本發(fā)明涉及生物酵素，尤其是液態(tài)發(fā)酵法果蔬生物酵素。

背景技術(shù)：

果蔬生物酵素是益生菌和酵素的復(fù)合制劑，是一種微生態(tài)免疫營(yíng)養(yǎng)制劑，是由多種氨基酸構(gòu)成,具有生理活性的蛋白質(zhì),它能迅速到達(dá)人體內(nèi)提前老化和菌群失調(diào)的區(qū)域，活化、再生細(xì)胞，平衡腸道菌群，維護(hù)黏膜免疫屏障，抑制各種有害菌的產(chǎn)生和孳長(zhǎng)，促進(jìn)人體長(zhǎng)期保持年輕健康的狀態(tài)；它能在體溫下使體內(nèi)本不會(huì)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)或很難發(fā)生的生化反應(yīng)加速進(jìn)行；人體的新陳代謝，能量攝取，成長(zhǎng)和繁殖等生命現(xiàn)象，都必須通過(guò)酵素的幫助才能完成，是一種生命活動(dòng)中不可或缺的媒介物質(zhì)。

果蔬生物酵素在人體內(nèi)的主要作用分為以下幾方面：

l.消炎抗菌：果蔬生物酵素能夠促進(jìn)血液中白血球裂解增殖，誘發(fā)強(qiáng)化白血球的抗菌功能，從而起到消炎抗菌的作用。

2.激活細(xì)胞：能夠促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞新陳代謝，加速細(xì)胞裂變?cè)錾?，活化?xì)胞，延緩衰老，保持旺盛的體力。

3.血液凈化：能夠分解、代謝血液垃圾和引發(fā)機(jī)體炎癥某些的病毒，改善機(jī)體內(nèi)部環(huán)境，清除體內(nèi)垃圾，使血液保持健康狀態(tài)，促進(jìn)全身血液循環(huán)。

4.促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解吸收：催化、分解食物，幫助促進(jìn)食物的消化，加速各類營(yíng)養(yǎng)素的吸收，增強(qiáng)體質(zhì)。

5.調(diào)節(jié)菌群平衡，建立免疫屏障：果蔬生物酵素能夠促進(jìn)體內(nèi)有益菌的優(yōu)化生長(zhǎng)，從而抑制有害菌，調(diào)節(jié)機(jī)體菌群平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，使各類消化系統(tǒng)疾病能夠提前康復(fù)。

6.清除氧化自由基：由于果蔬生物酵素發(fā)酵過(guò)程中，特別是隨著后酵陳貯期的延長(zhǎng)，溶液中多酚類物質(zhì)倍增，抗氧化能力得到顯著提高，對(duì)各類氧化自由基清除能力呈逐漸增加趨勢(shì)，有顯著的機(jī)體抗衰老功效。

長(zhǎng)期以來(lái),果蔬生物酵素一直以家庭作坊式手工工藝在民間使用，對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)鮮有成熟工藝，其工藝技術(shù)也沒(méi)有引起人們的足夠重視，隨著對(duì)果蔬生物酵素資源開(kāi)發(fā)研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn),它具有高度開(kāi)發(fā)價(jià)值和極高營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值。

目前市場(chǎng)上也有工業(yè)化生產(chǎn)生物酵素，比如：

文獻(xiàn)一：中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01210216324X公開(kāi)的一種植物精華酵素及其制備方法，它是將所選的水果和蔬菜洗凈、晾干、切碎、磨漿后，依次加入水、糖和酒，攪拌，自然發(fā)酵后過(guò)濾去渣，得原液；在原液中加入水和糖，拌勻，進(jìn)行第一次增氧曝氣培養(yǎng)，獲得一次擴(kuò)大發(fā)酵液；在一次擴(kuò)大發(fā)酵液中加入水和糖，拌勻后進(jìn)行第二次增氧曝氣、發(fā)酵培養(yǎng)，得二次擴(kuò)大發(fā)酵液；在二次擴(kuò)大發(fā)酵液中加入水和糖，拌勻后，第三次增氧曝氣、發(fā)酵培養(yǎng)；再加入全部微量元素，拌勻，第四次增氧曝氣，得植物精華酵素。

該文獻(xiàn)制備方法中，由于在洗凈、晾干過(guò)程中，單純的強(qiáng)調(diào)洗凈水果蔬菜，造成了水果果皮、蔬菜表面果蔬酵素天然微生物群系的破壞，發(fā)酵過(guò)程中容易造成由于果蔬酵素天然微生物群系、益生菌群系的破壞，而使得引起水果蔬菜腐敗菌系在溫度適宜條件下快速繁殖，從而造成水果蔬菜發(fā)酵液酸敗，造成發(fā)酵液出現(xiàn)酸臭味和綠色、灰黑色、橘黃或棕紅色腐敗菌系霉斑或菌斑的出現(xiàn)，同時(shí)，發(fā)酵液中添加了酒的成分，一是影響發(fā)酵原液的口感，二是果蔬酵素發(fā)酵本身屬于好氣性發(fā)酵，添加酒的成分后，會(huì)因果蔬酵素天然微生物群系中醋酸菌的作用，使酒轉(zhuǎn)化為醋酸，從而破壞果蔬酵素自然發(fā)酵的有機(jī)物成分，降低了發(fā)酵溶液的PH值，容易導(dǎo)致果蔬酵素天然微生物群系因PH值下降過(guò)快引起發(fā)酵菌類早衰，造成果蔬酵素發(fā)酵不徹底。

另外，該文獻(xiàn)中描述的自然發(fā)酵原液，是過(guò)濾出果蔬渣后的一次發(fā)酵液，過(guò)早地過(guò)濾出果蔬渣，容易導(dǎo)致果蔬渣中的膳食纖維、天然礦物質(zhì)、甾類、黃酮類等有益成分不能夠在后發(fā)酵階段中不能夠被充分轉(zhuǎn)化利用，降低了果蔬酵素發(fā)酵液的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量；其次，該文獻(xiàn)中描述的一次、二次、三次、四次增氧曝氣發(fā)酵，只是在過(guò)濾出果蔬渣的果蔬發(fā)酵原液增加水和糖類物質(zhì)，這樣只能會(huì)增加發(fā)酵液的有機(jī)酸類含量，甚至還會(huì)產(chǎn)生對(duì)人體有害的高級(jí)醇類，同時(shí)，由于不斷的增加水和糖類物質(zhì)，不但造成發(fā)酵液PH值不斷上升、糖類得不到有效轉(zhuǎn)化、果蔬酵素益生菌類早衰，還導(dǎo)致了果蔬自然發(fā)酵原液有效成分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的降低，根本不會(huì)得到富含各種氨基酸、具有生理活性的特殊蛋白質(zhì)以及活性酶類的果蔬生物酵素。

文獻(xiàn)二：中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?014100990092公開(kāi)了一種微生態(tài)果蔬酵素制備方法，以嗜酸乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、釀酒酵母、屎腸球菌和雙歧桿菌6種益生菌中的4～6種，在含有紅糖，甘草和鮮紅薯為組份的培養(yǎng)基里培養(yǎng)，再通過(guò)含有紅糖和甘草的稀釋培養(yǎng)液進(jìn)行活化培養(yǎng)，制成的微生態(tài)制劑為發(fā)酵劑，來(lái)發(fā)酵新鮮水果蔬菜和中草藥的果漿。

文獻(xiàn)二的制備方法中，使用的是嗜酸乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、釀酒酵母、屎腸球菌和雙歧桿菌六種發(fā)酵菌類中的4-6種，但是，該6種發(fā)酵菌類中，只有嗜酸乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和雙歧桿菌對(duì)果蔬生物酵素發(fā)酵有直接有效的促進(jìn)作用，同屬于果蔬酵素天然發(fā)酵益生菌類范疇，而其中的釀酒酵母、屎腸球菌不利于果蔬酵素的發(fā)酵。

雖然屎腸球菌對(duì)人體腸系菌群具有調(diào)控作用，但是在一定條件下可致感染，屎腸球菌引起尿路感染、腹腔、盆腔感染、敗血癥，同時(shí)，腸球菌還極易形成耐藥性，腸球菌能產(chǎn)生有害化學(xué)物質(zhì)，破壞DNA，進(jìn)而引起促發(fā)直腸癌的基因活動(dòng)，腸球菌在發(fā)酵狀態(tài)下會(huì)生成一種叫“超氧化物”的氧分子，這種氧分子會(huì)破壞周圍細(xì)胞的DNA，國(guó)際益生菌協(xié)會(huì)(International Probiotics Association)和世界衛(wèi)生組織(WHO)均建議：益生菌中不宜使用腸球菌！目前最新的益生菌產(chǎn)品如東海藥業(yè)生產(chǎn)的阿泰寧、寶樂(lè)安、爽舒寶等都不含有腸球菌。

果蔬生物酵素中有利于發(fā)酵的酵母菌主要是接合酵母屬、畢赤酵母等，接合酵母屬淀粉酶活力較強(qiáng)、耐高滲透壓、活性蛋白酶類產(chǎn)生能力強(qiáng)，畢赤酵母是甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母中的一類能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源的酵母菌，能夠有效降低果蔬酵素原料(特別是水果)中果膠含量高產(chǎn)生的甲醇含量，提高果蔬生物酵素的質(zhì)量；然而，文獻(xiàn)二使用的發(fā)酵菌種中是釀酒酵母，而釀酒酵母只會(huì)利用果蔬中的還原糖類轉(zhuǎn)化為酒精，在有氧發(fā)酵條件下，酒精被醋酸菌轉(zhuǎn)化為醋酸，降低了發(fā)酵溶液的PH值，容易導(dǎo)致果蔬酵素天然微生物群系因PH值下降過(guò)快引起發(fā)酵菌類早衰，造成果蔬生物酵素發(fā)酵不徹底。

另外，人體正常代謝中，有6000余種生化反應(yīng)參與人體代謝，需要大量、多種生物活性酶類、具有生物活性的特殊蛋白質(zhì)、自然界中無(wú)數(shù)種果蔬酵素益生菌類參與其中，其中，不乏超氧化歧化菌類、雙歧桿菌類、乳酸菌類、曲霉、接合酵母屬、畢赤酵母等發(fā)酵益生菌，單純的依靠嗜酸乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、釀酒酵母、屎腸球菌和雙歧桿菌六種發(fā)酵菌類中的4-6種，無(wú)法保證果蔬生物酵素發(fā)酵代謝生成多種生物活性酶類、具有生物活性的特殊蛋白質(zhì)，更無(wú)法保證果蔬酵素天然微生物群系、益生菌群系的菌群多樣性，降低了果蔬生物酵素的生物活性功能。

文獻(xiàn)三：中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?015103714652公開(kāi)了一種蘋(píng)果微生物酵素及其制備方法，屬于酵素的制備領(lǐng)域。其制備方法為：(1)將蘋(píng)果用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的鹽水清洗干凈，置于陰涼處瀝干水分，備用；(2)將黑糖用紫外線消毒5-10s；(3)將步驟(1)中的蘋(píng)果除籽切塊裝入無(wú)菌反應(yīng)器中，將步驟(2)中的黑糖按照蘋(píng)果質(zhì)量的10.5-12.5％的質(zhì)量加入到蘋(píng)果中，將穩(wěn)定劑按照蘋(píng)果質(zhì)量的1.5-2.0％的質(zhì)量加入到蘋(píng)果中，得到混合物；(4)向步驟(3)中的混合物添加酵母菌；(5)密封、發(fā)酵。

文獻(xiàn)三的制備方法，由于蘋(píng)果和黑糖都經(jīng)過(guò)了滅菌處理，水果表面攜帶的果蔬酵素天然微生物群系、益生菌群系被全部殺滅、破壞，另外，果蔬生物酵素是一種在果蔬酵素天然微生物群系、益生菌群系作用下的有氧生物發(fā)酵過(guò)程，而文獻(xiàn)三描述的發(fā)酵過(guò)程是將蘋(píng)果除籽切塊裝入無(wú)菌反應(yīng)器中，添加酵母菌密封、發(fā)酵，是一種在單一酵母菌種作用下的無(wú)氧發(fā)酵過(guò)程，利用文獻(xiàn)三的制備方法，只會(huì)發(fā)酵生成含有酒精和少量有機(jī)酸的蘋(píng)果釀造酒類，不會(huì)發(fā)酵生成人體代謝所需要的多種生物活性酶類、具有生物活性的特殊蛋白質(zhì)類，以及可以起到消炎抗菌、激活細(xì)胞、凈化血液作用的發(fā)酵類生物活性物質(zhì)。

其次，文獻(xiàn)三描述的發(fā)酵方法，單純依靠酵母菌作為發(fā)酵菌種進(jìn)行無(wú)氧發(fā)酵，本質(zhì)上不符合果蔬生物酵素發(fā)酵需要自然界中無(wú)數(shù)種果蔬酵素益生菌類參與其中，果蔬酵素天然微生物群系、益生菌群系的菌群多樣性混合有氧發(fā)酵的生化機(jī)理，本質(zhì)上不會(huì)得到對(duì)人體有多種益生作用果蔬生物酵素。

文獻(xiàn)四：中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?015105557016公開(kāi)了一種基于接種菌種進(jìn)行發(fā)酵制備水果酵素的方法，包括：選料、剝皮切片、調(diào)整糖度、滅菌、添加改性發(fā)酵液、發(fā)酵和過(guò)濾；其中，改性發(fā)酵液是在天然發(fā)酵液中接種有改性菌種，所述改性菌種選自米曲霉、酵母菌、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌中的至少一種。

文獻(xiàn)四的制備方法，同文獻(xiàn)二、文獻(xiàn)三在背景技術(shù)上有諸多相似之處，只不過(guò)各自選用的發(fā)酵菌種，或者說(shuō)文獻(xiàn)中描述的改性菌種、改性發(fā)酵液品種不同，但是，本質(zhì)上都是對(duì)水果表面攜帶的果蔬酵素天然微生物群系、益生菌群系被全部殺滅、破壞，然后接種入一種或幾種所謂改性菌種，或者用所謂改性菌種培養(yǎng)的改性發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)酵。

由于都經(jīng)過(guò)了滅菌處理，水果表面攜帶的果蔬酵素天然微生物群系、益生菌群系被全部殺滅、破壞，另外，果蔬生物酵素是一種在果蔬酵素天然微生物群系、益生菌群系作用下的有氧生物發(fā)酵過(guò)程，而文獻(xiàn)四描述的發(fā)酵過(guò)程是將水果剝皮切片、調(diào)整糖度、滅菌、添加改性發(fā)酵液、發(fā)酵和過(guò)濾，所述改性菌種也只是選自米曲霉、酵母菌、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌中的至少一種，是在單一或幾種菌種作用下的發(fā)酵過(guò)程，利用文獻(xiàn)四的制備方法，選擇米曲霉作為菌種，只會(huì)將果蔬生物酵素發(fā)酵原料中的淀粉質(zhì)、纖維質(zhì)物質(zhì)代謝為糖類和屈指可數(shù)的幾種酶類；利用酵母菌，只會(huì)發(fā)酵生成含有酒精和少量有機(jī)酸的釀造酒類；利用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌作為菌種，只會(huì)發(fā)生乳酸菌發(fā)酵一類的生化反應(yīng)，其代謝產(chǎn)物也主要是乳酸，然而，人體正常代謝中，有6000余種生化反應(yīng)參與人體代謝，需要大量、多種生物活性酶類、具有生物活性的特殊蛋白質(zhì)、自然界中無(wú)數(shù)種果蔬酵素益生菌類參與其中，其中，不乏超氧化歧化菌類、雙歧桿菌類、乳酸菌類、曲霉、接合酵母屬、畢赤酵母等發(fā)酵益生菌，單純的依靠選自米曲霉、酵母菌、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌中的至少一種作為發(fā)酵菌種，無(wú)法保證果蔬生物酵素發(fā)酵代謝生成多種生物活性酶類、具有生物活性的特殊蛋白質(zhì)，更無(wú)法保證果蔬酵素天然微生物群系、益生菌群系的菌群多樣性，降低了果蔬生物酵素的生物活性功能，不會(huì)發(fā)酵生成人體代謝所需要的多種生物活性酶類、具有生物活性的特殊蛋白質(zhì)類以及可以起到消炎抗菌、激活細(xì)胞、凈化血液作用的發(fā)酵類生物活性物質(zhì)。

其次，文獻(xiàn)四描述的發(fā)酵方法，單純依靠選自米曲霉、酵母菌、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌中的至少一種作為發(fā)酵菌種，本質(zhì)上不符合果蔬生物酵素發(fā)酵需要自然界中無(wú)數(shù)種果蔬酵素益生菌類參與其中，果蔬酵素天然微生物群系、益生菌群系的菌群多樣性混合有氧發(fā)酵的生化機(jī)理，本質(zhì)上不會(huì)得到對(duì)人體有多種益生作用果蔬生物酵素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明立足于當(dāng)?shù)刎S富的天然果蔬資源，以工業(yè)化手段將天然果蔬資源轉(zhuǎn)化為一種具有營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值的果蔬生物酵素。

本發(fā)明同時(shí)提供利用所制備的果蔬生物酵素生產(chǎn)系列營(yíng)養(yǎng)食品的方法，如：新型發(fā)酵型營(yíng)養(yǎng)果蔬生物酵素飲料、新型營(yíng)養(yǎng)果蔬生物酵素酒等。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明中果蔬生物酵素具體工藝步驟如下：

第一步：天然果蔬生物酵素發(fā)酵菌種的選育及擴(kuò)大培養(yǎng)

第1.1步：將電導(dǎo)率在30us/cm以下的純凈水加熱到100℃，并保持微沸5分鐘，自然冷卻后，將其自然曝氣24小時(shí)以上，備用。

第1.2步：將自然成熟度8成左右的水果或蔬菜(簡(jiǎn)稱果蔬)用流水沖洗干凈、自然干燥后，在保持分切刀具及接觸水果的所有物品無(wú)菌狀態(tài)下刨切成薄片，并將水果中部果核、籽實(shí)剔除，以保持水果自然果香味；

要求：水果、蔬菜清洗之前，必須剔除腐爛果實(shí)和干枯蔬菜葉片，水果、蔬菜流水沖洗過(guò)程中，只能沖洗掉表面浮塵和雜質(zhì)，生長(zhǎng)正常的水果果皮和蔬菜外表上自然帶有的淡粉狀表面護(hù)膜、生物蠟質(zhì)狀表面護(hù)膜不能破壞，其表面護(hù)膜中的活性菌類是果蔬酵素生產(chǎn)過(guò)程中主要的天然微生物群系、益生菌群系的菌群來(lái)源；

第1.3步：按照重量百分比為黑糖∶果蔬薄片∶純凈水＝1∶3∶10的比例，將黑糖充分溶解于第1.1步制備的純凈水中，然后與果蔬薄片一起置于通風(fēng)攪拌式培養(yǎng)罐中混合均勻，并注意將果蔬切片完全浸漬在黑糖純凈水溶液中，保持溶液溫度在30±2℃條件下，進(jìn)行天然果蔬生物酵素發(fā)酵菌種的選育及擴(kuò)大培養(yǎng)，要求每間隔2小時(shí)，對(duì)培養(yǎng)液通風(fēng)攪拌15分鐘，待天然果蔬生物酵素發(fā)酵菌種培養(yǎng)液表面布滿平滑狀白色微生物菌膜，培養(yǎng)液表面不再出現(xiàn)氣體泡沫溢出，果蔬切片自然沉降到通風(fēng)攪拌式培養(yǎng)罐底部，培養(yǎng)液呈現(xiàn)自然澄清的棕黃色至紅棕色時(shí)，天然果蔬生物酵素發(fā)酵菌種培養(yǎng)液即告培養(yǎng)完成，培養(yǎng)時(shí)間一般在30天以上。

第二步：果蔬生物酵素發(fā)酵原料的預(yù)處理

第2.1步：純凈水的預(yù)處理

將電導(dǎo)率在30us/cm以下的純凈水加熱到100℃，并保持微沸5分鐘，自然冷卻后，將其自然曝氣24小時(shí)以上，備用；

第2.2步：果蔬生物發(fā)酵用果蔬原料的預(yù)處理

將自然成熟度8成左右的果蔬洗凈自然干燥后剔除果核、果仁、籽實(shí)，進(jìn)行打漿，漿液粒度要求最大粒度直徑不超過(guò)9毫米；

第三步：果蔬生物酵素接種發(fā)酵

第3.1步：接種

按照重量百分比為黑糖∶果蔬漿液∶純凈水＝1∶3∶10的比例，稱取三者在通風(fēng)攪拌式發(fā)酵罐中混合均勻成為待發(fā)酵混合溶液，并按照重量百分比為待發(fā)酵混合溶液∶天然果蔬生物酵素發(fā)酵菌種培養(yǎng)液＝10∶1的比例，稱取培養(yǎng)成熟的天然果蔬生物酵素發(fā)酵菌種培養(yǎng)液，保持溶液溫度在35±2℃條件下進(jìn)行接種，并充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆颍?/p>

第3.2步：前發(fā)酵

將充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆虻拇l(fā)酵果蔬漿液與天然果蔬生物酵素發(fā)酵菌種培養(yǎng)液混合液，在35±2℃溫度條件下，進(jìn)行通風(fēng)攪拌發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中，必須每間隔2小時(shí)，對(duì)發(fā)酵液通風(fēng)攪拌15分鐘，待天然果蔬生物酵素發(fā)酵液表面布滿平滑狀白色微生物菌膜，發(fā)酵液表面不再出現(xiàn)氣體泡沫溢出，果蔬渣汁自然沉降到通風(fēng)攪拌式培養(yǎng)罐底部，發(fā)酵液呈現(xiàn)自然地棕黃色至紅棕色時(shí)，天然果蔬生物酵素發(fā)酵液前發(fā)酵完成，前發(fā)酵時(shí)間一般為60天以上；

第3.3步：中期發(fā)酵

待前發(fā)酵完成后，發(fā)酵液中已基本上只出現(xiàn)少量發(fā)酵氣體，繼續(xù)保持品溫在35±2℃，進(jìn)行中期發(fā)酵，中期發(fā)酵期間，只需每天開(kāi)啟發(fā)酵罐一次，并通風(fēng)攪拌30分鐘即可，待發(fā)酵液表面呈現(xiàn)加厚狀表面平滑的白色或微黃色片狀微生物菌膜，發(fā)酵液上層出現(xiàn)自然澄清發(fā)酵液，此時(shí)，中期發(fā)酵完成，中期發(fā)酵時(shí)間一般為120天；

第3.4步：后酵陳貯

中期發(fā)酵完成后，無(wú)需對(duì)發(fā)酵液做保溫發(fā)酵處理，將果蔬生物酵素發(fā)酵液打入后酵陳貯罐，依靠自然環(huán)境進(jìn)行后酵陳貯在2年以上，后酵陳貯期間不得再進(jìn)行通風(fēng)攪拌；

第3.5步：倒罐澄清

后酵陳貯滿2年后，將發(fā)酵成熟、自然澄清的果蔬生物酵素發(fā)酵液放出打入過(guò)濾澄清罐，將下部自然沉降、含有大量果渣的果蔬生物酵素發(fā)酵液回收，可以作為發(fā)酵菌種，在新一輪次的果蔬生物酵素發(fā)酵過(guò)程中使用；

第3.6步：過(guò)濾澄清

將打入過(guò)濾澄清罐后的果蔬生物酵素發(fā)酵液進(jìn)行離心沉降分離和過(guò)濾后，即可得到澄清有光澤、色澤呈棕黃色至紅棕色、發(fā)酵成熟的果蔬生物酵素溶液；

第3.7步：低溫貯存

將過(guò)濾澄清得到的果蔬生物酵素溶液打入低溫存貯罐中，在10-15℃低溫條件下存貯，即可得到發(fā)酵成熟、隨用隨取的高活性果蔬生物酵素溶液。

經(jīng)檢驗(yàn)，本發(fā)明果蔬生物酵素技術(shù)性能參數(shù)為：

(1)依據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T12456《食品中總酸的測(cè)定》，總酸度(以檸檬酸計(jì))：≥10.0g/L飲料；

(2)總酚(以沒(méi)食子酸計(jì))：≥1.5g/L飲料；

(3)依照飲料外觀口感檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，本發(fā)明外觀：呈棕黃色至紅棕色自然愉悅的色澤，澄清透明有光澤；本發(fā)明口感：有自然愉悅的水果(或蔬菜)復(fù)合香氣及發(fā)酵帶來(lái)的愉悅的有機(jī)酸復(fù)合香氣，酸甜適口，口感舒適、潤(rùn)滑，組織形態(tài)均勻細(xì)膩。

上述總酚含量的測(cè)定方法：

試劑：(1)鎢酸鈉——鉬酸鈉混合溶液：稱取50.0g鎢酸鈉，12.5g鉬酸鈉，用350ml水溶解到1000ml的回流瓶中，加入25ml磷酸及50ml鹽酸，充分混勻，小火加熱回流兩小時(shí)，再加入75g硫酸鋰、25ml蒸餾水、數(shù)滴溴水，然后繼續(xù)沸騰15min(至溴水完全揮發(fā)為止)，冷卻后，轉(zhuǎn)入500ml容量瓶定容，過(guò)濾，至棕色瓶中保存，使用時(shí)稀釋一倍。

(2)75g/L碳酸鈉溶液：稱取37.5g無(wú)水碳酸鈉溶于250ml溫水中，混勻，冷卻，稀釋至500ml，過(guò)濾到儲(chǔ)液瓶中備用。

(3)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.1100g一水合沒(méi)食子酸，溶解并定容至100ml，此溶液沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為1000mg/L,在冰箱中2—3℃可保存五天。

(4)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別稱取1000mg/L的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml和5.0ml至100ml容量瓶中，定容，溶液質(zhì)量濃度為0、10.0mg/L、20.0mg/L、30.0mg/L、40.0mg/L、50.0mg/L。

分析步驟：(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取0、10.0mg/L、20.0mg/L、30.0mg/L、40.0mg/L、50.0mg/L的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)使用液各1.0ml，分別加5.0ml水，1.0ml鎢酸鈉——鉬酸鈉混合溶液和3.0ml碳酸鈉溶液，混勻，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L，顯色，放置2小時(shí)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線的“0”管為空白，在765nm波長(zhǎng)下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)樣品的測(cè)定：吸取1.0ml試樣提取液，分別加入5.0ml水，1.0ml鎢酸鈉——鉬酸鈉混合溶液和3.0ml碳酸鈉溶液，顯色，放置2小時(shí)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線的“0”管為空白，在765nm波長(zhǎng)下測(cè)定試樣溶液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出試樣溶液的多酚濃度，以沒(méi)食子酸計(jì)，如果吸光度值超過(guò)5.0mg/L沒(méi)食子酸的吸光度時(shí)，將樣品提取液稀釋后重新測(cè)定。

計(jì)算多酚含量的公式：X＝(c×10×A)/(m×1000)

X—試樣中多酚含量，g/L；

C—試樣測(cè)定液中沒(méi)食子酸的濃度，mg/L；

1000—試樣測(cè)定液濃度由mg/L換算成g/L的換算系數(shù)；

10—試樣測(cè)定液定容體積，ml；

A—樣品稀釋倍數(shù)；

m—試樣體積，ml。

利用本發(fā)明的果蔬生物酵素制備營(yíng)養(yǎng)果蔬生物酵素飲料的工藝為：

按照果蔬生物酵素溶液：濃縮蘋(píng)果汁：白砂糖：80℃凈化水＝2:1:1:16的質(zhì)量比例，將果蔬生物酵素溶液、濃縮蘋(píng)果汁、白砂糖和80℃凈化水混合定容，然后加入蘋(píng)果酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、果汁飲料復(fù)合穩(wěn)定劑、異Vc鈉以及食品添加劑進(jìn)行調(diào)配，經(jīng)乳化剪切、高壓均質(zhì)后高溫灌裝，然后殺菌消毒，冷卻即可。

利用本發(fā)明的果蔬生物酵素制備營(yíng)養(yǎng)果蔬生物酵素酒的工藝為：

選擇酒精度在45％VOL左右的白酒，經(jīng)除濁澄清后，添加占酒精度在45％VOL左右的白酒10wt％的果蔬生物酵素溶液調(diào)配，然后調(diào)整酒精度在35％VOL，經(jīng)低溫除濁、機(jī)械過(guò)濾澄清、高分子膜精濾、低溫陳貯，最后在低溫條件下添加占總重量0.02‰天然水果精油，混合均勻、精濾灌裝既成成品。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

其一，本發(fā)明在生物發(fā)酵過(guò)程中，充分利用水果果皮或蔬菜表面攜帶的果蔬酵素天然微生物群系、益生菌群系，采用傳統(tǒng)生物發(fā)酵工藝，同時(shí)結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行天然果蔬生物酵素發(fā)酵菌種的選育及擴(kuò)大培養(yǎng)，保證了果蔬生物酵素天然微生物群系、益生菌群系的菌群多樣性，確保了發(fā)酵代謝生成多種生物活性酶類、具有生物活性的特殊蛋白質(zhì)、多酚類還原物質(zhì)的數(shù)量，提高了果蔬生物酵素的生物活性功能。

其二，果蔬生物酵素發(fā)酵過(guò)程中，采用前發(fā)酵、中期發(fā)酵期間有氧發(fā)酵，后發(fā)酵陳貯期間保持自然溫度進(jìn)行長(zhǎng)期后酵陳貯相結(jié)合的方式，能夠?qū)⒁吧湍妇N代謝產(chǎn)生的酒精成分代謝為有機(jī)酸類，并且有效促進(jìn)了果蔬生物酵素在后酵陳貯期間各種生物活性酶類、具有生物活性的特殊蛋白質(zhì)、多酚類還原物質(zhì)的生成和富集，提高了果蔬生物酵素發(fā)酵制品的質(zhì)量。

其三，采用傳統(tǒng)自然優(yōu)選工藝，培養(yǎng)含有多樣性果蔬生物酵素天然微生物群系、益生菌群系的菌群，結(jié)合前發(fā)酵、中期發(fā)酵、后酵陳貯、過(guò)濾澄清、低溫貯存等工藝，有效建立了果蔬生物酵素工業(yè)化生產(chǎn)工藝流程模塊化，保障了果蔬生物酵素工業(yè)化轉(zhuǎn)化途徑的連續(xù)性和工業(yè)推廣持續(xù)性，奠定了果蔬生物酵素行業(yè)工業(yè)化發(fā)展的基礎(chǔ)。

其四，后酵陳貯期間分離出的果渣及濃度較大的底層發(fā)酵液，可以作為后續(xù)發(fā)酵工藝的自然優(yōu)選微生物菌種，用于后續(xù)果蔬生物酵素的連續(xù)性發(fā)酵，能夠有效提高果蔬生物酵素生產(chǎn)過(guò)程前期菌種選育培養(yǎng)的可靠性，同時(shí)，降低了果蔬生物酵素菌種選育培養(yǎng)成本，另外，分離出的果渣還可以后續(xù)加工成果蔬生物酵素粉以及果蔬生物酵素農(nóng)作物噴灑劑、果蔬生物酵素洗滌劑等多種果蔬生物酵素制品，提高了果蔬生物酵素發(fā)酵制品利用率的同時(shí)，還降低了生產(chǎn)廢棄物排放，提高了工業(yè)環(huán)保水平。

其五，將發(fā)酵制得的果蔬生物酵素溶液應(yīng)用于食品工業(yè)，生產(chǎn)果蔬生物酵素功能保健飲料、果蔬生物酵素營(yíng)養(yǎng)保健酒，為消費(fèi)者提供了新型功能性營(yíng)養(yǎng)食品，同時(shí)，拓展了果蔬生物酵素發(fā)酵制品的工業(yè)轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，為果蔬生物酵素行業(yè)的規(guī)?；⒓s化、多樣化、深層次工業(yè)轉(zhuǎn)化開(kāi)辟了廣闊發(fā)展前景。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。

本發(fā)明果蔬生物酵素的制備方法為：

第一步：稱取黑糖10公斤，將其充分溶解于經(jīng)過(guò)殺菌、自然曝氣處理的100公斤純凈水中，然后，稱取已經(jīng)切成厚度不超過(guò)3㎜的薄片并剔除果核、籽實(shí)的山杏15公斤和鴨梨15公斤，與充分溶解后的黑糖純凈水溶液在200升通風(fēng)攪拌式培養(yǎng)罐中混合均勻，并注意將水果切片完全浸漬在黑糖純凈水溶液中，保持溶液溫度在30±2℃條件下，進(jìn)行天然果蔬生物酵素發(fā)酵菌種的選育及擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中，必須每間隔2小時(shí)，對(duì)培養(yǎng)液通風(fēng)攪拌15分鐘，以利于天然菌種充分接觸培養(yǎng)液，加速菌種的繁殖。待選育、擴(kuò)培8-10天左右，可以明顯看到培養(yǎng)液表面出現(xiàn)白色菌膜或者白色菌類斑點(diǎn)，發(fā)酵液自然氣味呈現(xiàn)有機(jī)酸類與水果自然果香的復(fù)合香氣，發(fā)酵液呈現(xiàn)自然澄清的棕黃色至紅棕色時(shí)，說(shuō)明天然果蔬生物酵素發(fā)酵菌種已經(jīng)正常生長(zhǎng)繁殖。繼續(xù)通風(fēng)培養(yǎng)30天，待天然果蔬生物酵素發(fā)酵菌種培養(yǎng)液表面布滿平滑狀白色微生物菌膜，培養(yǎng)液表面不再出現(xiàn)氣體泡沫溢出，水果(或蔬菜)切片自然沉降到通風(fēng)攪拌式培養(yǎng)罐底部，培養(yǎng)液呈現(xiàn)自然澄清的棕黃色至紅棕色時(shí)，天然果蔬生物酵素發(fā)酵菌種培養(yǎng)液即告培養(yǎng)完成。

第二步：將自然成熟度8成左右的山杏和鴨梨用清水漂洗干凈，瀝干水分，然后，用破碎打漿機(jī)將洗凈瀝干的水果進(jìn)行打漿，并同時(shí)剔除果核、果仁、籽實(shí)，打漿的粒度直徑要求通過(guò)打漿篩網(wǎng)進(jìn)入到水果漿液中的最大粒度直徑不超過(guò)9毫米。

按照重量百分比為黑糖∶水果漿液∶純凈水＝1∶3∶10的比例，稱取黑糖100公斤，然后，將其充分溶解于經(jīng)過(guò)殺菌、自然曝氣處理的1000公斤純凈水中，然后，稱取已經(jīng)打成漿液并剔除果核、籽實(shí)的水果300公斤，與充分溶解后的黑糖純凈水溶液在2000升通風(fēng)攪拌式發(fā)酵罐中混合均勻，并按照重量百分比為待發(fā)酵混合溶液∶發(fā)酵菌種培養(yǎng)液＝10∶1的比例，稱取培養(yǎng)成熟的發(fā)酵菌種培養(yǎng)液140公斤，保持溶液溫度在35±2℃條件下進(jìn)行接種、通風(fēng)攪拌發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中，必須每間隔2小時(shí)，對(duì)發(fā)酵液通風(fēng)攪拌15分鐘，以利于天然菌種充分接觸發(fā)酵液，加速菌種的繁殖、發(fā)酵，前發(fā)酵周期為60天以上。

第三步：前發(fā)酵完成后，發(fā)酵液中已基本上只出現(xiàn)少量發(fā)酵氣體，繼續(xù)保持品溫在35±2℃，進(jìn)行中期發(fā)酵，中期發(fā)酵期間，只需每天開(kāi)啟發(fā)酵罐一次，并通風(fēng)攪拌30分鐘即可，中期發(fā)酵時(shí)間為120天，中期發(fā)酵完成后，無(wú)需對(duì)發(fā)酵液做保溫發(fā)酵處理，將果蔬生物酵素發(fā)酵液打入后酵陳貯罐，依靠自然環(huán)境進(jìn)行后酵陳貯，后酵陳貯時(shí)間要求在2年以上，后酵陳貯期間不得再進(jìn)行通風(fēng)攪拌。

第四步：后酵陳貯滿2年后，在后酵陳貯罐中部左右的側(cè)放料管，將發(fā)酵成熟、自然澄清的果蔬生物酵素溶液放出，打入過(guò)濾澄清罐進(jìn)行機(jī)械過(guò)濾，下部自然沉降、含有大量果渣的果蔬生物酵素發(fā)酵液，可以作為發(fā)酵菌種，在新一輪次的果蔬生物酵素發(fā)酵過(guò)程中使用，在后酵陳貯罐側(cè)放料管放出的發(fā)酵成熟、自然澄清的果蔬生物酵素發(fā)酵液，打入過(guò)濾澄清罐后，首先高速離心沉降設(shè)備進(jìn)行離心沉降分離，分離出的澄清液再用硅藻土過(guò)濾機(jī)進(jìn)行機(jī)械過(guò)濾，過(guò)濾完畢后，再用微孔膜直徑在0.1-0.2μm的高分子膜過(guò)濾設(shè)備進(jìn)行精細(xì)過(guò)濾，即可得到澄清有光澤、色澤呈棕黃色至紅棕色、發(fā)酵成熟的果蔬生物酵素溶液。

第五步：為保持果蔬生物酵素溶液發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的各類生物活性酶類、益生菌類、生物活性氨基酸類、多酚類還原性物質(zhì)的活性，以及各類活性物質(zhì)對(duì)人體機(jī)能的功能性和免疫力，將機(jī)械過(guò)濾澄清后的果蔬生物酵素溶液打入低溫存貯罐中，然后將果蔬生物酵素溶液溫度降溫至10-15℃，并保持低溫存貯，即可得到發(fā)酵成熟、隨用隨取的高活性果蔬生物酵素溶液。

利用上述果蔬生物酵素制備功能性營(yíng)養(yǎng)飲料的方法為：

稱取100公斤果蔬生物酵素溶液、50公斤濃縮蘋(píng)果汁、50公斤白砂糖，用80℃凈化水稀釋定容至1噸溶液，然后，加入蘋(píng)果酸0.5公斤、檸檬酸2公斤、檸檬酸鈉0.5公斤，加入安賽蜜0.15公斤、三氯蔗糖0.03公斤，加入果汁飲料復(fù)合穩(wěn)定劑2.5公斤，加入異Vc鈉0.2公斤，并添加適量食用香精等食品添加劑進(jìn)行調(diào)配；調(diào)配好的飲料經(jīng)乳化剪切后，用高壓均質(zhì)機(jī)保持20～25MPa工作壓力，在60～65℃條件下對(duì)飲料進(jìn)行高壓均質(zhì)，均質(zhì)后的飲料在配料罐中加熱至85℃以上，然后進(jìn)行高溫灌裝；灌裝好的飲料在全自動(dòng)噴淋式巴氏殺菌機(jī)上，控制殺菌溫度90-92℃、殺菌時(shí)間12分鐘條件下進(jìn)行殺菌，然后冷卻、烘瓶、貼標(biāo)、打碼、檢驗(yàn)、包裝，制得果蔬生物酵素功能性營(yíng)養(yǎng)飲料。

利用上述果蔬生物酵素制備功能性保健酒的生產(chǎn)工藝為：

首先選擇符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T10781.1《濃香型白酒》優(yōu)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)、貯存期滿5年以上、酒精度在65％VOL以上的優(yōu)質(zhì)濃香型白酒基礎(chǔ)酒，用純凈水降度至45％VOL左右，用活性炭分子篩過(guò)濾設(shè)備吸附去除因降度析出的混濁狀高分子不飽和酸酯，然后在澄清后的白酒中添加入占降度白酒總重量10％的果蔬生物酵素溶液，調(diào)整果蔬生物酵素功能性保健酒酒精度在35％VOL，將調(diào)整好酒精度的果蔬生物酵素功能性保健酒降低溫度至-5℃以下，保持24小時(shí)以上，在此溫度條件下進(jìn)行低溫硅藻土機(jī)械過(guò)濾，然后，用0.2微米孔徑的高分子膜過(guò)濾設(shè)備精濾，精濾完成、澄清透明的果蔬生物酵素功能性保健酒，保持15-20℃條件下，低溫陳貯30天以上，低溫陳貯期滿后，在此溫度條件下，添加入果蔬生物酵素功能性保健酒總重量0.02‰的天然萃取蘋(píng)果精油，充分混勻，檢測(cè)各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)合格后，進(jìn)行灌裝，即得到果香與酒香馥郁、天然果蔬生物酵素風(fēng)味獨(dú)特的果蔬生物酵素功能性保健酒。