制備過程所用的發(fā)酵時(shí)間控制在80h以內(nèi)，從而避免了蘋果本身含有的風(fēng)味物質(zhì)和酵素物質(zhì)的損失。進(jìn)一步，本發(fā)明的一種蘋果酵素是以畢赤酵母菌PichiakudriavzeviiPKD3001和植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001組成混合菌種為第一次發(fā)酵菌株、滬釀1.01醋酸菌為第二次發(fā)酵菌株通過兩次發(fā)酵制備而成，因此所得蘋果酵素與自然發(fā)酵所得的蘋果酵素相比，能顯著抑制青春痘主要致病菌痤瘡丙酸桿菌的生長(zhǎng)，且其抗氧化活性指標(biāo)提高75%以上，IC50濃度為0.43%，遠(yuǎn)低于在化妝品中可能的限定量(6%以內(nèi))，因此可廣泛應(yīng)用于飲料和化妝品領(lǐng)域。附圖說明圖1、實(shí)施例1，2，3以畢赤酵母菌PichiakudriavzeviiPKD3001和植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001組成混合菌種為第一次發(fā)酵菌株、滬釀1.01醋酸菌為第二次發(fā)酵菌株通過兩次發(fā)酵制備而成的蘋果酵素和對(duì)照實(shí)施例1按自然發(fā)酵的方法所得的蘋果酵素的清除率柱狀圖；圖2、實(shí)施例1中所得的蘋果酵素在體積百分比濃度分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%下，以蘋果酵素的體積百分比濃度為橫坐標(biāo)，以清除率為縱坐標(biāo)所得的蘋果酵素的體積百分比濃度與清除率之間的關(guān)系曲線。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的思路和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的各實(shí)施例中所用的蘋果購(gòu)自上海聯(lián)華超市。本發(fā)明各實(shí)施例中所用的植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001，是2016年1月18日于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的，其保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2016045的植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001冷凍干燥管，保藏機(jī)構(gòu)地址：武漢市武昌珞珈山中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))，郵編：430072；所用的畢赤酵母菌PichiakudriavzeviiPKD3001，是2016年9月29日于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的，其保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2016537的畢赤酵母亞種PichiakudriavzeviiPKD3001冷凍干燥管，保藏機(jī)構(gòu)地址：武漢市武昌珞珈山中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))，郵編：430072；所用的滬釀1.01醋酸菌為巴氏醋酸桿菌巴氏亞種Acetobacterpasteurianussubsp.PasteurianusDeLeyetFrateur，購(gòu)買自上海市釀造科學(xué)研究所。本發(fā)明各實(shí)施例中所用的各種培養(yǎng)基，組成成份如下：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，其組成成份為在每升蒸餾水中加入：馬鈴薯浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g，氯霉素0.1g。乳酸菌瓊脂培養(yǎng)基，其組成成份為在每升蒸餾水中加入：蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐溫801mL，磷酸氫二鉀（7H2O）2.0g，乙酸鈉（3H2O）5.0g，檸檬酸三銨2.0g，硫酸鎂（7H2O）0.2g，硫酸錳（4H2O）0.05g，瓊脂15.0g。醋酸菌瓊脂培養(yǎng)基，其組成成份為在每升蒸餾水中加入：葡萄糖10.0g，酵母膏10.0g，瓊脂25.0g，滅菌后倒培養(yǎng)皿前加入培養(yǎng)基體積2%的95%乙醇。麥芽浸粉肉湯液體培養(yǎng)基，其組成成份為在每升蒸餾水中加入：麥芽浸粉20.0g。乳酸菌肉湯培養(yǎng)基，其組成成份為在每升蒸餾水中加入：蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，吐溫801mL，磷酸氫二鉀2.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸三銨2.0g，硫酸鎂0.1g，硫酸錳0.05g。醋酸菌液體培養(yǎng)基，其組成成份為在每升蒸餾水中加入：葡萄糖10.0g，酵母膏10.0g，使用時(shí)加入培養(yǎng)基體積4%的無水乙醇。實(shí)施例1一種蘋果酵素，即以新鮮成熟度好的蘋果為主材料，以畢赤酵母菌PichiakudriavzeviiPKD3001和植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001為第一次發(fā)酵菌株、滬釀1.01醋酸菌為第二次發(fā)酵菌株通過兩次發(fā)酵制備而成，該制備方法具體包括以下步驟：（1）、菌種的選取植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001冷凍干燥管；畢赤酵母菌PichiakudriavzeviiPKD3001冷凍干燥管；滬釀1.01醋酸菌；（2）、發(fā)酵原料液的制備；將新鮮、成熟度好的蘋果用自來水清洗干凈后經(jīng)吹干、去核、用榨汁機(jī)進(jìn)行榨汁、用100目紗布過濾得到蘋果汁，然后與純凈水混合，得到原料混合物，其中蘋果汁與純凈水的比例，按體積百分比計(jì)算，蘋果汁：純凈水為5%：95%；在上述所得的原料混合物中再加入為原料混合物總重量3%的葡萄糖，經(jīng)1mol/L食用碳酸鈉水溶液調(diào)pH值為7.0，然后于105℃滅菌10min得到發(fā)酵原料液；（3）、菌種活化用接種環(huán)取無菌水溶解的冷凍干燥管保存的畢赤酵母亞種PichiakudriavzeviiPKD3001菌種一環(huán)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上劃線，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得到平板活化畢赤酵母菌菌種；用接種環(huán)取無菌水溶解的冷凍干燥管保存的植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001菌種一環(huán)在乳酸菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上劃線，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得到平板活化植物乳桿菌菌種；用接種環(huán)取無菌水溶解的滬釀1.01醋酸菌一環(huán)在醋酸菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上劃線，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得到平板活化醋酸菌菌種；（4）、種子培養(yǎng)用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化畢赤酵母菌菌種一環(huán)接入裝有50ml麥芽浸粉肉湯液體培養(yǎng)基的250ml規(guī)格的三角瓶中，置于溫度30℃的培養(yǎng)箱中，然后控制轉(zhuǎn)速為120rpm，恒溫培養(yǎng)36h，離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗后，加入50mL0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到畢赤酵母菌種子液，上述每毫升畢赤酵母菌種子液中含畢赤酵母菌種1×106-1×109cfu；用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化植物乳桿菌菌種一環(huán)接入裝有50ml乳酸菌MRS肉湯培養(yǎng)基的250ml規(guī)格的三角瓶中，置于溫度37℃的培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)36h，離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗后，加入50mL0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到植物乳桿菌種子液，上述每毫升植物乳桿菌種子液中含植物乳桿菌種1×107-1×1010cfu；用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化醋酸菌菌種一環(huán)接入裝有50ml醋酸菌液體培養(yǎng)基的250ml規(guī)格的三角瓶中，置于溫度30℃的培養(yǎng)箱中，然后控制轉(zhuǎn)速為120rpm，恒溫培養(yǎng)36h，離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗后，加入50mL0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到醋酸菌種子液，上述每毫升醋酸菌種子液中含醋酸菌種1×106-1×108cfu；（5）、發(fā)酵培養(yǎng)首先，將畢赤酵母菌種子液和植物乳桿菌種子液按體積比，即畢赤酵母菌種子液：植物乳桿菌種子液為1：1的比例進(jìn)行混合，得到畢赤酵母菌和植物乳桿菌混合種子液；然后，按步驟（2）所得的發(fā)酵原料液體積的2%的比例，在步驟（2）所得的發(fā)酵原料液中加入上述所得的畢赤酵母菌和植物乳桿菌混合種子液，控制溫度為25℃、轉(zhuǎn)速200rpm進(jìn)行第一次發(fā)酵24h，得到第一次發(fā)酵液；然后，按第一次發(fā)酵液體積的5%的比例，在第一次發(fā)酵液中加入醋酸菌種子液，控制溫度30℃、轉(zhuǎn)速100rpm進(jìn)行第二次發(fā)酵12h，得到第二次發(fā)酵液；（6）、滅菌將步驟（5）所得的第二次發(fā)酵液于121℃下殺菌20min，然后灌裝，即得到蘋果酵素。實(shí)施例2一種蘋果酵素，即以新鮮成熟度好的蘋果為主材料，以畢赤酵母菌PichiakudriavzeviiPKD3001和植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001為第一次發(fā)酵菌株、滬釀1.01醋酸菌為第二次發(fā)酵菌株通過兩次發(fā)酵制備而成，該制備方法具體包括以下步驟：（1）、菌種的選取植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001冷凍干燥管；畢赤酵母菌PichiakudriavzeviiPKD3001冷凍干燥管；滬釀1.01醋酸菌；（2）、發(fā)酵原料液的制備；將新鮮、成熟度好的蘋果用自來水清洗干凈后經(jīng)吹干、去核、用榨汁機(jī)進(jìn)行榨汁、用100目紗布過濾得到蘋果汁，然后與純凈水混合，得到原料混合物，其中蘋果汁與純凈水的比例，按體積百分比計(jì)算，蘋果汁：純凈水為10%：90%；在上述所得的原料混合物中再加入為原料混合物總重量1%的葡萄糖，經(jīng)1mol/L食用碳酸鈉水溶液調(diào)pH值為5.0，然后于105℃滅菌10min得到發(fā)酵原料液；（3）、菌種活化用接種環(huán)取無菌水溶解的冷凍干燥管保存的畢赤酵母亞種PichiakudriavzeviiPKD3001菌種一環(huán)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上劃線，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得到平板活化畢赤酵母菌菌種；用接種環(huán)取無菌水溶解的冷凍干燥管保存的植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001菌種一環(huán)在乳酸菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上劃線，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得到平板活化植物乳桿菌菌種；用接種環(huán)取無菌水溶解的滬釀1.01醋酸菌一環(huán)在醋酸菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上劃線，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得到平板活化醋酸菌菌種；（4）、種子培養(yǎng)用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化畢赤酵母菌菌種一環(huán)接入裝有50ml麥芽浸粉肉湯液體培養(yǎng)基的250ml規(guī)格的三角瓶中，置于溫度30℃的培養(yǎng)箱中，然后控制轉(zhuǎn)速為120rpm，恒溫培養(yǎng)36h，離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗后，加入50mL0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到畢赤酵母菌種子液，上述每毫升畢赤酵母菌種子液中含畢赤酵母菌種1×106-1×109cfu；用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化植物乳桿菌菌種一環(huán)接入裝有50ml乳酸菌MRS肉湯培養(yǎng)基的250ml規(guī)格的三角瓶中，置于溫度37℃的培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)36h，離心后用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗，然后加入50mL0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到植物乳桿菌種子液，上述每毫升植物乳桿菌種子液中含植物乳桿菌種1×107-1×1010cfu；用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化醋酸菌菌種一環(huán)接入裝有50ml醋酸菌液體培養(yǎng)基的250ml規(guī)格的三角瓶中，置于溫度30℃的培養(yǎng)箱中，然后控制轉(zhuǎn)速為120rpm，恒溫培養(yǎng)36h，離心后用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗，然后加入50mL0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到醋酸菌種子液，上述每毫升醋酸菌種子液中含醋酸菌種1×106-1×108cfu；（5）、發(fā)酵培養(yǎng)首先，將畢赤酵母菌種子液和植物乳桿菌種子液按體積比，即畢赤酵母菌種子液：植物乳桿菌種子液為1：2的比例進(jìn)行混合，得到畢赤酵母菌和植物乳桿菌混合種子液；然后，按步驟（2）所得的發(fā)酵原料液體積的1%的比例，在步驟（2）所得的發(fā)酵原料液中加入上述所得的畢赤酵母菌和植物乳桿菌混合種子液，控制溫度為30℃、轉(zhuǎn)速100rpm進(jìn)行第一次發(fā)酵12h，得到第一次發(fā)酵液；然后，按第一次發(fā)酵液體積的1%的比例，在第一次發(fā)酵液中加入醋酸菌種子液，控制溫度25℃、轉(zhuǎn)速150rpm進(jìn)行第二次發(fā)酵24h，得到第二次發(fā)酵液；（6）、滅菌將步驟（5）所得的第二次發(fā)酵液于121℃下殺菌20min，然后灌裝，即得到蘋果酵素。實(shí)施例3一種蘋果酵素，即以新鮮成熟度好的蘋果為主材料，以畢赤酵母菌PichiakudriavzeviiPKD3001和植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001為第一次發(fā)酵菌株、滬釀1.01醋酸菌為第二次發(fā)酵菌株通過兩次發(fā)酵制備而成，該制備方法具體包括以下步驟：（1）、菌種的選取植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001冷凍干燥管；畢赤酵母菌PichiakudriavzeviiPKD3001冷凍干燥管；滬釀1.01醋酸菌；（2）、發(fā)酵原料液的制備；將新鮮、成熟度好的蘋果用自來水清洗干凈后經(jīng)吹干、去核、用榨汁機(jī)進(jìn)行榨汁、用100目紗布過濾得到蘋果汁，然后與純凈水混合，得到原料混合物，其中蘋果汁與純凈水的比例，按體積百分比計(jì)算，蘋果汁：純凈水為20%：80%；在上述所得的原料混合物中再加入為原料混合物總重量5%的葡萄糖，經(jīng)1mol/L食用碳酸鈉水溶液調(diào)pH值為6.2，然后于105℃滅菌10min得到發(fā)酵原料液；（3）、菌種活化用接種環(huán)取無菌水溶解的冷凍干燥管保存的畢赤酵母亞種PichiakudriavzeviiPKD3001菌種一環(huán)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上劃線，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得到平板活化畢赤酵母菌種；用接種環(huán)取無菌水溶解的冷凍干燥管保存的植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001菌種一環(huán)在乳酸菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上劃線，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得到平板活化植物乳桿菌菌種；用接種環(huán)取無菌水溶解的滬釀1.01醋酸菌一環(huán)在醋酸菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上劃線，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得到平板活化醋酸菌菌種；（4）、種子培養(yǎng)用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化畢赤酵母菌菌種一環(huán)接入裝有50ml麥芽浸粉肉湯液體培養(yǎng)基的250ml規(guī)格的三角瓶中，置于溫度30℃的培養(yǎng)箱中，然后控制轉(zhuǎn)速為120rpm，恒溫培養(yǎng)36h，離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗后，加入50mL0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到畢赤酵母菌種子液，上述每毫升畢赤酵母菌種子液中含畢赤酵母菌種1×106-1×109cfu；用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化植物乳桿菌菌種一環(huán)接入裝有50ml乳酸菌肉湯培養(yǎng)基的250ml規(guī)格的三角瓶中，置于溫度37℃的培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)36h，離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗后，加入50mL0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到植物乳桿菌種子液，上述每毫升植物乳桿菌種子液中含植物乳桿菌種1×107-1×1010cfu；用接種環(huán)取步驟（3）所得的平板活化醋酸菌菌種一環(huán)接入裝有50ml醋酸菌液體培養(yǎng)基的250ml規(guī)格的三角瓶中，置于溫度30℃的培養(yǎng)箱中，然后控制轉(zhuǎn)速為120rpm，恒溫培養(yǎng)36h，離心所得的沉淀用0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液清洗后，加入50mL0.01mol/L無菌磷酸緩沖鹽溶液經(jīng)500rpm下漩渦震蕩重懸菌體，得到醋酸菌種子液，上述每毫升醋酸菌種子液中含醋酸菌種1×106-1×108cfu；（5）、發(fā)酵培養(yǎng)首先，將畢赤酵母菌種子液和植物乳桿菌種子液按體積比，即畢赤酵母菌種子液：植物乳桿菌種子液為1：5的比例進(jìn)行混合，得到畢赤酵母菌和植物乳桿菌混合種子液；然后，按步驟（2）所得的發(fā)酵原料液體積的5%的比例，在步驟（2）所得的發(fā)酵原料液中加入上述所得的畢赤酵母菌和植物乳桿菌混合種子液，控制溫度為35℃、轉(zhuǎn)速130rpm進(jìn)行第一次發(fā)酵48h，得到第一次發(fā)酵液；然后，按第一次發(fā)酵液體積的10%的比例，在第一次發(fā)酵液中加入醋酸菌種子液，控制溫度35℃、轉(zhuǎn)速200rpm進(jìn)行第二次發(fā)酵36h，得到第二次發(fā)酵液；（6）、滅菌將步驟（5）所得的第二次發(fā)酵液于121℃下殺菌20min，然后灌裝，即得到蘋果酵素。對(duì)照實(shí)施例1一種蘋果酵素，即以新鮮成熟度好的蘋果為主材料，通過自然發(fā)酵而成，其制備過程具體包括如下步驟：（1）、發(fā)酵原料液的制備將新鮮、成熟度好的蘋果用自來水清洗干凈后經(jīng)吹干、去核、用榨汁機(jī)進(jìn)行榨汁、用100目紗布過濾得到蘋果汁，然后與純凈水混合，得到原料混合物，其中蘋果汁與純凈水的比例，按體積百分比計(jì)算，蘋果汁：純凈水5%：95%，即為發(fā)酵原料液；（2）、發(fā)酵培養(yǎng)將步驟（1）得到的發(fā)酵原料液裝入到玻璃瓶中，加上專用透氣蓋子，室溫放置20天，得到發(fā)酵液；（3）、灌裝將步驟（2）所得的發(fā)酵液控制溫度為121℃下殺菌20min，然后灌裝得到自然發(fā)酵法制備而成的蘋果酵素。效果例1對(duì)青春痘主要致病菌的體外抑菌作用研究試驗(yàn)方法（1）培養(yǎng)基配制：按常規(guī)方法配制痤瘡丙酸桿菌固體培養(yǎng)基（1升蒸餾水中加入：胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、葡萄糖5.0g、氯化鈉5.0g、酵母膏3.0g、乙酸鈉3.0g、可溶性淀粉1.0g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、瓊脂15.0g），將培養(yǎng)基加入三角瓶中用紗布封口，經(jīng)121℃滅菌20min后倒入培養(yǎng)皿中冷卻后備用；按常規(guī)方法配制痤瘡丙酸桿菌液體培養(yǎng)基（1升蒸餾水中加入：胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、葡萄糖5.0g、氯化鈉5.0g、酵母膏3.0g、乙酸鈉3.0g、可溶性淀粉1.0g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g），將培養(yǎng)基加入三角瓶中用紗布封口，經(jīng)121℃滅菌20min后備用；（2）痤瘡丙酸桿菌活化：用接種環(huán)挑去痤瘡丙酸桿菌甘油凍存管保藏菌種一環(huán)在痤瘡丙酸桿菌固體培養(yǎng)基劃線，然后置于35℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24h，得到培養(yǎng)皿上活化過的痤瘡丙酸桿菌；（3）菌液制備：取步驟（2）所得的培養(yǎng)皿上活化過的痤瘡丙酸桿菌一環(huán)接種到痤瘡丙酸桿菌液體培養(yǎng)基，35℃厭氧培養(yǎng)24h，得到痤瘡丙酸桿菌菌液;（4）抑菌試驗(yàn)：以無菌操作將0.1mL步驟（3）痤瘡丙酸桿菌菌液加入到步驟（1）所得的痤瘡丙酸桿菌固體培養(yǎng)基上中央，用涂布棒涂布均勻，直到幾乎完全涂干，然后在痤瘡丙酸桿菌固體培養(yǎng)基表面直接垂直放上3個(gè)牛津杯（所述牛津杯為內(nèi)徑6mm、外徑8mm、高10mm的圓形小管，管的兩端要光滑），輕輕加壓，使其與痤瘡丙酸桿菌培養(yǎng)基接觸無空隙；然后在4個(gè)牛津杯中分別加入240μL上述實(shí)施例1，2，3所得的蘋果酵素成品和對(duì)照實(shí)施例1所得的蘋果酵素，勿使蘋果酵素外溢，加完后置35℃厭氧培養(yǎng)24h，測(cè)量抑菌圈的大小，結(jié)果見表1，表1不同實(shí)施例中酵素的抑菌圈大小實(shí)施例實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3對(duì)照實(shí)施例1抑菌圈直徑/mm9.08.48.10從上表中也可以看出，本發(fā)明的以新鮮成熟度好的蘋果為主材料，以畢赤酵母菌一種蘋果酵素，即以新鮮成熟度好的蘋果為主材料，以畢赤酵母菌PichiakudriavzeviiPKD3001和植物乳桿菌LactobacillusplantarumC2001為第一次發(fā)酵菌株、滬釀1.01醋酸菌為第二次發(fā)酵菌株通過兩次發(fā)酵制備而成的蘋果酵素其抑菌效果明顯比自然發(fā)酵法所得的蘋果酵素的抑菌效果要好的多。效果例2采用DPPH法[2]分別測(cè)定實(shí)施例1，2，3通過兩次發(fā)酵法進(jìn)行發(fā)酵所得的蘋果酵素樣品和對(duì)照實(shí)施例1按自然發(fā)酵的方法所得的蘋果酵素樣品的抗氧化活性，即以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除活力為指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，其步驟如下：在4個(gè)10mL的試管中，分別加入2mL實(shí)施例1，2，3所得的蘋果酵素樣品和對(duì)照實(shí)施例1所得的蘋果酵素樣品，然后每個(gè)試管中分別加入2mL0.1mmol/LDPPH溶液，搖勻，分別室溫下暗處?kù)o置30min，以無水乙醇為空白，分別測(cè)定各試管中樣品在517nm下的吸光度，記作Asample。同時(shí)測(cè)定2mLDPPH溶液與2mL乙醇混合后的吸光度，記作Acontrol，以及2mL發(fā)明樣品溶液與2mL無水乙醇混合后的吸光度Ablank。然后計(jì)算實(shí)施例1，2，3，4所得的蘋果酵素樣品和對(duì)照實(shí)施例1所得的蘋果酵素樣品的自由基清除能力，即清除率，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，其計(jì)算方法按以下公式：清除率越大表明自由基的清除能力越強(qiáng)，由此表明其抗氧化能力越強(qiáng)。清除率和IC50常用來表征抗氧化能力，其中IC50為清除率為50%時(shí)的酵素濃度。以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除活力為指標(biāo)檢測(cè)本發(fā)明樣品的抗氧化活性，分別測(cè)定實(shí)施例1，2，3和對(duì)照實(shí)施例1中蘋果酵素成品的抗氧化活性。上述測(cè)得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖1，從圖1可以看出，通過本發(fā)明進(jìn)行兩次發(fā)酵所得的蘋果酵素樣品對(duì)DPPH自由基清除率比對(duì)照實(shí)施例1中采用自然發(fā)酵方法所得的蘋果酵素提高至少75%以上，表現(xiàn)出較好的抗氧化活力。效果例3IC50（所述的IC50為清除率為50%時(shí)的酵素濃度）測(cè)定用蒸餾水稀釋實(shí)施例1中所得的蘋果酵素，使其體積百分比濃度分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%。在5個(gè)10mL的試管中，依次分別加入2mL上述稀釋液，然后每個(gè)試管中分別加入2mL0.1mmol/LDPPH溶液，搖勻，分別室溫下暗處?kù)o置30min，以無水乙醇為空白，測(cè)定其在517nm下的吸光度Asample，同時(shí)測(cè)定2mLDPPH溶液與2mL乙醇混合后的吸光度Acontrol，以及2mL稀釋后的發(fā)明樣品溶液與2mL無水乙醇混合后的吸光度Ablank。然后以蘋果酵素的體積百分比濃度為橫坐標(biāo)，以清除率為縱坐標(biāo)，作圖，結(jié)果如附圖2，然后擬合蘋果酵素的體積百分比濃度與清除率之間的關(guān)系曲線方程，然后通過該方程計(jì)算出本發(fā)明實(shí)施例1所得的蘋果酵素對(duì)DPPH的清除率IC50的濃度為0.43%，其遠(yuǎn)低于在化妝品中可能的限定量(6%以內(nèi))，由此表明了酵素在運(yùn)用到化妝品中有相當(dāng)不錯(cuò)的抗氧化性，可以考慮作為抗衰老的添加成分。綜上所述，本發(fā)明提供的一種蘋果酵素，由于制備采用的原料蘋果是純天然的，利用低溫殺菌、嚴(yán)格控制發(fā)酵溫度，發(fā)酵時(shí)間控制在80h以內(nèi)，有效的降低了蘋果酵素營(yíng)養(yǎng)成分的損失，最大限度保留了蘋果酵素活性。進(jìn)一步，由于本發(fā)明的蘋果酵素制備過程中采用畢赤酵母菌和植物乳桿菌、醋酸桿菌進(jìn)行兩次發(fā)酵而成，所得蘋果酵素與自然發(fā)酵所得的蘋果酵素相比，能顯著抑制青春痘主要致病菌痤瘡丙酸桿菌的生長(zhǎng)，且其抗氧化活性指標(biāo)提高75%以上。以上所述僅是本發(fā)明的實(shí)施方式的舉例，并不用以限制本發(fā)明，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3