本發(fā)明涉及淡豆豉發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種淡豆豉純種發(fā)酵方法。

背景技術(shù)：

淡豆豉是我國特產(chǎn)的以大豆為原料的發(fā)酵類中藥，根據(jù)我國歷代醫(yī)書記載，其性味苦寒，具有解表，除煩，宣郁，解毒之功效。用于傷寒熱病，寒熱，頭痛，煩躁，胸悶?，F(xiàn)代研究表明，其還具有降血糖、調(diào)血脂、抗氧化、體外康肝癌細胞的作用。

淡豆豉中含有大量的異黃酮。異黃酮是黃酮類化合物中的一種，主要存在于豆科植物中，大豆異黃酮是大豆生長中形成的一類次級代謝產(chǎn)物。由于是從植物中提取，與雌激素有相似結(jié)構(gòu)，因此稱為植物雌激素。大豆異黃酮的雌激素作用影響到激素分泌、代謝生物學(xué)活性、蛋白質(zhì)合成、生長因子活性，是天然的癌癥化學(xué)預(yù)防劑。益生大豆異黃酮是從非轉(zhuǎn)基因大豆精制而成的生物活性物質(zhì)，是一種具有多種重要生理活性的天然營養(yǎng)因子，是純天然的植物雌激素，容易被人體吸收，能迅速補充營養(yǎng)。在每100克大豆樣品中，含異黃酮128毫克，傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的分離蛋白含異黃酮102毫克，而豆乳中含9.65毫克，因為豆乳含水93.27％，相當(dāng)于干物質(zhì)中每100克也含異黃酮100毫 克以上。豆腐中含異黃酮27.74毫克，其干物質(zhì)含異黃酮200毫克以上。異黃酮是一種弱的植物雌激素，大豆是人類獲得異黃酮的惟一有效來源。在雌激素生理活性強的情況下，異黃酮能起抗雌激素作用，降低受雌激素激活的癌癥如乳腺癌的風(fēng)險，而當(dāng)婦女絕經(jīng)時期雌激素水平降低，異黃酮能起到替代作用，避免潮熱等停經(jīng)期癥狀發(fā)生。異黃酮的抗癌特性十分突出，能阻礙癌細胞的生長和擴散，而且只對癌細胞有作用，對正常細胞并無影響。異黃酮還是一種有效的抗氧化劑，能阻止氧自由基的生成，而氧自由基是一種強致癌因素。可見異黃酮的抗癌作用有多種方式和途徑。

中國藥典中記載的現(xiàn)有淡豆豉的炮制方法是：取桑葉、青蒿各70～100g，加水煎煮，濾過，煎液拌入凈大豆1000g中，俟吸盡后，蒸透，取出，稍晾，再置容器內(nèi)，用煎過的桑葉、青蒿渣覆蓋，悶使發(fā)酵至黃衣上遍時，取出，除去藥渣，洗凈，置容器內(nèi)再悶15～20天，至充分發(fā)酵、香氣溢出時，取出，略蒸，干燥，即得。

中國專利CN1994116A中公開了一種利用純種制曲生產(chǎn)淡豆豉的工藝，以中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏的保藏號為CGMCC NO.1863的枯草芽孢桿菌(BACILLUS SUBTILIS)為制曲菌種，大豆為主料，桑葉和青蒿為輔料生產(chǎn)淡豆豉。具體工藝包括煎煮,過濾,將吸盡濾液的大豆蒸煮，按蒸煮大豆∶種子液＝100∶1～3(W/V)的量接種活菌，發(fā)酵，干燥等過程。由于本發(fā)明在工藝中使用了純種菌，生產(chǎn)的淡豆豉具有穩(wěn)定的營養(yǎng)和功能品質(zhì)，且安全衛(wèi)生。

提高淡豆豉中異黃酮的含量，可以提高淡豆豉的藥效，但是現(xiàn)有的淡豆豉制備方法中都存在淡豆豉產(chǎn)物中異黃酮的產(chǎn)量低的問題，因此如何通過優(yōu)化改進淡豆豉的制備工藝，提高淡豆豉中異黃酮的含量具有十分重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有的淡豆豉生產(chǎn)方法中存在的不足，本發(fā)明目的在于提供一種具有更高異黃酮含量的淡豆豉純種發(fā)酵方法。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明的淡豆豉純種發(fā)酵方法的具體步驟如下：

(1)發(fā)酵菌株活化：

將發(fā)酵菌株進行酒精消毒后，接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，輕搖混勻發(fā)酵菌，存放至22-28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)12-24h；

(6)黃豆的制備：

將干黃豆中加入純水，沒過黃豆，浸泡10-15h，于100-120℃滅菌10-20min，冷卻備用；

(7)發(fā)酵菌液的制備：

將步驟(1)培養(yǎng)后的發(fā)酵菌液取出，觀察液體培養(yǎng)基表面是否覆蓋灰白色菌膜，液體是否渾濁、有懸浮物，確認發(fā)酵菌活化情況良好后，用已滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，對發(fā)酵菌液進行5-15倍稀釋；

(8)黃豆接菌與發(fā)酵：

往步驟(2)制備好的黃豆中加入步驟(3)稀釋后的發(fā)酵菌液，黃豆與稀釋菌液的重量比為1-5:1，混勻后，放入生化培養(yǎng)箱內(nèi)，在20-37℃下培養(yǎng)1-11天；

(9)淡豆豉的回收：

將步驟(4)發(fā)酵后的產(chǎn)物取出，放入干燥箱中進行干燥，干燥至淡豆豉無粘液附著，則得到淡豆豉成品。

步驟(1)中，所述的發(fā)酵菌株是蠟樣芽孢桿菌CAK-05，保藏編號：CCTCC NO:M2016283。

保藏信息如下：

分類命名：蠟樣芽孢桿菌CAK-05(Bacillus cereus CAK-05)

保藏該生物材料樣品的單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心

地址：中國武漢武漢大學(xué)

保藏日期：2016年5月26日

保藏編號：CCTCC NO:M2016283

步驟(1)中，優(yōu)選將發(fā)酵菌株存放至25℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)18h。

步驟(1)中，所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的制備方法如下：每蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化鈉5g，加純水混合后加熱至完全溶解，加純水定容至1000mL，調(diào)定pH值于7.4至7.6，121℃高壓消毒25min，至4℃冰箱保存。

步驟(2)中，優(yōu)選黃豆浸泡12h，于115℃高壓滅菌15min。

步驟(3)中，優(yōu)選用已滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，對發(fā)酵菌液進行10倍稀釋。

步驟(4)中，優(yōu)選黃豆與稀釋菌液的重量比為3:1。

步驟(4)中，優(yōu)選在25℃下培養(yǎng)9天。

步驟(4)中，發(fā)酵過程中，每隔1至2天需翻動黃豆，以使防止位于較上位置的黃豆與菌液分離，幫助與菌液混合，促進發(fā)酵。

步驟(5)中，優(yōu)選干燥溫度為60℃。

本發(fā)明的積極效果如下：

本發(fā)明的淡豆豉純種發(fā)酵方法具有簡單、方便、易于操作的優(yōu)點，并且本發(fā)明的方法制備的淡豆豉相對于現(xiàn)有的生產(chǎn)方法極大的提高了異黃酮的含量，本發(fā)明的方法值得大力推廣，具有重大的經(jīng)濟意義和社會意義。

具體實施方式

下面的實施例是對本發(fā)明的進一步詳細描述。

實施例1

本發(fā)明的淡豆豉純種發(fā)酵方法的具體步驟如下：

(1)發(fā)酵菌株活化：

將發(fā)酵菌株進行酒精消毒后，接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，輕搖混勻發(fā)酵菌，存放至22℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)24h；

(10)黃豆的制備：

將干黃豆中加入純水，沒過黃豆，浸泡10h，于120℃滅菌10min，冷卻備用；

(11)發(fā)酵菌液的制備：

將步驟(1)培養(yǎng)后的發(fā)酵菌液取出，觀察液體培養(yǎng)基表面是否覆蓋灰白色菌膜，液體是否渾濁、有懸浮物，確認發(fā)酵菌活化情況良好后，用已滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，對發(fā)酵菌液進行15倍稀釋；

(12)黃豆接菌與發(fā)酵：

往步驟(2)制備好的黃豆中加入步驟(3)稀釋后的發(fā)酵菌液，黃豆與稀釋菌液的重量比為1:1，混勻后，放入生化培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃下培養(yǎng)1天；

(13)淡豆豉的回收：

將步驟(4)發(fā)酵后的產(chǎn)物取出，放入干燥箱中進行干燥，干燥至淡豆豉無粘液附著，則得到淡豆豉成品。

步驟(1)中，所述的發(fā)酵菌株是蠟樣芽孢桿菌，保藏編號：CCTCC NO:M2016283。

步驟(1)中，所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的制備方法如下：每蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化鈉5g，加純水混合后加熱至完全溶解，加純水定容至1000mL，調(diào)定pH值于7.4至7.6，121℃高壓消毒25min，至4℃冰箱保存。

步驟(4)中，發(fā)酵過程中，每隔1至2天需翻動黃豆，以使防止位于較上位置的黃豆與菌液分離，幫助與菌液混合，促進發(fā)酵。

實施例2

本發(fā)明的淡豆豉純種發(fā)酵方法的具體步驟如下：

(1)發(fā)酵菌株活化：

將發(fā)酵菌株進行酒精消毒后，接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，輕搖混勻發(fā)酵菌，存放至28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)12h；

(14)黃豆的制備：

將干黃豆中加入純水，沒過黃豆，浸泡15h，于100℃滅菌20min，冷卻備用；

(15)發(fā)酵菌液的制備：

將步驟(1)培養(yǎng)后的發(fā)酵菌液取出，觀察液體培養(yǎng)基表面是否覆蓋灰白色菌膜，液體是否渾濁、有懸浮物，確認發(fā)酵菌活化情況良好后，用已滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，對發(fā)酵菌液進行5倍稀釋；

(16)黃豆接菌與發(fā)酵：

往步驟(2)制備好的黃豆中加入步驟(3)稀釋后的發(fā)酵菌液，黃豆與稀釋菌液的重量比為5:1，混勻后，放入生化培養(yǎng)箱內(nèi)，在20℃下培養(yǎng)11天；

(17)淡豆豉的回收：

將步驟(4)發(fā)酵后的產(chǎn)物取出，放入干燥箱中進行干燥，干燥至淡豆豉無粘液附著，則得到淡豆豉成品。

步驟(1)中，所述的發(fā)酵菌株是蠟樣芽孢桿菌，保藏編號：CCTCC NO:M2016283。

步驟(1)中，所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的制備方法如下：每蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化鈉5g，加純水混合后加熱至完全溶解，加純水定容至1000mL，調(diào)定pH值于7.4至7.6，121℃高壓消毒25min，至4℃冰箱保存。

步驟(4)中，發(fā)酵過程中，每隔1至2天需翻動黃豆，以使防止位于較上位置的黃豆與菌液分離，幫助與菌液混合，促進發(fā)酵。

實施例3

本發(fā)明的淡豆豉純種發(fā)酵方法的具體步驟如下：

(1)發(fā)酵菌株活化：

將發(fā)酵菌株進行酒精消毒后，接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，輕搖混勻發(fā)酵菌，存放至25℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)18h；

(18)黃豆的制備：

將干黃豆中加入純水，沒過黃豆，浸泡12h，于110℃滅菌15min，冷卻備用；

(19)發(fā)酵菌液的制備：

將步驟(1)培養(yǎng)后的發(fā)酵菌液取出，觀察液體培養(yǎng)基表面是否 覆蓋灰白色菌膜，液體是否渾濁、有懸浮物，確認發(fā)酵菌活化情況良好后，用已滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，對發(fā)酵菌液進行10倍稀釋；

(20)黃豆接菌與發(fā)酵：

往步驟(2)制備好的黃豆中加入步驟(3)稀釋后的發(fā)酵菌液，黃豆與稀釋菌液的重量比為3:1，混勻后，放入生化培養(yǎng)箱內(nèi)，在25℃下培養(yǎng)9天；

(21)淡豆豉的回收：

將步驟(4)發(fā)酵后的產(chǎn)物取出，放入干燥箱中進行干燥，干燥至淡豆豉無粘液附著，則得到淡豆豉成品。

步驟(1)中，所述的發(fā)酵菌株是蠟樣芽孢桿菌，保藏編號：CCTCC NO:M2016283。

步驟(1)中，所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的制備方法如下：每蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化鈉5g，加純水混合后加熱至完全溶解，加純水定容至1000mL，調(diào)定pH值于7.4至7.6，121℃高壓消毒25min，至4℃冰箱保存。

步驟(4)中，發(fā)酵過程中，每隔1至2天需翻動黃豆，以使防止位于較上位置的黃豆與菌液分離，幫助與菌液混合，促進發(fā)酵。

步驟(5)中，干燥溫度為60℃。

對比例

現(xiàn)有淡豆豉的炮制方法如下：

取桑葉、青蒿各70～100g，加水煎煮，濾過，煎液拌入凈大豆1000g中，俟吸盡后，蒸透，取出，稍晾，再置容器內(nèi)，用煎過的桑葉、青蒿渣覆蓋，悶使發(fā)酵至黃衣上遍時，取出，除去藥渣，洗凈，置容器內(nèi)再悶15～20天，至充分發(fā)酵、香氣溢出時，取出，略蒸，干燥，即得。

對實施例1-3以及對比例制備的淡豆豉進行如下鑒定和分析：

1、淡豆豉的鑒別與檢查：

(1)淡豆豉成品的鑒別

根據(jù)中國藥典[2015]對淡豆豉的鑒別方法，將發(fā)酵菌所發(fā)酵的產(chǎn)物，隨機稱取1g搗碎，用10mL純水浸泡加熱至沸騰狀態(tài)，并保持約5～10min，過濾去渣，用移液器吸取0.5mL滴加到濾紙上，等待濾液晾干后，噴灑1％吲哚醌-醋酸試液，再次將其晾干，然后放入干燥箱內(nèi)，將溫度調(diào)至110℃，10min后取出觀察滴加部分顯色情況，顯示為紫紅色表明為淡豆豉。

(2)淡豆豉成品的合格檢查

根據(jù)中國藥典藥典[2015]對淡豆豉的檢查方法，隨機稱取發(fā)酵產(chǎn)物1g搗碎后，加入10mL純水，60℃水浴1h，過濾去渣，用移液器取1mL濾液放入一潔凈試管內(nèi)，滴加1％硫酸銅溶液和40％氫氧化鉀溶液各4滴后混勻，觀察溶液顏色變化，合格淡豆豉溶液無紫紅色出 現(xiàn)。

2、HPLC法檢測回收樣品異黃酮含量：

(1)對照品溶液的制備

分別精密稱取標準品大豆苷元2.4mg、標準品染料木素2.6mg，置入10ml容量瓶，加甲醇充分溶解后定容至指定刻度，得到0.24mg/mL大豆苷元對照品溶液，0.26mg/mL染料木素對照品溶液。

(2)供試品溶液的制備

將4組淡豆豉以及未發(fā)酵黃豆分別用中藥粉碎機打粉分裝，分別精密稱取1g，置于燒瓶中，加入70％乙醇50mL，搖均后，水浴回流1h，水浴溫度80℃，將余下液體過濾備用，濾渣用10mL 70％乙醇反復(fù)洗滌，與濾液合并后蒸干，殘渣用乙醇定容至10mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾分裝，并標記好。

(3)色譜條件

測定淡豆豉異黃酮含量方法條件如下：

色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；

柱溫：25℃；

流速：1mL/min；

流動相：乙腈：水：乙酸(35：63：2)；

檢測波長：260nm；

進樣量：15μL。

(4)上機檢測精密吸取各溶液15μL，注入高效液相色譜儀， 每樣品至少3針，根據(jù)兩種對照品的線性范圍逐步調(diào)整樣品濃度進行檢測。

檢測結(jié)果如表1所示：

表1

由表1可以看出，本發(fā)明方法制備的淡豆豉中異黃酮的含量是黃豆的10倍左右，是現(xiàn)有方法生產(chǎn)的淡豆豉的2倍左右，由此可以看出，本發(fā)明的方法通過合理的工藝優(yōu)化，從而使值得的淡豆豉中的異黃酮含量得到了極大的提高，取得了預(yù)料不到的技術(shù)效果。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。