本專利申請(qǐng)要求2014年5月29日提交的，標(biāo)題為“EnzymaticSynthesisofSolubleGlucanFiber(可溶性葡聚糖纖維的酶促合成)”的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?2/004308的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容以引用方式全文并入本文。以引用方式并入的序列表在2015年5月11日形成并且與本文一起提交的，以大小為433,860字節(jié)的名稱為“20150515_CL6056WOPCT_SequenceListing_ST25.txt”文件提供的序列表以引用的方式全文并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及可溶性α-葡聚糖纖維，包含該可溶性纖維的組合物，以及制備和使用該可溶性α-葡聚糖纖維的方法。所述可溶性α-葡聚糖纖維是在上胃腸道中高度耐消化的，在下胃腸道中表現(xiàn)出可接受的產(chǎn)氣率，作為膳食纖維具有良好的耐受性，并且具有一種或多種通常與可溶性膳食纖維相關(guān)聯(lián)的有益特性。
背景技術(shù)：
：膳食纖維(可溶性和不可溶性兩者)是對(duì)于健康、消化和預(yù)防病癥諸如心臟病、糖尿病、肥胖癥、憩室炎和便秘而言重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。然而，大多數(shù)人不食用每日推薦攝入的膳食纖維。2010年美國人膳食纖維指南(美國農(nóng)業(yè)部和美國衛(wèi)生和人類服務(wù)部，DietaryGuidelinesforAmericans，2010，第7版，Washington，DC：美國政府印刷局，2010年12月)報(bào)道了膳食纖維攝入不足是成人和兒童的公共健康問題。因此，仍然需要增加每日膳食纖維攝入量，尤其是適用于多種食品應(yīng)用的可溶性膳食纖維。歷史上，膳食纖維被定義為植物中固有的和完整的非可消化性碳水化合物和木質(zhì)素。該定義已經(jīng)擴(kuò)展為包括具有不被人類上胃腸道中的內(nèi)源性酶顯著水解并通過普遍接受的科學(xué)證據(jù)證明具有有益生理效應(yīng)的三個(gè)或更多個(gè)單體單元的碳水化合物聚合物?？扇苄缘途厶抢w維產(chǎn)品(諸如果糖、葡聚糖的低聚物等)當(dāng)前用于多種食品應(yīng)用中。然而，許多可商購獲得的可溶性纖維具有不可取的特性諸如低耐受性(造成不可取的效應(yīng)諸如腹部胃氣脹或氣體、痢疾等)、缺乏耐消化性、在低pH(例如pH4或更低)下的不穩(wěn)定性、高成本或制備方法需要至少一個(gè)酸催化的熱處理步驟以將更易消化的糖苷鍵(例如葡聚糖中的α-(1，4)鍵)隨機(jī)重排為具有更耐消化性的鍵的更高度支化的化合物。僅使用天然存在的酶以由安全和容易獲得的底物諸如蔗糖合成適宜的葡聚糖纖維的方法可能對(duì)消費(fèi)者更具吸引力。各種菌種具有由蔗糖合成右旋糖酐低聚物的能力。Jeanes等人(JACS(1954)76：5041-5052)描述了由96種細(xì)菌菌株制備的右旋糖酐。右旋糖酐被報(bào)道包含顯著百分比(50％-97％)的α-(1，6)糖苷鍵與不同量的α-(1，3)和α-(1，4)糖苷鍵。未報(bào)道存在于單獨(dú)菌株內(nèi)的酶(數(shù)量和類型兩者)，并且在某些菌株中的右旋糖酐特征表現(xiàn)出可變性，其中由每種菌種產(chǎn)生的右旋糖酐可以是由每種菌種產(chǎn)生的多于一種酶的產(chǎn)物。屬于葡糖苷水解酶家族70的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(葡聚糖蔗糖酶；GTF)能夠聚合蔗糖的D-葡糖基單元以形成同寡糖或同多糖。葡聚糖蔗糖酶通過形成的糖低聚物的類型進(jìn)一步分類。例如，右旋糖酐蔗糖酶是產(chǎn)生主要具有α-(1，6)糖苷鍵的糖低聚物(“右旋糖酐”)的那些，并且變聚糖蔗糖酶是趨于產(chǎn)生具有富含α-(1，3)糖苷鍵的主鏈的不溶性糖低聚物的那些。變聚糖蔗糖酶由常見氨基酸來表征。例如，A.Shimamura等人(J.Bacteriology，(1994)176：4845-4850)研究了GTF與變異鏈球菌(Streptococcusmutans)GS5的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，并且識(shí)別了影響由GTF合成的葡聚糖產(chǎn)物的性質(zhì)的多個(gè)氨基酸位置，其中產(chǎn)生α-(1，3)-和α-(1，6)-異頭鍵的相對(duì)量的變化。羅伊糖蔗糖酶(Reuteransucrases)趨于產(chǎn)生富含α-(1，4)、α-(1，6)和α-(1，4，6)糖苷鍵的糖低聚物，并且交替糖蔗糖酶是趨于產(chǎn)生具有由交替的α-(1，3)和α-(1，6)糖苷鍵組成的線性主鏈的糖低聚物的那些。這些酶中的一些能夠在不同程度上引入其它糖苷鍵，常常作為支化點(diǎn)。V.Monchois等人(FEMSMicrobiolRev.，(1999)23：131-151)討論了提出的多種葡聚糖蔗糖酶的作用機(jī)制和結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。H.Leemhuis等人(J.Biotechnol.，(2013)163：250-272)描述了葡聚糖蔗糖酶的特征性三維結(jié)構(gòu)、反應(yīng)、機(jī)制和α-葡聚糖分析。描述使用葡聚糖蔗糖酶(野生型、截短型或其變體)制備糖低聚物的專利和公布的專利申請(qǐng)的非限制性列表已被報(bào)道用于右旋糖酐(美國專利4,649,058和7,897,373；以及美國專利申請(qǐng)公布2011-0178289A1)、羅伊糖(reuteran)(美國專利申請(qǐng)公布2009-0297663A1和美國專利6,867,026)、交替糖和/或麥芽交替糖低聚物(“MAO”)(美國專利7,402,420和7,524,645；美國專利申請(qǐng)公布2010-0122378A1；和歐洲專利EP1151085B1)、α-(1，2)支鏈右旋糖酐(美國專利7,439,049)、和包含α-(1，3)、α-(1，6)和α-(1，3，6)鍵的混合物的混合鍵糖低聚物(缺乏交替糖樣主鏈)(美國專利申請(qǐng)公布2005-0059633A1)。授予Kol-Jakon等人的美國專利申請(qǐng)公布2009-0300798A1公開了表達(dá)產(chǎn)生改性淀粉的變聚糖蔗糖酶的基因改性的植物細(xì)胞。已經(jīng)報(bào)道了使用葡糖基轉(zhuǎn)移酶和α-葡聚糖水解酶的組合來酶促制備異麥芽糖、異麥芽低聚糖和右旋糖酐。美國專利2,776,925描述了用于酶促制備中間分子量的右旋糖酐的方法，該方法包括右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的同時(shí)作用。美國專利4,861,381A描述了使用右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的組合酶促制備包含39％-80％異麥芽糖的組合物。Goulas等人(Enz.Microb.Tech(2004)35：327-338)描述了使用右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶由蔗糖批量合成異麥芽低聚糖(IMO)。美國專利8,192,956公開了使用重組表達(dá)的雜交基因酶促制備用于臨床應(yīng)用的異麥芽低聚糖(IMO)和低分子量右旋糖酐，所述雜交基因包含融合在一起的編碼α-葡聚糖酶的基因和編碼右旋糖酐蔗糖酶的基因，其中葡聚糖酶基因是來自節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)的基因，其中右旋糖酐蔗糖酶基因是來自明串珠菌屬(Leuconostocsp.)的基因。Hayacibara等人(Carb.Res.(2004)339：2127-2137)描述了突變酶和右旋糖酐酶對(duì)由來自牙斑中蔗糖的糖基轉(zhuǎn)移酶形成的葡聚糖的產(chǎn)生和結(jié)構(gòu)的影響。報(bào)道的研究目的在于評(píng)估在突變酶和右旋糖酐酶存在下(單獨(dú)的或組合的)由GTF合成的葡聚糖的產(chǎn)生和結(jié)構(gòu)，試圖闡明在牙斑形成期間可發(fā)生一些相互作用。突變酶(葡聚糖內(nèi)切-1，3-α-葡聚糖水解酶)由一些真菌(包括木霉屬、曲霉屬、青霉屬和枝孢菌屬)以及一些細(xì)菌(包括鏈霉菌屬、黃桿菌屬、擬桿菌屬、芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬)產(chǎn)生。W.Suyotha等人(Biosci，Biotechnol.Biochem.，(2013)77：639-647)描述了結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域缺失對(duì)來自環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)KA-304的α-1，3-葡聚糖水解酶的活性的影響。Y.Hakamada等人(Biochimie，(2008)90：525-533)描述了多種突變酶的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)分析，并且提出了突變酶的系統(tǒng)發(fā)育樹。I.Shimotsuura等人(Appl.Environ.Microbiol.，(2008)74：2759-2765)報(bào)道了來自類芽孢桿菌屬(Paenibacillussp.)菌株RM1的突變酶的生物化學(xué)和分子特征，其中N-端結(jié)構(gòu)域具有強(qiáng)突變結(jié)合活性但不具有突變酶活性，然而C端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)突變酶活性但具有顯著低于完整蛋白的突變結(jié)合活性。C.C.Fuglsang等人(J.Biol.Chem.，(2000)275：2009-2018)描述了重組真菌突變酶(內(nèi)切葡聚糖酶)的生物化學(xué)分析，其中所述真菌突變酶由NH2-端催化結(jié)構(gòu)域和假定的COOH-端多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。右旋糖酐酶(α-1，6-葡聚糖-6-葡聚糖水解酶)是水解右旋糖酐的α-1，6-鍵的酶。N.Suzuki等人(J.Biol.Chem.(2012)287：19916-19926)描述了變異鏈球菌(Streptococcusmutans)右旋糖酐酶的晶體結(jié)構(gòu)，并且識(shí)別了三個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括含有酶的催化模塊的結(jié)構(gòu)域A，和右旋糖酐結(jié)合結(jié)構(gòu)域C；還相對(duì)于酶結(jié)構(gòu)描述了催化機(jī)制。A.M.Larsson等人(Structure，(2003)11：1111-1121)報(bào)道了來自朱黃青霉(Penicilliumminioluteum)的右旋糖酐酶的晶體結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)用于限定反應(yīng)機(jī)制。H-KKang等人(Yeast，(2005)22：1239-1248)描述了來自斯達(dá)氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)的右旋糖酐酶的特征。T.Igarashi等人(Microbiol.Immunol.，(2004)48：155-162)描述了來自大鼠鏈球菌(Streptococcusrattus)的右旋糖酐酶的分子特征，其中氨基酸序列的保守區(qū)包含兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，催化位點(diǎn)和右旋糖酐結(jié)合位點(diǎn)。本領(lǐng)域中已經(jīng)報(bào)道了各種糖低聚物組合物。例如，美國專利6,486,314公開了α-葡聚糖，其包含至少20個(gè)，至多達(dá)約100,000個(gè)α-葡糖酐單元，其中38％-48％為4-連接的葡糖酐單元，17％-28％為6-連接的葡糖酐單元，并且7％-20％為4，6-連接的葡糖酐單元，和/或葡萄糖-低聚糖，其包含至少兩個(gè)4-連接的葡糖酐單元、至少一個(gè)6-連接的葡糖酐單元和至少一個(gè)4，6-連接的葡糖酐單元。美國專利申請(qǐng)公布2010-0284972A1公開了用于改善受試者的健康的組合物，其包含α-(1，2)-支化α-(1，6)低聚右旋糖酐。美國專利申請(qǐng)公布2011-0020496A1公開了支鏈糊精，所述糊精具有以下結(jié)構(gòu)，其中葡萄糖或異麥芽低聚糖通過α-(1，6)糖苷鍵連接至糊精的非還原端，并且具有10至52的DE。美國專利6,630,586公開了支鏈麥芽糖糊精組合物，其包含22％-35％的(1，6)糖苷鍵；還原糖含量為＜20％；高分散性指數(shù)(Mp/Mn)＜5；并且數(shù)均分子量(Mn)為4500g/mol或更小。美國專利7,612,198公開了可溶性、高度支化的葡萄糖聚合物，其具有小于1％的還原糖含量，介于13％和17％之間的α-(1，6)糖苷鍵的含量和具有介于0.9×105和1.5×105道爾頓之間的值的分子量，其中所述可溶性高度支化的葡萄糖聚合物具有以下支鏈長(zhǎng)度分布曲線：70％至85％的聚合度(DP)小于15，10％至14％的DP介于15和25之間，并且8％至13％的DP大于25。糖低聚物和/或包含所述低聚物的碳水化合物組合物已經(jīng)被描述為適用于用作食品應(yīng)用中的可溶性纖維的來源(美國專利8,057,840和美國專利申請(qǐng)公布2010-0047432A1和2011-0081474A1)。美國專利申請(qǐng)公布2012-0034366A1公開了低糖、包含纖維的碳水化合物組合物，其被報(bào)道為適用于用作食物產(chǎn)品中的傳統(tǒng)玉米糖漿、高果糖玉米糖漿和其它甜味劑的替代物。仍然需要開發(fā)新的可溶性α-葡聚糖纖維組合物，其耐消化，表現(xiàn)出下胃腸道中氣體形成的相對(duì)較低含量和/或較慢速率、耐受良好、具有低粘度、并且適用于食品和其它應(yīng)用中。優(yōu)選地，α-葡聚糖纖維組合物可使用已經(jīng)與在人類中安全使用相關(guān)聯(lián)的酶由蔗糖酶促制備。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種可溶性α-葡聚糖纖維組合物，其適用于多種應(yīng)用，包括但不限于，食品應(yīng)用、改善胃腸健康的組合物和個(gè)人護(hù)理組合物。可溶性纖維組合物可直接用作食品中的成分或可摻入適用于食品應(yīng)用的碳水化合物組合物中。本發(fā)明還提供了用于制備可溶性α-葡聚糖纖維組合物的方法。本發(fā)明還提供了在食品應(yīng)用中使用可溶性纖維組合物或包含所述可溶性纖維組合物的碳水化合物組合物的方法。在某些方面，提供了用于改善受試者的健康的方法，所述方法包括以有效量將本發(fā)明可溶性纖維組合物施用于受試者，以有效發(fā)揮通常與可溶性膳食纖維相關(guān)聯(lián)的至少一種健康有益效果，諸如改變食品的含熱量、降低食品的血糖指數(shù)、改變糞便重量和支持腸功能、改變膽固醇代謝、通過結(jié)腸發(fā)酵提供能量生成代謝物、并且可提供益生元效應(yīng)。本發(fā)明提供一種可溶性α-葡聚糖纖維組合物，基于干固體，其包含以下物質(zhì)：a.10％-30％的α-(1，3)糖苷鍵；b.65％-87％的α-(1，6)糖苷鍵；c.少于5％的α-(1，3，6)糖苷鍵；d.小于5000道爾頓的重均分子量；e.在20℃下，在水中12重量％下，小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；f.在4至40范圍內(nèi)的右旋糖當(dāng)量(DE)；以及g.小于12％的可消化性，如分析化學(xué)師協(xié)會(huì)(AssociationofAnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所測(cè)量；h.在25℃下，pH7水中至少20％(重量/重量)的溶解度；以及i.小于5的多分散指數(shù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種制備可溶性α-葡聚糖纖維組合物的方法，所述方法包括：a.提供反應(yīng)組分的系列，其包括：i.蔗糖；ii至少一種具有葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，所述多肽包含與選自SEQIDNO：1和3的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；iii.至少一種具有α-葡聚糖水解酶活性的多肽；以及iv.任選地一種或多種受體；b.在適當(dāng)?shù)暮磻?yīng)條件下將所述反應(yīng)組分的系列合并，由此制備包含可溶性α-葡聚糖纖維組合物的產(chǎn)物；以及c.任選地，將可溶性α-葡聚糖纖維組合物與步驟(b)的產(chǎn)物分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種制備上述可溶性α-葡聚糖纖維組合物的方法，所述方法包括：a.提供反應(yīng)組分的系列，其包括：i.蔗糖；ii至少一種多肽，其具有葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性并且包含與選自SEQIDNO：13、16、17、19、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及iii.任選地一種或多種受體；b.在適當(dāng)?shù)暮磻?yīng)條件下將所述反應(yīng)組分的系列合并以形成單一反應(yīng)混合物，由此形成包含葡萄糖低聚物的產(chǎn)物混合物；c.任選地將上述可溶性α-葡聚糖纖維組合物與包含葡萄糖低聚物的產(chǎn)物混合物分離；以及d.任選地，將可溶性α-葡聚糖纖維組合物濃縮。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種用于制備共混碳水化合物組合物的方法，所述方法包括將上述可溶性α-葡聚糖纖維組合物與下列物質(zhì)合并：?jiǎn)翁?、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖漿、高果糖玉米糖漿、異構(gòu)化糖、麥芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纖維二糖、異麥芽糖、蜂蜜、楓糖、水果衍生的甜味劑、山梨醇、麥芽糖醇、異麥芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤蘚糖醇、二氫查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、乙?；前匪徕洝⒘μ?、紐甜、甘草甜素、奇異果甜蛋白、三氯蔗糖、L-天冬氨?；?L-苯丙氨酸甲酯、糖精、麥芽糖糊精、淀粉、土豆淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纖維、抗性麥芽糖糊精、支鏈麥芽糖糊精、菊粉、聚右旋糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、低聚龍膽糖、半纖維素、果糖低聚物糖漿、低聚異麥芽糖、填料、賦形劑、粘結(jié)劑或它們的任意組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供制備食物產(chǎn)品的方法，所述方法包括將一種或多種可食用食品成分與本發(fā)明的可溶性α-葡聚糖纖維組合物、或包含本發(fā)明的可溶性α-葡聚糖纖維組合物的碳水化合物組合物、或它們的組合混合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供減小食品或飲料的血糖指數(shù)的方法，所述方法包括將本發(fā)明的可溶性α-葡聚糖纖維組合物摻入食品或飲料中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于在哺乳動(dòng)物中抑制血糖含量升高的方法，所述方法包括將本發(fā)明的可溶性α-葡聚糖纖維組合物施用于哺乳動(dòng)物的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于減少哺乳動(dòng)物活體中脂質(zhì)的方法，所述方法包括將本發(fā)明的可溶性α-葡聚糖纖維組合物施用于哺乳動(dòng)物的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于治療哺乳動(dòng)物便秘的方法，所述方法包括將本發(fā)明的可溶性α-葡聚糖纖維組合物施用于哺乳動(dòng)物的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供改變哺乳動(dòng)物結(jié)腸中脂肪酸產(chǎn)生的方法，所述方法包括將本發(fā)明可溶性α-葡聚糖纖維組合物施用于哺乳動(dòng)物的步驟；優(yōu)選地其中短鏈脂肪酸產(chǎn)生增加，支鏈脂肪酸產(chǎn)生減少，或上述兩者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含本發(fā)明可溶性α-葡聚糖纖維組合物和至少一種多元醇的低生齲性組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種組合物，其包含0.01重量％至99重量％(基于干固體)的本發(fā)明可溶性α-葡聚糖纖維組合物：合生素、肽、肽水解產(chǎn)物、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、大豆蛋白、乳蛋白、氨基酸、多元醇、多酚、維生素、礦物質(zhì)、草藥、草藥提取物、脂肪酸、多不飽和脂肪酸(PUFA)、植物甾類、甜菜堿、類胡蘿卜素、消化酶、益生菌生物或它們的任意組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，還提供由本文所述方法中任一種制備的產(chǎn)品；優(yōu)選地，其中所述產(chǎn)品為本發(fā)明的可溶性α-葡聚糖組合物。生物序列簡(jiǎn)述下面的序列遵循37C.F.R.§§1.821-1.825(“對(duì)包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公開內(nèi)容的專利申請(qǐng)的要求-序列規(guī)則”)，并且符合世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)ST.25標(biāo)準(zhǔn)(2009)以及歐洲專利公約(EPC)和專利合作條約(PCT)的序列表要求(規(guī)則5.2和49.5(a-bis)以及行政規(guī)程的208節(jié)和附錄C)。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的規(guī)定。SEQIDNO：1為變異鏈球菌(Streptococcusmutans)NN2025Gtf-B葡糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列，如存在于gi：290580544中。SEQIDNO：2為編碼截短的變異鏈球菌(Streptococcusmutans)NN2025Gtf-B(gi：290580544)葡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。SEQIDNO：3為截短的變異鏈球菌(Streptococcusmutans)NN2025Gtf-B葡糖基轉(zhuǎn)移酶(本文中也稱為“0544葡糖基轉(zhuǎn)移酶”或“GTF0544”)的氨基酸序列。SEQIDNO：4為腐殖質(zhì)類芽孢桿菌(Paenibacillushumicus)突變酶的氨基酸序列，如存在于gi：257153264)中。SEQIDNO：5為編碼用于在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)的腐殖質(zhì)類芽孢桿菌突變酶(gi：257153265，其中g(shù)i：257153264為對(duì)應(yīng)的多核苷酸序列)的核酸序列。SEQIDNO：6為用于在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)的成熟腐殖質(zhì)類芽孢桿菌突變酶(gi：257153264；本文中稱為“3264突變酶”或“MUT3264”)的氨基酸序列。SEQIDNO：7為用于表達(dá)載體中的枯草芽孢桿菌AprE信號(hào)肽的氨基酸序列，所述表達(dá)載體偶聯(lián)到各種酶以在枯草芽孢桿菌中表達(dá)。SEQIDNO：8為編碼用于在枯草芽孢桿菌宿主BG6006中表達(dá)的腐殖質(zhì)類芽孢桿菌突變酶的核酸序列。SEQIDNO：9為用于在枯草芽孢桿菌宿主BG6006中表達(dá)的成熟腐殖質(zhì)類芽孢桿菌突變酶的氨基酸序列。如本文所用，該突變酶還可在本文中稱為“MUT3264”。SEQIDNO：10為編碼馬爾尼菲青霉18224TM突變酶的核酸序列。SEQIDNO：11為編碼馬爾尼菲青霉18224TM突變酶(gi：212533325；本文中也稱為“3325突變酶”或“MUT3325”)的氨基酸序列。SEQIDNO：12為質(zhì)粒pTrex3的多核苷酸序列。SEQIDNO：13為變異鏈球菌(Streptococcusmutans)葡糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列，如在gi：3130088中所提供的葡糖基轉(zhuǎn)移酶。SEQIDNO：14為編碼變異鏈球菌(Streptococcusmutans)葡糖基轉(zhuǎn)移酶的截短型式的核酸序列。SEQIDNO：15為質(zhì)粒pMP69的核酸序列。SEQIDNO：16為截短的變異鏈球菌(Streptococcusmutans)葡糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列，本文中稱為“GTF0088”。SEQIDNO：17為變異鏈球菌(Streptococcusmutans)LJ23葡糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列，如以gi：387786207提供的(也稱為“6207”葡糖基轉(zhuǎn)移酶或“GTF6207”)。SEQIDNO：18為編碼截短的變異鏈球菌(Streptococcusmutans)LJ23葡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。SEQIDNO：19為變異鏈球菌(Streptococcusmutans)LJ23葡糖基轉(zhuǎn)移酶的截短型式的氨基酸序列，本文中也稱為“GTF6207”。SEQIDNO：20為實(shí)施例8中使用的1630bp核酸序列。SEQIDNO：21-22為引物。SEQIDNO：23為質(zhì)粒p6207-1的核酸序列。SEQIDNO：24為終止序列的多核苷酸序列。SEQIDNO：25為接頭序列的多核苷酸序列。SEQIDNO：26為GTF0088的天然核苷酸序列。SEQIDNO：27為GTF5330的天然核苷酸序列。SEQIDNO：28為由SEQIDNO：27編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：29為GTF5318的天然核苷酸序列。SEQIDNO：30為由SEQIDNO：29編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：31為GTF5326的天然核苷酸序列。SEQIDNO：32為由SEQIDNO：31編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：33為GTF5312的天然核苷酸序列。SEQIDNO：34為由SEQIDNO：33編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：35為GFT5334的天然核苷酸序列。SEQIDNO：36為由SEQIDNO：35編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：37為GTF0095的天然核苷酸序列。SEQIDNO：38為由SEQIDNO：37編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：39為GTF0074的天然核苷酸序列。SEQIDNO：40為由SEQIDNO：39編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：41為GT5320的天然核苷酸序列。SEQIDNO：42為由SEQIDNO：41編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：43為GTF0081的天然核苷酸序列。SEQIDNO：44為由SEQIDNO：43編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：45為GTF5328的天然核苷酸序列。SEQIDNO：46為由SEQIDNO：45編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：47為GTF0088的T1C-端截短形式的核苷酸序列。SEQIDNO：48為由SEQIDNO：47編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：49為GTF5318的T1C-端截短形式的核苷酸序列。SEQIDNO：50為由SEQIDNO：49編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：51為GTF5328的T1C-端截短形式的核苷酸序列。SEQIDNO：52為由SEQIDNO：51編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：53為GTF5330的T1C-端截短形式的核苷酸序列。SEQIDNO：54為由SEQIDNO：53編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：55為GTF0088的T3C-端截短形式的核苷酸序列。SEQIDNO：56為由SEQIDNO：55編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：57為GTF5318的T3C-端截短形式的核苷酸序列。SEQIDNO：58為由SEQIDNO：57編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：59為GTF5328的T3C-端截短形式的核苷酸序列。SEQIDNO：60為由SEQIDNO：59編碼的氨基酸序列。SEQIDNO：61為GTF5330的T3C-端截短形式的核苷酸序列。SEQIDNO：62為由SEQIDNO：61編碼的氨基酸序列。具體實(shí)施方式在本公開中，使用了大量術(shù)語和縮寫。除非另外特別說明，應(yīng)用下述定義。如本文所用，在本發(fā)明的元件或組分之前的冠詞“一個(gè)”、“一種”和“所述”旨在表明元件或組分的實(shí)例的數(shù)量(即發(fā)生率)為非限制性的。因此，應(yīng)將“一個(gè)”、“一種”和“所述”理解為包括一個(gè)(種)或至少一個(gè)(種)，并且元件或組分的詞語單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)指代，除非有數(shù)字明顯表示單數(shù)。如本文所用，術(shù)語“包含”是指如權(quán)利要求中提及的所述特征、整數(shù)、步驟或組分的存在，但它不預(yù)先排除一種或多種其它特征、整數(shù)、步驟、組分或其組的存在或添加。術(shù)語“包含”旨在包括由術(shù)語“基本由……組成”和“由……組成”所涵蓋的實(shí)施方案。類似地，術(shù)語“基本由……組成”旨在包括由術(shù)語“由……組成”所涵蓋的實(shí)施方案。如本文所用，用術(shù)語“約”修飾所用的成分或反應(yīng)物的數(shù)量時(shí)是指數(shù)值量的變化，該變化可能發(fā)生在例如典型的測(cè)量和用于制備濃縮液或?qū)嶋H使用溶液的液體處理過程中；這些過程中的偶然誤差中；制造、來源、或用于制備組合物或?qū)嵤┓椒ǖ某煞值募兌鹊牟町愔械鹊?。術(shù)語“約”還涵蓋由于相對(duì)于由特定起始混合物所得的組合物的不同平衡條件而不同的量。無論是否通過術(shù)語“約”來修飾，權(quán)利要求都包括量的等同量。當(dāng)存在時(shí)，所有的范圍均包括端值以及其中的組合。例如，當(dāng)列出范圍“1至5”時(shí)，所列范圍應(yīng)視為包括范圍“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2和4-5”、“1-3和5”等等。如本文所用，術(shù)語“可得自”應(yīng)當(dāng)是指源材料(例如，蔗糖)，其能夠得自特定來源，但不必須限于所述特定來源。如本文所用，術(shù)語“有效量”將是指適于實(shí)現(xiàn)期望效應(yīng)的所用的或所施用的物質(zhì)量。物質(zhì)的有效量可根據(jù)應(yīng)用變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員將通常能夠在不進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的情況下確定特定應(yīng)用或受試者的有效量。如本文所用，術(shù)語“分離的”是指物質(zhì)呈自然界中不存在的形式或環(huán)境。分離的物質(zhì)的非限制性示例包括：(1)任何非天然存在的物質(zhì)，(2)從一種或多種或所有所述物質(zhì)在自然界中與之締合的天然存在的成分中至少部分地去除的任何物質(zhì)，包括但不限于，任何宿主細(xì)胞、酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子；(3)相對(duì)于存在于自然界中的物質(zhì)，通過人工改性的任何物質(zhì)；或者(4)通過相對(duì)于與所述物質(zhì)天然締合的其它組分，增加所述物質(zhì)的量來改性的任何物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“非常低至沒有可消化性”、“很少或沒有可消化性”、和“低至無可消化性”將是指如通過國際官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)方法2009.01(“AOAC2009.01”，McCleary等人，(2010)J.AOACInt.，93(1)，221-233)所測(cè)量的可溶性葡聚糖纖維的可消化性的相對(duì)水平；其中很少或沒有可消化性將是指基于干固體(d.s.b.)，少于12％的可溶性葡聚糖纖維組合物是可消化的，優(yōu)選地小于5％可消化，更優(yōu)選地小于1％可消化。在另一方面，可消化性的相對(duì)水平可另選地使用AOAC2011.25(綜合總膳食纖維測(cè)定，IntegratedTotalDietaryFiberAssay)(McCleary等人，2012，J.AOACInt.，95(3)，824-844)測(cè)定。如本文所用，術(shù)語“水溶性”將是指由在25℃下在pH7的水中可以20重量％或更高溶解的纖維構(gòu)成的本發(fā)明的葡聚糖纖維組合物。如本文所用，術(shù)語“可溶性纖維”、“可溶性葡聚糖纖維”、“α-葡聚糖纖維”、“甘蔗糖纖維”、“葡萄糖纖維”、“甜菜糖纖維”、“可溶性膳食纖維”和“可溶性葡聚糖纖維組合物”是指由水溶性葡萄糖低聚物構(gòu)成的本發(fā)明纖維組合物，所述葡萄糖低聚物具有3或更大的葡萄糖聚合度，其為耐消化的(即表現(xiàn)出非常低至沒有可消化性)，在人小腸中具有很少或沒有吸收，并且在下胃腸道中至少部分地可發(fā)酵。可溶性葡聚糖纖維組合物的可消化性使用AOAC方法2009.01測(cè)量。本發(fā)明可溶性葡聚糖纖維組合物由可得自例如甘蔗和/或糖周甜菜的蔗糖(α-D-吡喃葡糖基β-D-呋喃果糖苷；CAS#57-50-1)酶促合成。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的可溶性α-葡聚糖纖維組合物不是交替糖或麥芽交替低聚糖。如本文所用，“重均分子量”或“Mw”計(jì)算為Mw＝∑NiMi2/∑NiMi；其中Mi為鏈的分子量并且Ni為所述分子量的鏈數(shù)。重均分子量可通過諸如靜態(tài)光散射、小角中子散射、X射線散射和沉降速度的技術(shù)來測(cè)定。如本文所用，“數(shù)均分子量”或“Mn”是指樣品中所有聚合物鏈的統(tǒng)計(jì)平均分子量。數(shù)均分子量計(jì)算為Mn＝∑NiMi/∑Ni；其中Mi為鏈的分子量并且Ni為所述分子量的鏈數(shù)。聚合物的數(shù)均分子量可通過如下技術(shù)來測(cè)定：諸如凝膠滲透色譜法，通過(Mark-Houwink方程)測(cè)定粘度，和依數(shù)法諸如蒸氣壓滲透壓、端基測(cè)定或質(zhì)子NMR。如本文所用，“多分散指數(shù)”、“PDI”、“不均勻性指數(shù)”、和“分散性”是指給定聚合物(諸如葡萄糖低聚物)樣品中分子質(zhì)量分布的量度，并且可通過將重均分子量除以數(shù)均分子量來計(jì)算(PDI＝Mw/Mn)來計(jì)算。應(yīng)當(dāng)注意，如本文所用，術(shù)語“葡萄糖”和“吡喃葡萄糖”被認(rèn)為是同義詞并可互換使用。類似的，用于本文的術(shù)語“葡糖基”和“吡喃葡糖基”被認(rèn)為是同義詞并可互換使用。如本文所用，“糖苷鍵(glycosidiclinkage)”或“糖苷鍵(glycosidicbond)”是指連接糖低聚物(低聚糖和/或多糖)內(nèi)的糖單體的共價(jià)鍵。糖苷鍵的示例可包括具有以下鍵的α-連接的葡萄糖低聚物：1，6-α-D-糖苷鍵(本文中也稱為α-D-(1，6)鍵或簡(jiǎn)稱為“α-(1，6)”鍵)；1，3-α-D-糖苷鍵(本文中也稱為α-D-(1，3)鍵或簡(jiǎn)稱為“α-(1，3)”鍵)；1，4-α-D-糖苷鍵(本文中也稱為α-D-(1，4)鍵或簡(jiǎn)稱為“α-(1，4)”鍵)；1，2-α-D-糖苷鍵(本文中也稱為α-D-(1，2)鍵或簡(jiǎn)稱為“α-(1，2)”鍵)；以及通常與支鏈糖低聚物締合的此類鍵的組合。如本文所用，術(shù)語“葡聚糖蔗糖酶”、“葡糖基轉(zhuǎn)移酶”、“葡糖苷水解酶70型”、“GTF”和“GS”是指分類為通常存在于乳酸菌諸如鏈球菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬或乳桿菌屬中的糖苷-水解酶家族70的轉(zhuǎn)葡糖苷酶(參見，CarbohydrateActiveEnzymesdatabase；“CAZy”；Cantarel等人，(2009)NucleicAcidsRes37：D233-238)。GTF酶能夠聚合蔗糖的D-葡糖基單元以形成同寡糖或同多糖。葡糖基轉(zhuǎn)移酶可通過特征性結(jié)構(gòu)特征識(shí)別，諸如Leemhuis等人(J.Biotechnology(2013)162：250-272)和Monchois等人(FEMSMicro.Revs.(1999)23：131-151)中所述的那些。取決于GTF酶的特異性，可形成包含各種糖苷鍵諸如α-(1，2)、α-(1，3)、α-(1，4)和α-(1，6)的直鏈和/或支鏈葡聚糖。葡糖基轉(zhuǎn)移酶還可將D-葡糖基單元轉(zhuǎn)移到羥基受體基團(tuán)上。受體的非限制性列表包括碳水化合物、醇、多元醇和類黃酮。特異性受體還可包括麥芽糖、異麥芽糖、異麥芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖。所得葡糖基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)取決于酶特異性。葡糖基轉(zhuǎn)移酶序列的非限制性列表以氨基酸SEQIDNO：1、3、13、16、17、19、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62提供。在一個(gè)方面，葡糖基轉(zhuǎn)移酶以截短形式和/或成熟形式表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有葡萄基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽包含與SEQIDNO：1、3、13、16、17、19、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或62具有至少90％同一性，優(yōu)選地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。如本文所用，術(shù)語“異麥芽低聚糖”或“IMO”是指基本上由通常具有DP2至20的平均大小的α-D-(1，6)糖苷鍵構(gòu)成的葡萄糖低聚物。異麥芽低聚糖商業(yè)上可由α-淀粉酶、普魯蘭酶、β-淀粉酶和α-葡糖苷酶對(duì)玉米淀粉或淀粉衍生物產(chǎn)物的酶促反應(yīng)制成。可商購獲得的產(chǎn)品包括異麥芽低聚糖(DP的范圍是從3到8，例如異麥芽三糖、異麥芽四糖、異麥芽五糖、異麥芽六糖、異麥芽七糖、異麥芽八糖)的混合物，并且還可包括潘糖。如本文所用，術(shù)語“右旋糖酐”是指包含至少95％α-D-(1，6)糖苷鍵(通常具有在支化點(diǎn)處的多達(dá)5％的α-D-(1，3)糖苷鍵)的水溶性α-葡聚糖，如通過國際官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)方法2009.01(“AOAC2009.01”)所測(cè)量的，其多于10％是可消化的。右旋糖酐常常具有大于1000kDa的平均分子量。如本文所用，能夠由蔗糖合成右旋糖酐的酶可被描述為“右旋糖酐蔗糖酶”(EC2.4.1.5)。如本文所用，術(shù)語“變聚糖”是指水不溶性α-葡聚糖，其主要包含(存在50％或更多的糖苷鍵)的1，3-α-D糖苷鍵并且通常具有常常大于9的聚合度(DP)。能夠由蔗糖合成包含大于50％的1，3-α-D糖苷鍵的變聚糖或α-葡聚糖低聚物的酶可被描述為“變聚糖蔗糖酶”(EC2.4.1.-)，前提條件是所述酶不產(chǎn)生交替糖。如本文所用，術(shù)語“交替糖”是指在至少50％的直鏈低聚糖主鏈內(nèi)具有交替的1，3-α-D糖苷鍵和1，6-α-D糖苷鍵的α-葡聚糖。能夠由蔗糖合成交替糖的酶可被描述為“交替糖蔗糖酶”(EC2.4.1.140)。如本文所用，術(shù)語“羅伊糖”是指在支化點(diǎn)處包含1，4-α-D-糖苷鍵(通常＞50％)；1，6-α-D-糖苷鍵；以及4，6--二取代的α-葡糖基單元的可溶性α-葡聚糖。能夠由蔗糖合成羅伊糖的酶可被描述為“羅伊糖蔗糖酶”(EC2.4.1.-)。如本文所用，術(shù)語“α-葡聚糖水解酶”和“葡聚糖水解酶”將是指能夠水解α-葡聚糖低聚物的酶。如本文所用，葡聚糖水解酶可由針對(duì)某些α-D-糖苷鍵的內(nèi)切水解活性來定義。示例可包括但不限于，右旋糖酐酶(EC3.2.1.1；能夠內(nèi)切水解α-(1，6)-連接的糖苷鍵)、突變酶(EC3.2.1.59；能夠內(nèi)切水解α-(1，3)-連接的糖苷鍵)和交替糖酶(alternanases)(EC3.2.1.-；能夠內(nèi)切水解裂解交替糖(alternan))。各種因素包括但不限于某些α-葡聚糖內(nèi)的支化程度、支化類型和相對(duì)分支長(zhǎng)度，可不利地影響α-葡聚糖水解酶內(nèi)切水解一些糖苷鍵的能力。如本文所用，術(shù)語“右旋糖酐酶”(α-1，6-葡聚糖-6-葡聚糖水解酶；EC3.2.1.11)是指能夠內(nèi)切水解1，6-α-D-糖苷鍵(主要存在于右旋糖酐中的鍵)的酶。已知右旋糖酐酶可用于多種應(yīng)用中，包括用作用于預(yù)防齲齒、牙斑和/或牙垢的牙粉中的成分和用于水解原糖果汁或甘蔗和糖用甜菜的糖漿。已知多種微生物能夠產(chǎn)生右旋糖酐酶，其中為青霉屬、擬青霉屬、曲霉屬、鐮孢霉屬、穗孢屬、輪枝孢屬、蠕孢菌屬和毛殼霉屬的真菌；乳酸菌屬、鏈球菌屬、纖維弧菌屬、噬細(xì)胞菌屬、枯草芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、節(jié)桿菌屬和黃桿菌屬的細(xì)菌，以及酵母諸如斯達(dá)氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)。食品級(jí)右旋糖酐酶是可商購獲得的。食品級(jí)糊精酶的示例為PlusL，由NovozymesA/S(Bagsvaerd，Denmark)出售的來自毛殼菌(Chaetomiumerraticum)的酶。如本文所用，術(shù)語“突變酶”(葡聚糖內(nèi)切-1，3-α-葡糖苷酶；EC3.2.1.59)是指水解裂解1，3-α-D-糖苷鍵(主要存在于變聚糖中的鍵)的酶。突變酶可得自多種細(xì)菌和真菌源。突變酶的非限制性列表以氨基酸序列4、6、9和11提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有突變酶活性的多肽包含與SEQIDNO：4、6、9或11具有至少90％的同一性，優(yōu)選地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。如本文所用，術(shù)語“交替糖酶”(EC3.2.1.-)是指內(nèi)切水解裂解交替糖的酶(授予Cote等人的U.S.5,786,196)。如本文所用，術(shù)語“野生型酶”將是指包含氨基酸序列的酶(其全長(zhǎng)和活性截短形式)，如在獲得和/或注釋的生物體中存在的。所述酶(其全長(zhǎng)或催化活性截短形式)可在微生物宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生。所述酶通常在用作制備本發(fā)明可溶性α-葡聚糖纖維組合物中的加工助劑之前純化。在一個(gè)方面，使用同時(shí)存在于反應(yīng)體系中的至少兩種野生型酶的組合以便獲得本發(fā)明的可溶性葡聚糖纖維組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，同時(shí)存在的至少兩種酶的組合包含至少一種具有葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，所述多肽包含與SEQIDNO：1或3具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，以及至少一種具有突變酶活性的多肽，所述多肽包含與SEQIDNO：4、6、9或11具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，同時(shí)存在的至少兩種酶的組合包含至少一種具有葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，所述多肽包含與SEQIDNO：1或3具有至少90％，優(yōu)選地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，以及至少一種具有突變酶活性的多肽，所述多肽包含與SEQIDNO：4或6具有至少90％，優(yōu)選地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。如本文所用，術(shù)語“底物”或“合適的底物”將是指包含蔗糖的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，底物組合物還包含一個(gè)或多個(gè)合適的受體，諸如麥芽糖、異麥芽糖、異麥芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠形成葡萄糖低聚物的至少一種葡糖基轉(zhuǎn)移酶的組合與至少一種α-葡聚糖水解酶組合用于相同反應(yīng)混合物中(即，它們同時(shí)存在并且在反應(yīng)混合物中是活性的)。因此，α-葡聚糖水解酶(當(dāng)存在時(shí))的“底物”是由蔗糖通過葡糖基轉(zhuǎn)移酶在反應(yīng)混合物中同時(shí)合成的葡萄糖低聚物。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中酶不在反應(yīng)混合物中同時(shí)使用的雙酶法(即，至少一種葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)和至少一種α-葡聚糖水解酶)通過前提條件從本文所公開的方法中排除。如本文所用，術(shù)語“合適的酶促反應(yīng)混合物”、“合適的反應(yīng)組分”、“合適的含水反應(yīng)混合物”和“反應(yīng)混合物”是指反應(yīng)物與一種或多種酶在其中發(fā)生接觸的材料(一種或多種合適的物質(zhì))和水。合適的反應(yīng)組分可由多種酶構(gòu)成。在一個(gè)方面，合適的反應(yīng)組分包含至少一種葡聚糖蔗糖酶。在另一個(gè)方面，合適的反應(yīng)組分包含至少一種葡聚糖蔗糖酶和至少一種α-葡聚糖水解酶；優(yōu)選地至少一種具有突變酶活性的多肽。如本文所用，“一個(gè)單位的葡聚糖蔗糖酶活性”或“一個(gè)單位的葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性”定義為當(dāng)在pH5.5和37℃下與200g/L蔗糖溫育時(shí)，轉(zhuǎn)換1μmol蔗糖/分鐘所需的酶量。蔗糖濃度使用HPLC測(cè)定。如本文所用，“一個(gè)單位的右旋糖酐酶活性”定義為當(dāng)在pH5.5和37℃下與0.5mg/mL右旋糖酐底物溫育時(shí)，形成1μmol還原糖/分鐘的酶量。所述還原糖使用PAHBAH測(cè)定法測(cè)定(LeverM.，(1972)，ANewReactionforColorimetricDeterminationofCarbohydrates，Anal.Biochem.47，273-279)。如本文所用，“一個(gè)單位的突變酶糖酶活性”定義為當(dāng)在pH5.5和37℃下與0.5mg/mL變聚糖底物溫育時(shí)，形成1μmol還原糖/分鐘的酶量。所述還原糖使用PAHBAH測(cè)定法測(cè)定(LeverM.，同上)。如本文所用，術(shù)語“酶催化劑”是指包含酶或酶的組合的催化劑，其具有獲得期望的可溶性葡聚糖纖維組合物的必要活性。在某些實(shí)施方案中，可需要酶催化劑的組合以獲得期望的可溶性葡聚糖纖維組合物。一種或多種酶催化劑可以呈完整的微生物細(xì)胞、透化的微生物細(xì)胞、微生物細(xì)胞提取物的一種或多種細(xì)胞組分、部分純化的酶、或純化的酶的形式。在某些實(shí)施方案中，一種或多種酶催化劑還可以是化學(xué)改性的(諸如通過聚乙二醇化或通過與交聯(lián)劑反應(yīng))。還可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將一種或多種酶催化劑固定到可溶性或不溶性支撐體上；參見例如，ImmobilizationofEnzymesandCells；GordonF.Bickerstaff，編輯；Humana出版社，Totowa，NJ，USA；1997。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”是指所考慮的化合物或組合物適用于與人和其它動(dòng)物的組織接觸，但不具有不適當(dāng)?shù)亩拘?、不相容性、不穩(wěn)定性、刺激性、過敏反應(yīng)等，與合理的有益效果/風(fēng)險(xiǎn)比相稱。如本文所用，術(shù)語“低聚糖”是指包含介于3和約30個(gè)由α-糖苷鍵連接的單糖單元的均聚物。如本文所用，術(shù)語“多糖”是指包含大于30個(gè)由α-糖苷鍵連接的單糖單元的均聚物。如本文所用，術(shù)語“食品”廣義地用于本文以包括多種物質(zhì)，所述物質(zhì)可被人類消化，其包括但不限于，飲料、乳制品、烘焙食品、能量棒、果凍、果醬、谷物、膳食補(bǔ)充劑和藥周膠囊或片劑。如本文所用，術(shù)語“寵物食品”或“動(dòng)物飼料”廣義地用于本文以包括多種物質(zhì)，其可被非人類動(dòng)物消化，并且可包括例如狗糧、貓糧和牲畜飼料?！笆茉囌摺币话闶侵溉祟悾m然如將由本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，受試者可以為非人類動(dòng)物。因此，其它受試者可包括哺乳動(dòng)物，諸如嚙齒動(dòng)物(包括小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠)、貓、狗、兔、牛、馬、山羊、綿羊、豬和靈長(zhǎng)類動(dòng)物(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)。如本文所用，術(shù)語“膽固醇相關(guān)疾病”包括但不限于涉及膽固醇，具體地講血漿中的非高密度脂質(zhì)(非HDL)膽固醇的含量升高的病癥，例如LDL膽固醇的含量升高和HDL/LDL比率升高，高膽固醇血癥和高甘油三酯血癥等。在具有高膽固醇血癥的患者中，降低LDL膽固醇是治療的主要目標(biāo)之一。在具有高甘油三酯血癥的患者中，降低高血清甘油三酯濃度是治療的主要目標(biāo)之一。具體地，如本文所定義的治療膽固醇相關(guān)的疾病包括通過施用本發(fā)明的葡聚糖纖維或包含本發(fā)明葡聚糖纖維的組合物來控制血液膽固醇水平、血液甘油三酯水平、血液脂蛋白水平、血糖和胰島素敏感性。如本文所用，“個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品”是指用于美容護(hù)理毛發(fā)、皮膚、頭皮和牙齒的產(chǎn)品，其包括但不限于洗發(fā)劑、爽身水、沐浴凝膠、局部保濕劑、牙膏、牙膠、漱口劑、漱口水、抗牙斑漱口液和/或其它局部治療物。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些產(chǎn)品用于人體，而在其它實(shí)施方案中，這些產(chǎn)品用于由非人類動(dòng)物美容使用(例如在某些獸醫(yī)應(yīng)用中)。如本文所用，術(shù)語“分離的核酸分子”、“分離的多核苷酸”和“分離的核酸片段”將可以互換使用，并指單鏈或雙鏈RNA或DNA的聚合物，任選地包含合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離的核酸分子可由cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段構(gòu)成。術(shù)語“氨基酸”是指蛋白質(zhì)或多肽的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)單元。在本文中使用下列縮寫來表示具體氨基酸：本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以進(jìn)行本文公開的氨基酸序列的改性，同時(shí)保留與所公開的氨基酸序列相關(guān)聯(lián)的功能。例如，在本領(lǐng)域中熟知的是，導(dǎo)致在給定位點(diǎn)產(chǎn)生化學(xué)等價(jià)的氨基酸但可不影響編碼蛋白的功能性質(zhì)的基因改變。例如，本文所公開的氨基酸序列中的任何特定氨基酸可以置換另一功能等同的氨基酸。為了本發(fā)明目的，將置換定義為在以下五組中的一組內(nèi)的互換：1.小的脂族、非極性或弱極性的殘基：Ala、Ser、Thr(Pro，Gly)；2.極性的、帶負(fù)電荷的殘基和它們的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；3.極性的、帶正電荷的殘基：His、Arg、Lys；4.大的脂族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；以及5.大的芳族殘基：Phe、Tyr和Trp。因此，氨基酸中丙氨酸(疏水性氨基酸)的密碼子可以被編碼另一個(gè)疏水性較弱的殘基(諸如甘氨酸)或疏水性較強(qiáng)的殘基(諸如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子置換。類似地，導(dǎo)致一個(gè)帶負(fù)電荷的殘基置換為另一個(gè)帶負(fù)電荷的殘基(諸如，天冬氨酸置換谷氨酸)或一個(gè)帶正電荷的殘基置換為另一個(gè)帶正電荷的殘基(諸如，賴氨酸置換精氨酸)的改變也可以預(yù)期產(chǎn)生功能上等價(jià)的產(chǎn)物。在許多情況下，導(dǎo)致蛋白分子的N-端和C-端部分改變的核苷酸變化也預(yù)計(jì)不會(huì)改變蛋白的活性。所提出的修飾中的每一者均完全在本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)內(nèi)，由所編碼的產(chǎn)物的生物活性的保留決定。如本文所用，術(shù)語“密碼子優(yōu)化的”在其涉及用于轉(zhuǎn)化不同宿主的核酸分子的基因或編碼區(qū)時(shí)是指在不改變由DNA編碼的多肽的情況下，改變核酸分子的基因或編碼區(qū)中的密碼子以反映宿主生物典型的密碼子使用情況。如本文所用，“合成的基因”可由使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法化學(xué)合成的寡核苷酸基本單位組裝而成。將這些基本單位進(jìn)行連接并退火以形成基因區(qū)段，該基因區(qū)段隨后在酶促作用下組裝而構(gòu)建成完整的基因。當(dāng)涉及DNA序列時(shí)，“化學(xué)合成的”是指體外組裝組分核苷酸?？梢圆捎猛晟平⒌姆椒▉硗瓿蒁NA的人工化學(xué)合成，或者可使用許多可商購獲得的機(jī)器中的一種來完成自動(dòng)化學(xué)合成。因此，基于優(yōu)化核苷酸序列以反映宿主細(xì)胞的密碼子偏倚性，可以定制基因用以優(yōu)化基因表達(dá)。如果密碼子使用偏向于宿主偏好的那些密碼子，則技術(shù)人員能預(yù)期成功的基因表達(dá)的可能。優(yōu)選密碼子的確定可基于對(duì)來源于宿主細(xì)胞的基因(其中可獲得序列信息)的檢測(cè)。如本文所用，“基因”是指能夠表達(dá)特定蛋白質(zhì)的核酸分子，其包括編碼序列前的調(diào)控序列(5′非編碼序列)和編碼序列后的調(diào)控序列(3′非編碼序列)?！疤烊换颉笔侵概c其自身調(diào)控序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含不同時(shí)天然可見的調(diào)控序列和編碼序列。因此，嵌合基因可包括源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或包括源于同一來源但以不同于天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列?！皟?nèi)源性基因”是指在生物體基因組中處于其天然位置的天然基因?！巴鈦砘颉敝刚Ｇ闆r下不存在于宿主生物中的基因，但是它通過基因轉(zhuǎn)移引入到宿主生物中。外來基因可包含插入到非天然生物體內(nèi)的天然基因，或嵌合基因?！稗D(zhuǎn)基因”是已通過轉(zhuǎn)化方法引入基因組的基因。如本文所用，“編碼序列”是指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。“合適的調(diào)控序列”是指位于編碼序列的上游(5′非編碼序列)、中間或下游(3′非編碼序列)的核苷酸序列，其影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯。調(diào)控序列可包括啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、RNA加工位點(diǎn)、效應(yīng)子結(jié)合位點(diǎn)和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。如本文所用，術(shù)語“可操作地連接”是指單個(gè)核酸分子上核酸序列的締合，使得其中一個(gè)核酸序列的功能受到另一個(gè)核酸序列的影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響編碼序列的表達(dá)時(shí)，即，該編碼序列處于該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下時(shí)，該啟動(dòng)子與該編碼序列可操作地連接。編碼序列可以按有義或反義的取向可操作地連接到調(diào)控序列。如本文所用的，術(shù)語“表達(dá)”指源于本發(fā)明的核酸分子的有義RNA(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積聚。表達(dá)也可指將mRNA翻譯成多肽。如本文所用，“轉(zhuǎn)化”指將核酸分子轉(zhuǎn)移至宿主生物的基因組內(nèi)，導(dǎo)致在基因上穩(wěn)定遺傳。在本發(fā)明中，宿主細(xì)胞的基因組包括染色體和染色體外(例如質(zhì)粒)基因。含有轉(zhuǎn)化的核酸分子的宿主生物被稱為“轉(zhuǎn)基因”、“重組”或“轉(zhuǎn)化”生物體。如本文所用，術(shù)語“序列分析軟件”是指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何計(jì)算機(jī)算法或軟件程序。“序列分析軟件”可商購獲得或獨(dú)立開發(fā)。典型的序列分析軟件將包括但不限于：GCG程序包(WisconsinPackageVersion9.0，AccelrysSoftwareCorp.，SanDiego，CA)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol215：403-410(1990))和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228S.ParkSt.Madison，WI53715USA)、CLUSTALW(例如，1.83版；Thompson等人，NucleicAcidsResearch，22(22)：4673-4680(1994))以及并入了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.MethodsGenomeRes.，[Proc.Int.Symp.](1994)，開會(huì)日期1992，111-20。編輯：Suhai、Sandor.出版社：Plenum，NewYork，NY)、VectorNTI(Informax，Bethesda，MD)和Sequencherv.4.05。在本申請(qǐng)的上下文中，應(yīng)理解，在使用序列分析軟件進(jìn)行分析的情況中，除非另有指明，否則分析的結(jié)果將基于所提到的程序的“默認(rèn)值”。如本文所用，“默認(rèn)值”將指在首次初始化時(shí)由軟件制造商為軟件最初加載的任何值或參數(shù)集。本文所公開的可溶性α-葡聚糖纖維組合物的結(jié)構(gòu)和功能特性人胃腸酶容易識(shí)別和消化具有大量α-(1，4)糖苷鍵的直鏈α-葡聚糖低聚物。用交替的鍵諸如α-(1，2)、α-(1，3)和α-(1，6)替代這些鍵通常減小α-葡聚糖低聚物的可消化性。增加支化度(使用交替鍵)也可降低相對(duì)的可消化性水平。本發(fā)明可溶性α-葡聚糖纖維組合物使用一種或多種酶促加工助劑由甘蔗糖(蔗糖)制備，所述酶促加工助劑具有來自微生物的基本上與存在于自然界中的氨基酸序列相同的氨基酸序列(或其催化活性截短形式)，所述微生物具有長(zhǎng)期暴露于人類的歷史(天然存在于口腔中或存在于食品諸如啤酒、發(fā)酵的大豆等中的微生物等)和/或酶公認(rèn)為是安全的(GRAS)。可溶性纖維具有低可消化性至沒有可消化性，表現(xiàn)出高耐受性(即，如由可接受的氣體形成量所測(cè)量的)、低粘度(能夠在寬范圍食品應(yīng)用中使用)、和至少部分地可被腸道菌群發(fā)酵，提供可能的益生元效應(yīng)(例如，增加據(jù)報(bào)道與提供潛在的益生元效應(yīng)相關(guān)的雙歧桿菌和乳酸菌的數(shù)量和/或活性)。本文所公開的可溶性α-葡聚糖纖維組合物的特征在于以下參數(shù)的組合：a.10％至30％的α-(1，3)糖苷鍵；b.65％至87％的α-((1，6)糖苷鍵；c.少于5％的α-(1，3，6)糖苷鍵；d.小于5000道爾頓的重均分子量(Mw)；e.在20℃下，在水中12重量％下，小于0.25帕斯卡秒(Pa·s)的粘度；f.在4至40、優(yōu)選地10至40范圍內(nèi)的右旋糖當(dāng)量(DE)；以及g.小于12％的可消化性，如分析化學(xué)師協(xié)會(huì)(AssociationofAnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所測(cè)量；h.在25℃下，在pH7水中至少20％(重量/重量)的溶解度；以及i.小于5的多分散指數(shù)(PDI)。本文所公開的可溶性α-葡聚糖纖維組合物包含10％至30％，優(yōu)選地10％至25％的α-(1，3)糖苷鍵。在某些實(shí)施方案中，除了上述α-(1，3)糖苷鍵實(shí)施方案之外，本發(fā)明可溶性α-葡聚糖纖維組合物還包含65％至87％，優(yōu)選地70％至85％，更優(yōu)選地75％至82％的α-(1，6)糖苷鍵。在某些實(shí)施方案中，除了上述α-(1，3)和α-(1，6)糖苷鍵含量之外，可溶性α-葡聚糖纖維組合物還包含小于5％，優(yōu)選地小于4％、3％、2％或1％的α-(1，3，6)糖苷鍵。在某些實(shí)施方案中，除了以上提及的糖苷鍵含量之外，可溶性α-葡聚糖纖維組合物還包含小于5％，優(yōu)選地小于1％，并且最優(yōu)選地小于0.5％的α-(1，4)糖苷鍵。在另一個(gè)實(shí)施方案中，除了以上提及的糖苷鍵含量之外，α-葡聚糖纖維組合物包括小于5000道爾頓、優(yōu)選地小于2500道爾頓、更優(yōu)選地介于500道爾頓和2500道爾頓之間，并且最優(yōu)選地約500道爾頓至約2000道爾頓的重均分子量(Mw)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，除了以上特征的任意組合之外，在20℃下和水中12重量％下，α-葡聚糖纖維組合物還包括小于250厘泊(cP)(0.25帕斯卡秒(Pa·s))、優(yōu)選地小于10厘泊(cP)(0.01帕斯卡秒(Pa·s))、優(yōu)選地小于7cP(0.007Pa·s)、更優(yōu)選地小于5cP(0.005Pa·s)、更優(yōu)選地小于4cP(0.004Pa·s)、并且最優(yōu)選地小于3cP(0.003Pa·s)的粘度。如分析化學(xué)師協(xié)會(huì)(AssociationofAnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所測(cè)量，可溶性α-葡聚糖組合物具有小于10％的可消化性，優(yōu)選地小于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的可消化性。在另一方面，可消化性的相對(duì)水平可另選地使用AOAC2011.25(綜合總膳食纖維測(cè)定，IntegratedTotalDietaryFiberAssay)(McCleary等人，2012，J.AOACInt.，95(3)，824-844)測(cè)定。除了上述實(shí)施方案中任一個(gè)之外，在某些實(shí)施方案中，可溶性α-葡聚糖纖維組合物在25℃下在pH7水中具有至少20％(重量/重量)，優(yōu)選地至少30％、40％、50％、60％或70％的溶解度。在某些實(shí)施方案中，可溶性α-葡聚糖纖維組合物包含的還原糖的含量小于10重量％、優(yōu)選地小于5重量％、并且最優(yōu)選地1重量％或更少。在某些實(shí)施方案中，可溶性α-葡聚糖纖維組合物包含介于400g/摩爾和2000g/摩爾之間，優(yōu)選地500g/摩爾至1500g/摩爾的數(shù)均分子量(Mn)。在某些實(shí)施方案中，可溶性α-葡聚糖纖維組合物包含少于4kcal/g，優(yōu)選地少于3kcal/g，更優(yōu)選地少于2.5kcal/g，并且最優(yōu)選地約2kcal/g或更少的含熱量。包含葡聚糖纖維的組合物取決于期望的應(yīng)用，可溶性α-葡聚糖纖維/纖維組合物可與適用于食品、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品和/或藥物的一種或多種其它材料一起配制(例如，共混、混合、摻入等)。因此，本公開包括含有可溶性α-葡聚糖纖維組合物的組合物。在該上下文中，術(shù)語“包含可溶性α-葡聚糖纖維組合物的組合物”可包括例如，營(yíng)養(yǎng)或食品組合物，諸如食物產(chǎn)品、食品補(bǔ)充劑、膳食補(bǔ)充劑(例如，呈粉末、液體、凝膠、膠囊、香囊或片劑的形式)或功能性食品。在某些實(shí)施方案中，“包含可溶性α-葡聚糖纖維組合物的組合物”包括個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、化妝品和藥物?？芍苯影扇苄驭?葡聚糖纖維/纖維組合物作為期望的產(chǎn)品(例如食品、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品等)中的成分，或可以與一種或多種附加的食品級(jí)材料共混以形成用于期望的產(chǎn)品(例如食品、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品等)中的碳水化合物組合物。摻入碳水化合物組合物中的可溶性α-葡聚糖纖維組合物的量可根據(jù)應(yīng)用改變。因此，本發(fā)明包括含有可溶性α-葡聚糖纖維組合物的碳水化合物組合物。在某些實(shí)施方案中，碳水化合物組合物包含0.01重量％至99重量％(基于干固體)，優(yōu)選地0.1重量％至90重量％，更優(yōu)選地1重量％至90重量％，并且最優(yōu)選地5重量％至80重量％的上述可溶性α-葡聚糖纖維組合物。如本文所用，術(shù)語“食品”旨在涵蓋人類食用以及動(dòng)物食用的食品。所謂“功能性食品”，是指聲稱具有除供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)功能之外的健康促進(jìn)和/或疾病預(yù)防和/或疾病(風(fēng)險(xiǎn))降低特性的任何新鮮的或經(jīng)加工的食品。功能性食品可包括例如，經(jīng)加工的食品或利用健康促進(jìn)添加劑強(qiáng)化的食品。功能性食品的示例為利用維生素強(qiáng)化的食品，或具有活的培養(yǎng)物的發(fā)酵食品。包含可溶性α-葡聚糖纖維組合物的碳水化合物組合物可包含本領(lǐng)域已知的包括在營(yíng)養(yǎng)組合物中的某些其它材料，諸如水或其它含水溶液、脂肪、糖、淀粉、粘結(jié)劑、增稠劑、著色劑、風(fēng)味劑、增味劑、酸化劑(諸如乳酸或蘋果酸等)、穩(wěn)定劑、或高強(qiáng)度甜味劑或礦物質(zhì)等。適宜的食物產(chǎn)品的示例包括面包、早餐谷類食物、餅干、蛋糕、曲奇、梳打餅、酸乳、開菲爾、味噌、納豆、豆豉、泡菜、酸菜、水、牛奶、果汁、蔬菜汁、碳酸軟飲料、非碳酸軟飲料、咖啡、茶、啤酒、葡萄酒、烈酒、酒精飲料、小吃、湯、冷凍甜點(diǎn)、油炸食品、比薩、意面制品、土豆制品、大米制品、玉米制品、小麥制品、乳制品、硬糖、營(yíng)養(yǎng)棒、谷物、生面團(tuán)、加工肉類和奶酪、酸奶、冰淇淋甜點(diǎn)、基于牛奶的飲料、沙拉醬、醬汁、澆頭、甜點(diǎn)、糖果產(chǎn)品、基于谷物的干棒小吃、制備的菜肴等。包含本發(fā)明α-葡聚糖纖維的碳水化合物組合物可以呈液體、粉末、片劑、立方體、顆粒、凝膠或糖漿的形式。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的碳水化合物組合物包含至少兩種纖維源(即，可溶性α-葡聚糖纖維組合物之外的至少一種附加的纖維源)。在某些實(shí)施方案中，一種纖維源為可溶性α-葡聚糖纖維并且第二纖維源為低聚糖或多糖，其選自抗性/支鏈麥芽糖糊精/纖維糊精(諸如得自RoquetteFreres(Lestrem，F(xiàn)rance)的得自ADM-MatsutaniLLC(Decatur，Illinois)的)，聚右旋糖(得自Danisco-DuPontNutrition&Health(Wilmington，DE)的)，可溶性玉米纖維(例如，得自Tate&Lyle(London，UK)的)，異麥芽低聚糖(IMO)、交替糖和/或麥芽交替低聚糖(MAO)(例如，得自AevotisGmbH(Potsdam，Germany)的FIBERMALTTM；SUCROMALTTM(得自CargillInc.(Minneapolis，MN)、普魯蘭多糖、抗性淀粉、菊粉、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、低聚龍膽糖、半纖維素和果糖低聚物糖漿?？扇苄驭?葡聚糖纖維可作為常規(guī)碳水化合物的替代品或補(bǔ)充劑加入食品中。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明是包含可溶性α-葡聚糖纖維的食物產(chǎn)品。在某些實(shí)施方案中，食物產(chǎn)品中的可溶性α-葡聚糖纖維組合物由本文所公開的方法來制備?？扇苄驭?葡聚糖纖維組合物可用于碳水化合物組合物和/或食物產(chǎn)品中，所述組合物和/或食物產(chǎn)品包含一種或多種高強(qiáng)度人造甜味劑，包括但不限于甜菊糖、阿斯巴甜、三氯蔗糖、紐甜、乙?；前匪徕?、糖精、以及它們的組合?？扇苄驭?葡聚糖纖維可與糖替代物共混，所述糖替代物諸如甜味蛋白、仙茅甜蛋白、赤蘚醇、甘油、甘草甜素、氫化淀粉水解物、菊粉、異麥芽、乳糖醇、馬檳榔甜蛋白、麥芽糖醇、麥芽低聚糖、麥芽交替低聚糖(諸如，SUCROMALTTM，購自CargillInc.(Minneapolis，MN)、甘露醇、神奇蛋白、羅漢果苷混合物、莫納甜、莫內(nèi)林、osladin、五聚糖、山梨醇、甜菊糖、塔格糖、奇異果甜蛋白、木糖醇以及它們的任意組合。在某些實(shí)施方案中，包含可溶性α-葡聚糖纖維組合物的食物產(chǎn)品將具有比其中使用常規(guī)碳水化合物的類似食物產(chǎn)品更低的血糖應(yīng)答、更低的血糖指數(shù)、和更低的血糖負(fù)載。另外，因?yàn)榭扇苄驭?葡聚糖纖維的特征在于在人類胃或小腸中的非常低的可消化性至沒有可消化性，所以在某些實(shí)施方案中，降低了食物產(chǎn)品的含熱量。本發(fā)明的可溶性α-葡聚糖纖維可以粉末的形式使用，共混入具有其它合適的食品成分的干粉末中，或可以包含本發(fā)明膳食纖維的液體糖漿(本文中也被稱為“可溶性纖維糖漿”、“纖維糖漿”或簡(jiǎn)稱“糖漿”)的形式共混或使用?！疤菨{”可作為可溶性纖維源添加到食物產(chǎn)品中。其可增加食物產(chǎn)品的纖維含量，但對(duì)風(fēng)味、口感或質(zhì)感不具有負(fù)面影響。纖維糖漿可單獨(dú)地或與增量劑諸如糖醇或麥芽糖糊精組合地用于食物產(chǎn)品中，以減少含熱量和/或增強(qiáng)產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)特征。纖維糖漿還可用作食物產(chǎn)品中脂肪的部分替代品。纖維糖漿可作為嫩化劑或調(diào)質(zhì)劑用于食物產(chǎn)品中，以增加脆性或折斷性、改善視覺吸引力、和/或改善生面團(tuán)、奶蛋糊或其它食品組合物的流變性。纖維糖漿還可作為濕潤(rùn)劑用于食物產(chǎn)品中，以增加產(chǎn)品的架藏壽命和/或產(chǎn)生更柔軟、更濕潤(rùn)的質(zhì)地。其還可用于食物產(chǎn)品中以降低水活度或固定和管理水。纖維糖漿的附加用途可包括：替代涂蛋液和或增強(qiáng)食物產(chǎn)品的表面光澤、改變面粉淀粉糊化溫度、改性產(chǎn)品的質(zhì)地以及增強(qiáng)產(chǎn)品的褐變。纖維糖漿可用于各種類型的食物產(chǎn)品中。其中本發(fā)明糖漿可非常有用的一種食物產(chǎn)品類型是烘焙產(chǎn)品(即烘焙食品)，諸如蛋糕、布朗尼、曲奇、曲奇松脆片、松餅、面包和甜面團(tuán)。常規(guī)的烘焙產(chǎn)品可具有相對(duì)高的糖和高的總碳水化合物。本發(fā)明糖漿用作烘焙產(chǎn)品中的成分可有助于降低糖和碳水化合物含量，以及降低總卡路里，同時(shí)增加烘焙產(chǎn)品的纖維含量。存在烘焙產(chǎn)品的兩種主要類型：酵母發(fā)酵和化學(xué)發(fā)酵。在酵母發(fā)酵的產(chǎn)品，如甜甜圈、甜面團(tuán)和面包中，本發(fā)明的包含纖維的糖漿可用于替代糖，但少量糖仍然可能是期望的，這是由于酵母或外殼褐變需要發(fā)酵底物。纖維糖漿可作為包含非纖維的糖漿或液體甜味劑的直接替代品與其它液體一起添加。然后，生面團(tuán)可在烘焙行業(yè)中常用的條件下加工，包括混合、發(fā)酵、分開、成形或擠出為長(zhǎng)面包或擠出成型、發(fā)面、和烘焙或油炸?？墒褂妙愃朴趥鹘y(tǒng)產(chǎn)品的條件，將產(chǎn)品烘焙或油炸。面包可通常在420°F至520°F(216-271℃)范圍內(nèi)的溫度下烘焙20分鐘至23分鐘，并且甜甜圈可在400-415°F(204-213℃)范圍內(nèi)的溫度下油炸，但還可使用其它溫度和時(shí)間?；瘜W(xué)發(fā)酵的產(chǎn)品通常具有更多的糖，并且可包含更高含量的包含本發(fā)明可溶性α-葡聚糖纖維的碳水化合物組合物和/或可食用糖漿。成品曲奇可包含30％糖，其可完全地或部分地用包含本發(fā)明葡聚糖纖維組合物的碳水化合物組合物和/或糖漿替代。這些產(chǎn)品可具有例如4-9.5的pH。水分含量可例如介于2％-40％之間。在膏化步驟期間在開始混合時(shí)，或在類似于糖漿或干甜味劑正在被用于替代的任何方法中，本發(fā)明碳水化合物組合物和/或包含纖維的糖漿可容易地?fù)饺氩⒖商砑拥街局??？蓪a(chǎn)品混合并且然后例如通過成片、旋轉(zhuǎn)切割、線切割或通過另一成形工藝成形。然后可在典型的烘焙條件下，例如在200-450°F(93-232℃)下，烘焙產(chǎn)品。其中可使用碳水化合物組合物和/或包含纖維的糖漿的另一食物產(chǎn)品類型是早餐谷類食物。例如，包含纖維的糖漿可用于替代在擠出的谷物片中和/或那些片的外部涂層中的全部或部分的糖。所述涂層通常為成品谷物片的總重量的30％-60％。糖漿可以例如噴霧或?yàn)⒙湫问绞┯?。其中可使?任選地以碳水化合物組合物和/或包含纖維的糖漿的形式)本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物的另一食物產(chǎn)品類型是乳制品。其中其可使用的乳制品的示例包括酸乳、酸乳飲料、乳飲料、調(diào)味乳、冰沙、冰淇淋、奶昔、脫脂乳酸干酪、脫脂乳酸干酪調(diào)味品、和乳制品甜點(diǎn)，諸如脫脂凝乳和打發(fā)的慕斯型產(chǎn)品。這可包括旨在直接食用的乳制品(諸如包裝好的冰沙)以及旨在與其它成分共混的那些(諸如共混的冰沙)。其可用于巴氏滅菌乳制品，諸如在160°F至285°F(71℃-141℃)的溫度下巴氏滅菌的乳制品。其中可使用包含α-葡聚糖纖維組合物的組合物的另一食物產(chǎn)品類型是糖果。其中其可使用的糖果的示例包括硬糖、方旦糖、牛軋?zhí)呛兔藁ㄌ?、明膠果凍糖或膠糖、果凍、巧克力、甘草、口香糖、焦糖和太妃糖、求斯糖、薄荷糖、片狀糖果和水果小吃。在水果小吃中，包含本發(fā)明α-葡聚糖纖維的組合物可與果汁組合使用。所述果汁可提供大部分甜味，并且包含葡聚糖纖維的組合物可減少總糖含量并增加纖維?？蓪暇厶抢w維的本發(fā)明組合物添加到最初的糖果漿液中并且加熱至最終固含量。所述漿液可從200°F至305°F(93℃-152℃)加熱以實(shí)現(xiàn)最終固含量?？稍诩訜嶂盎蛑筇砑铀嵋援a(chǎn)生2-7的最終pH?？蓪暇厶抢w維的組合物用作存在的0％-100％的糖和1％-100％的玉米糖漿或其它甜味劑的替代品。其中可使用包含α-葡聚糖纖維組合物的組合物的另一食物產(chǎn)品類型是果醬和果凍。果醬和果凍由水果制成。果醬包含水果片，然而果凍由果汁制成。包含本發(fā)明纖維的組合物可如下代替糖或其它甜味劑使用：將水果和果汁稱入罐中；將糖、含纖維組合物和果膠預(yù)混；將干組合物添加到液體中并煮至214°F至220°F(101℃-104℃)的溫度；熱填充到廣口瓶中并干餾5-30分鐘。其中可使用包含本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物的組合物(諸如包含纖維的糖漿)的另一食物產(chǎn)品類型是飲料。其中其可使用的飲料的示例包括碳酸飲料、果汁、濃縮果汁混合物(例如瑪格麗特混合物)、清水和飲料干混物。使用本發(fā)明α-葡聚糖纖維可克服當(dāng)將其它類型的纖維添加到飲料中時(shí)產(chǎn)生的透明度問題。糖的完全替代是可能的(其可以例如為高達(dá)總配方的12％或更多)。另一食物產(chǎn)品類型是高固體填充物。高固體填充物的示例包括干棒小吃、烤酥餅、甜甜圈和曲奇中的填充物。高固體填充物可以為例如酸/水果填充物或有香味的填充物。纖維組合物可加入原樣食用的產(chǎn)品中，或加入可通過食品加工機(jī)(附加的烘焙)或通過消費(fèi)者(烘焙穩(wěn)定填充)進(jìn)行進(jìn)一步加工的產(chǎn)品中。在某些實(shí)施方案中，高固體填充物可具有介于67％-90％之間的固體濃度。所述固體可被包含本發(fā)明α-葡聚糖纖維的組合物完全替代，或其可用于存在的其它甜味劑固體的部分替代(例如，替代5％-100％的現(xiàn)有固體)。通常水果填充物可具有2-6的pH，然而有香味的填充物可介于4-8pH之間。填充物可冷卻制備或在高達(dá)250°F(121℃)下加熱以蒸發(fā)至期望的最終固含量。其中可使用α-葡聚糖纖維組合物或(包含α-葡聚糖纖維組合物)的碳水化合物組合物的另一食物產(chǎn)品類型是擠出和成片的小吃。其可使用的擠出和成片小吃的示例包括膨化小吃、梳打餅、未經(jīng)發(fā)酵的玉米片和玉米薄片。在制備擠出片時(shí)，包含本發(fā)明葡聚糖纖維的組合物可與干產(chǎn)品一起直接添加?？稍跀D出機(jī)中添加少量水，并且然后，其可通過在100°F至300°F(38℃-149℃)范圍內(nèi)的各個(gè)區(qū)。所述干產(chǎn)品可以干產(chǎn)品混合物的0％-50％的含量添加。包含本發(fā)明葡聚糖纖維的糖漿還可沿?cái)D出機(jī)在液體端口之一處添加。產(chǎn)品可以低水分含量(5％)制出，并且然后烘焙以去除過量水分，或以略高水分含量(10％)制出，并且然后油炸以去除水分并煮出產(chǎn)品。烘焙可以在高達(dá)500°F(260℃)的溫度下持續(xù)20分鐘。烘焙可更典型地在350°F(177℃)下持續(xù)10分鐘。油炸可通常在350°F(177℃)下持續(xù)2-5分鐘。在片狀小吃中，包含本發(fā)明葡聚糖纖維的組合物可用作其它干燥成分(例如，面粉)的部分替代品。其可以為干重的0％-50％?？蓪a(chǎn)品干混，并且然后加入水以形成粘著面團(tuán)。產(chǎn)物混合物可具有5至8的pH。然后可將生面團(tuán)成片并切割，并且然后烘焙或油炸。烘焙可以在高達(dá)500°F(260℃)的溫度下持續(xù)20分鐘。油炸可通常在350°F(177℃)下持續(xù)2-5分鐘。來自使用包含本發(fā)明葡聚糖纖維的組合物的另一潛在有益效果是當(dāng)其作為內(nèi)部成分添加或作為油炸食品的外部上的涂層添加時(shí)，油炸小吃中的脂肪含量減少多達(dá)15％。其中可使用包含纖維的糖漿的另一食物產(chǎn)品類型是明膠狀點(diǎn)心。明膠狀點(diǎn)心的成分常常作為干混物出售，其中明膠作為膠凝劑。糖固體可利用干混物中包含本發(fā)明葡聚糖纖維的組合物部分或完全地替代。然后可將干混物與水混合并加熱至212°F(100℃)以溶解明膠，并且然后可加入更多水和/或水果以完成明膠狀點(diǎn)心。然后使明膠冷卻并固化。明膠還可以架藏穩(wěn)定的包裝出售。在該情況下，穩(wěn)定劑通常是基于角叉菜膠的。如上所述，包含本發(fā)明葡聚糖纖維的組合物可用于替代高達(dá)100％的其它甜味劑固體?？蓪⒏稍锍煞只烊胍后w中并且然后巴氏滅菌并放入杯中，并使其冷卻和固化。其中可使用包含本發(fā)明葡聚糖纖維的組合物的另一食物產(chǎn)品類型是干棒小吃。其中其可使用的干棒小吃的示例包括早餐替代棒和代餐棒、營(yíng)養(yǎng)棒、granola棒、蛋白質(zhì)棒和谷物棒。其可用于干棒小吃的任一部分中，諸如在高固體填充物、結(jié)合糖漿或顆粒部分中。完全或部分替代結(jié)合糖漿中的糖是可能的。結(jié)合糖漿通常為50％-90％固體，并且以在10％結(jié)合糖漿與90％顆粒，至70％結(jié)合糖漿與30％顆粒范圍內(nèi)的比率施用。結(jié)合糖漿通過將甜味劑、增量劑和其它粘結(jié)劑(如淀粉)的溶液加熱至160°F-230°F(71℃-110℃)來制備(取決于糖漿中所需的最終固體)。然后將糖漿與顆?；旌弦酝扛差w粒，從而提供遍布基質(zhì)的涂層。包含本發(fā)明葡聚糖纖維的組合物還可用于顆粒本身。這可以為直接膨脹或槍式膨化的擠出片。其可以與另一種谷物成分、玉米粗粉、米粉或其它類似成分組合使用。其中可使用包含本發(fā)明葡聚糖纖維糖漿的組合物的另一食物產(chǎn)品類型是奶酪、奶酪醬和其它奶酪產(chǎn)品。其中其可使用的奶酪、奶酪醬和其它奶酪產(chǎn)品的示例包括低乳固體奶酪、低脂奶酪和低卡路里奶酪。在塊狀奶酪中，其可有助于改善熔融特性，或減小通過其它成分諸如淀粉增加的熔融限制效應(yīng)。其還可用于奶酪醬中，例如作為增量劑，來替代脂肪、乳固體或其它典型的增量劑。其中可使用包含本發(fā)明葡聚糖纖維的組合物的另一食物產(chǎn)品類型是可食用和/或水溶性的膜。其中其可使用的膜的示例包括用于包封旨在溶解于水中的各種食品和飲料的干混物的膜，或者用于遞送著色劑或風(fēng)味劑的膜，諸如在烹飪之后但仍然熱時(shí)加入食品中的香料膜。其它膜應(yīng)用包括但不限于，水果和植物鞣皮，以及其它柔性膜。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用的包含本發(fā)明葡聚糖纖維的組合物為湯、糖漿、醬汁、和調(diào)味品。典型的調(diào)味品可以為0％-50％油，其pH范圍為2-7。其可冷加工或熱加工?？蓪⑵浠旌希⑶胰缓罂商砑臃€(wěn)定劑。根據(jù)需要，包含本發(fā)明葡聚糖纖維的組合物可容易地以液體形式或干燥形式與其它成分一起添加。調(diào)味品組合物可需要加熱以活化穩(wěn)定劑。典型的加熱條件可以為170°F-200°F(77℃-93℃)并持續(xù)1-30分鐘。在冷卻之后，添加油以制備預(yù)乳液。然后，使用勻化器、膠體磨或其它高剪切工藝將產(chǎn)品乳化。醬汁可具有0％-10％油和10％-50％總固體，并且可具有2-8的pH。醬汁可冷加工或熱加工。將成分混合并且然后熱加工。根據(jù)需要，包含本發(fā)明葡聚糖纖維的組合物可容易地以液體形式或干燥形式與其它成分一起添加。典型的加熱可以為170°F-200°F(77℃-93℃)并持續(xù)1-30分鐘。湯更典型地為20％-50％固體并且處于更中性的pH范圍(4-8)。它們可以為干混合物，可向其添加包含本發(fā)明葡聚糖纖維的干燥組合物，或者為液體湯，將液體湯罐裝并且然后干餾。在湯中，可使用高達(dá)50％固體的抗性玉米糖漿，但更典型的用途是可以遞送5g纖維/份。其中可使用包含本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物的組合物的另一食物產(chǎn)品類型是咖啡奶精。其中其可使用的咖啡奶精的示例包括液體奶精和干奶精兩者。干共混的咖啡奶精可與以下脂肪類型的商業(yè)奶精粉末共混：大豆油、椰子油、棕櫚油、葵花油或卡諾拉油或乳脂。這些脂肪可以為非氫化的或氫化的。包含本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物的組合物可作為纖維源，任選地與果糖低聚糖、聚右旋糖、菊粉、麥芽糖糊精、抗性淀粉、蔗糖和/或常規(guī)玉米糖漿固體一起添加。所述組合物還可包含高強(qiáng)度甜味劑，諸如三氯蔗糖、乙?；前匪徕?、阿斯巴甜或它們的組合。可將這些成分干共混以制備期望的組合物。噴霧干燥的奶精粉末為脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物、乳化劑、乳化鹽、甜味劑和抗結(jié)塊劑的組合。脂肪源可以為大豆油、椰子油、棕櫚油、葵花油或卡諾拉油或乳脂中的一種或多種。蛋白質(zhì)可以為酪蛋白酸鈉或酪蛋白酸鈣、乳蛋白、乳清蛋白、小麥蛋白或大豆蛋白。碳水化合物可以為單獨(dú)包含本發(fā)明的α-葡聚糖纖維組合物的組合物，或包含本發(fā)明的α-葡聚糖纖維組合物與低聚果糖、聚右旋糖、菊粉、抗性淀粉、麥芽糖糊精、蔗糖、玉米糖漿或它們的任意組合的組合的組合物。乳化劑可以為甘油單酯和甘油二酯、乙?；视蛦熙ズ透视投?、或丙二醇單酯。所述鹽可以為檸檬酸三鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二鈉、磷酸三鈉、焦磷酸四鈉、磷酸二氫鉀、和/或磷酸二鉀。所述組合物還可包含高強(qiáng)度甜味劑，諸如上述那些。適宜的抗結(jié)塊劑包括硅鋁酸鈉或二氧化硅。產(chǎn)品可與漿液合并，任選地均化，并且以顆粒狀或附聚形式噴霧干燥。液體咖啡奶精僅是脂肪(乳脂或氫化植物油)、一些乳固體或酪蛋白酸鹽、玉米糖漿和香草風(fēng)味劑或其它風(fēng)味劑的經(jīng)勻化和巴氏滅菌的乳液，以及穩(wěn)定化共混物。產(chǎn)品通常在185°F(85℃)下經(jīng)由HTST(高溫短時(shí))巴氏滅菌30秒，或在285°F(141℃)下UHT(超高溫)巴氏滅菌4秒，并且在兩塔板均化器中以第一塔板500-3000psi(3.45MPa-20.7MPa)，和第二塔板200psi-1000psi(1.38MPa-6.89MPa)均化。通常將咖啡奶精穩(wěn)定化使得其在加入咖啡中時(shí)不分解。其中可使用包含本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物的組合物(諸如包含纖維的糖漿)的另一食物產(chǎn)品類型是食品涂層諸如糖衣、糖霜、和蛋漿。在糖衣和糖霜中，包含纖維的糖漿可用作甜味劑替代品(完全或部分的)以降低含熱量并增加纖維含量。蛋漿通常為約70％-90％的糖，其中剩余的大部分為水，并且包含纖維的糖漿可用于完全或部分替代糖。糖霜通常包含約2％-40％的液體/固體脂肪組合、約20％-75％甜味劑固體、著色劑、風(fēng)味劑和水。包含纖維的糖漿可用于替代全部或部分的甜味劑固體，或作為低脂肪體系中的增量劑。其中可使用包含纖維的糖漿的另一食物產(chǎn)品類型是寵物食品，諸如干或濕的狗糧。寵物食品以各種方式制備，諸如擠出、成形、和配制成肉汁。包含纖維的糖漿可以0％-50％的含量用于這些類型的每一種中。其中可使用包含本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物的組合物(諸如糖漿)的另一食物產(chǎn)品類型是魚和肉。在一些肉中已經(jīng)使用了常規(guī)的玉米糖漿，所以包含纖維的糖漿可用作部分或完全的替代物。例如，糖漿可在其真空翻滾或注入肉中之前，加入鹽水中。其可與鹽和磷酸鹽，以及任選地與水結(jié)合成分諸如淀粉、角叉菜膠或大豆蛋白一起添加。這可用于增加纖維，典型的含量可以為5g/次，這可滿足對(duì)優(yōu)異纖維源的要求。包含本發(fā)明可溶性纖維的個(gè)人護(hù)理和/或藥物組合物本發(fā)明葡聚糖纖維和/或包含本發(fā)明葡聚糖纖維的組合物可用于個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品中。例如，可能夠使用此類材料作為濕潤(rùn)劑、水性膠體或可能的增稠劑。如果需要，本發(fā)明纖維和/或包含本發(fā)明纖維的組合物可與一種或多種其它類型的增稠劑結(jié)合使用，諸如在美國專利8,541,041中所公開的那些，該專利的公開內(nèi)容以引用方式全文并入本文。本文個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品包括但不限于，護(hù)膚組合物、化妝品組合物、抗真菌組合物、和抗菌組合物。本文的個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品可為例如洗劑、霜膏、糊劑、油膏、膏劑、潤(rùn)發(fā)油、凝膠、液體以及它們的組合等的形式。本文公開的個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品可包含至少一種活性成分?；钚猿煞滞ǔ１灰暈楫a(chǎn)生預(yù)期藥理效應(yīng)或美容效應(yīng)的成分。在某些實(shí)施方案中，可將皮膚護(hù)理產(chǎn)品施用于皮膚，以解決與缺乏水分相關(guān)的皮膚損傷。皮膚護(hù)理產(chǎn)品也可用于改善皮膚的視覺外觀(例如減少片狀、破裂和/或紅皮膚的外觀)和/或皮膚的觸感(例如，降低皮膚的粗糙度和/或干燥度，同時(shí)增加皮膚的柔滑度和細(xì)膩度)。皮膚護(hù)理產(chǎn)品通?？砂辽僖环N活性成分以治療或預(yù)防皮膚疾病，提供美容效應(yīng)，或向皮膚提供保濕有益效果，所述活性成分如氧化鋅、凡士林、白凡士林、礦物油、魚肝油、羊毛脂、聚二甲基硅氧烷、硬脂肪、維生素A、尿囊素、爐甘石、高嶺土、甘油、或膠狀燕麥、以及這些的組合。例如，皮膚護(hù)理產(chǎn)品可包含一種或多種天然保濕因子，諸如神經(jīng)酰胺、透明質(zhì)酸、甘油、角鯊?fù)?、氨基酸、膽固醇、脂肪酸、甘油三酯、磷脂、糖鞘脂、脲、亞油酸、糖胺聚糖、黏多糖、乳酸鈉或吡咯烷酮羧酸鈉?？砂谄つw護(hù)理產(chǎn)品中的其它成分包括但不限于甘油酯、杏仁油、卡諾拉油、角鯊?fù)?、角鯊烯、椰油、玉米油、霍霍巴油、霍霍巴蠟、卵磷脂、橄欖油、紅花油、芝麻油、牛油樹脂、大豆油、甜杏仁油、向日葵油、茶樹油、牛油樹脂、棕櫚油、膽固醇、膽固醇酯、蠟酯、脂肪酸和橙油。如本文所用，個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品還可以是化妝品或其它產(chǎn)品的形式，包括但不限于例如唇膏、睫毛膏、胭脂、粉底、腮紅、眼線膏、唇線筆、唇彩、其它化妝品、防曬霜、防曬劑(sunblock)、指/趾甲油、摩絲、噴發(fā)劑、定型凝膠、指/趾甲調(diào)理劑、洗浴凝膠、淋浴凝膠、身體洗滌劑、洗臉劑、洗發(fā)劑、毛發(fā)調(diào)理劑(免洗型或洗去型)、營(yíng)養(yǎng)發(fā)水、毛發(fā)染料、毛發(fā)著色產(chǎn)品、亮發(fā)產(chǎn)品、護(hù)發(fā)精華素、頭發(fā)防卷曲產(chǎn)品、頭發(fā)分叉端修復(fù)產(chǎn)品、唇香膏、皮膚調(diào)理劑、冷霜、保濕劑、身體噴劑、肥皂、身體擦洗劑、剝脫劑、收斂劑、緊膚洗劑、脫毛劑、燙發(fā)液、去屑制劑、止汗劑組合物、除臭劑、剃刮產(chǎn)品、剃刮前產(chǎn)品、剃刮后產(chǎn)品、清潔劑、皮膚凝膠、漂洗劑、牙膏或漱口劑。如本文所用，藥學(xué)產(chǎn)品可例如呈乳液、液體、酏劑、凝膠、混懸液、溶液、霜膏、膠囊、片劑、香囊或膏劑的形式。此外，本文的藥物產(chǎn)品可以是本文所公開的任意個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品的形式。藥物產(chǎn)品還可包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明纖維和/或包含本發(fā)明纖維的組合物還可用于膠囊、包封材料、片劑包衣中，并作為賦形劑用于藥劑和藥物。可溶性α-葡聚糖纖維組合物的酶促合成提供酶促制備可溶性α-葡聚糖纖維組合物的方法。本文描述了兩種不同的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，“單一酶”方法包括使用至少一種葡糖基轉(zhuǎn)移酶(在不存在α-葡聚糖水解酶的情況下)，其屬于葡糖苷水解酶70型家族(E.C.2.4.1.-)，并且其能夠催化使用蔗糖作為底物的耐消化可溶性α-葡聚糖纖維組合物的合成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，“雙酶”法包括至少一種葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GH70)與至少一種α-葡聚糖水解酶(諸如內(nèi)切突變酶)的組合。葡糖苷水解酶家族70酶是由乳酸菌諸如鏈球菌、明串珠菌、魏斯氏菌或乳桿菌屬產(chǎn)生的轉(zhuǎn)葡糖苷酶(參見CarbohydrateActiveEnzymesdatabase；“CAZy”；Cantarel等人，(2009)NucleicAcidsRes37：D233-238)。重組表達(dá)的葡糖基轉(zhuǎn)移酶優(yōu)選具有與天然存在的氨基酸序列一致的氨基酸序列(即，與存在于源生物體的全長(zhǎng)序列或其催化活性截短形式相同)。GTF酶能夠聚合蔗糖的D-葡糖基單元以形成同寡糖或同多糖。取決于GTF酶的特異性，形成包含各種糖苷鍵諸如α-(1，2)、α-(1，3)、α-(1，4)和α-(1，6)的直鏈和/或支鏈葡聚糖。葡糖基轉(zhuǎn)移酶還可將D-葡糖基單元轉(zhuǎn)移到羥基受體基團(tuán)上。受體的非限制性列表包括碳水化合物、醇、多元醇或類黃酮。所得的葡糖基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)取決于酶特異性。在本發(fā)明中，D-吡喃葡糖基供體是蔗糖。因此，反應(yīng)為：主要形成的糖苷鍵類型用于命名/分類葡糖基轉(zhuǎn)移酶。示例包括右旋糖酐蔗糖酶(α-(1，6)鍵；EC2.4.1.5)、變聚糖蔗糖酶(α-(1，3)鍵；EC2.4.1.-)、交替糖蔗糖酶(交替的α(1，3)-α(1，6)主鏈；EC2.4.1.140)和羅伊糖蔗糖酶(α-(1，4)和α-(1，6)鍵的混合物；EC2.4.1.-)。在一個(gè)方面，葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)能夠形成具有α-(1，3)糖苷鍵的葡聚糖，前提條件是所述葡聚糖產(chǎn)物不是交替糖(即所述酶不是交替糖蔗糖酶)。在一個(gè)方面，葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含與SEQIDNO：1、3、13、16、17、19、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60或62具有至少90％同一性，優(yōu)選地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在優(yōu)選的方面，葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含選自SEQIDNO：1、3、13、16、17、19、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62的氨基酸序列。然而，應(yīng)當(dāng)注意一些野生型序列可以截短形式存在于自然界中。因此，并且在另一個(gè)實(shí)施方案中，適用的葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以為野生型序列的截短形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，截短的葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含衍生自全長(zhǎng)野生型氨基酸序列的序列，所述全長(zhǎng)野生型氨基酸序列選自SEQIDNO：1、13、17、28、30、32、34、36、38、40、42、44和46。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以是截短的并且將具有選自SEQIDNO：3、16、19、48、50、52、54、56、58、60和62的氨基酸序列。含水反應(yīng)制劑中催化劑的濃度取決于催化劑的特定催化活性，對(duì)該濃度進(jìn)行選擇以獲得所需的反應(yīng)速率。每種催化劑反應(yīng)的重量(單一葡糖基轉(zhuǎn)移酶或獨(dú)立地葡糖基轉(zhuǎn)移酶和α-葡聚糖水解酶)通常在0.0001mg至20mg/mL總反應(yīng)體積，優(yōu)選地0.001mmg/ml至10mg/ml范圍內(nèi)。還可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將催化劑固定到可溶性或不溶性支撐體上；參見例如，ImmobilizationofEnzymesandCells；GordonF.Bickerstaff，編輯；Humana出版社，Totowa，NJ，USA；1997。使用固定化催化劑允許在后續(xù)反應(yīng)中進(jìn)行回收和重復(fù)使用催化劑。酶催化劑可為下列形式：全微生物細(xì)胞、透化微生物細(xì)胞、微生物細(xì)胞提取物、部分純化的或純化的酶以及它們的混合物。最終反應(yīng)制劑的pH值為約3至約8，優(yōu)選地約4至約8，更優(yōu)選地約5至約8，甚至更優(yōu)選地約5.5至約7.5，甚至更優(yōu)選地約5.5至約6.5?？扇芜x地通過添加合適的緩沖液，包括但不限于磷酸鹽、焦磷酸鹽、碳酸氫鹽、乙酸鹽、或檸檬酸鹽，來控制反應(yīng)的pH值。使用緩沖劑時(shí)，其濃度通常為0.1mM至1.0M，優(yōu)選地1mM至300mM，最優(yōu)選地10mM至100mM。當(dāng)將反應(yīng)組分合并時(shí)，最初存在的蔗糖濃度為至少50g/L，優(yōu)選地50g/L至600g/L，更優(yōu)選地100g/L至500g/L，更優(yōu)選地150g/L至450g/L，并且最優(yōu)選地250g/L至450g/L。α-葡聚糖水解酶(當(dāng)存在時(shí))的底物將為由葡糖基轉(zhuǎn)移酶形成的葡萄糖低聚物群體的成員。因?yàn)榇嬖谟诜磻?yīng)體系中的葡萄糖低聚物可充當(dāng)受體，所以存在于反應(yīng)體系中的每種物質(zhì)的確切濃度將變化。此外，可將其它受體(即，外部受體)加入初始反應(yīng)混合物中，諸如舉例來說麥芽糖、異麥芽糖、異麥芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖。反應(yīng)的長(zhǎng)度可變化并且可通常通過使用所有可獲得的蔗糖底物所花費(fèi)的時(shí)間量來測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行反應(yīng)直至消耗至少90％，優(yōu)選地至少95％，并且最優(yōu)選地至少99％的最初存在于反應(yīng)混合物中的蔗糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)至168小時(shí)，優(yōu)選地1小時(shí)至72小時(shí)，并且最優(yōu)選地1小時(shí)至24小時(shí)。單一酶方法(葡糖基轉(zhuǎn)移酶)已經(jīng)識(shí)別兩種葡糖基轉(zhuǎn)移酶/葡聚糖蔗糖酶能夠在不存在α-葡聚糖水解酶的情況下產(chǎn)生本發(fā)明的α-葡聚糖纖維組合物。具體地，來自變異鏈球菌(Streptococcusmutans)的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(gi：3130088(或適用于在重組微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)的其催化活性截短形式)；本文也被稱為“0088”葡糖基轉(zhuǎn)移酶或“GTF0088”)可產(chǎn)生本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物。在一個(gè)方面，變異鏈球菌(Streptococcusmutans)GTF0088可作為gi：3130088中報(bào)道的全長(zhǎng)序列的催化活性片段產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用變異鏈球菌(Streptococcusmutans)GTF0088葡糖基轉(zhuǎn)移酶或其催化活性片段來制備本發(fā)明的α-葡聚糖纖維組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供制備α-葡聚糖纖維組合物的方法，所述方法包括：a.提供反應(yīng)組分的系列，其包括：i.蔗糖；ii至少一種多肽，其具有葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性并且包含與選自SEQIDNO：13、16、17、19、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；以及iii.任選地一種或多種受體；b.在適當(dāng)?shù)暮磻?yīng)條件下將所述反應(yīng)組分的系列合并以形成單一反應(yīng)混合物，由此形成包含葡萄糖低聚物的產(chǎn)物混合物；c.任選地將上述可溶性α-葡聚糖纖維組合物與包含葡萄糖低聚物的產(chǎn)物混合物分離；以及d.任選地，將可溶性α-葡聚糖纖維組合物濃縮。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用葡糖基轉(zhuǎn)移酶制備本發(fā)明的α-葡聚糖纖維組合物，所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶包含氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO：13(全長(zhǎng)形式)或SEQIDNO：16、48或56(催化活性截短形式)具有至少90％，優(yōu)選地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，其中應(yīng)當(dāng)理解此類酶將保留相似的活性并產(chǎn)生與本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物一致的產(chǎn)品特征。在另一個(gè)實(shí)施方案中，來自變異鏈球菌(Streptococcusmutans)LJ23gi：387786207的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(或其適用于在重組微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)的催化活性截短形式)；本文中也被稱為“6207”葡糖基轉(zhuǎn)移酶或簡(jiǎn)稱“GTF6207”)已經(jīng)被識(shí)別為能夠在不存在α-葡聚糖水解酶(例如右旋糖酐酶，突變酶等)的情況下，產(chǎn)生本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物。在一個(gè)方面，變異鏈球菌(Streptococcusmutans)GTF6207可作為gi：387786207中報(bào)道的全長(zhǎng)序列的催化活性片段產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用變異鏈球菌(Streptococcusmutans)GTF6207葡糖基轉(zhuǎn)移酶或其催化活性片段來制備本發(fā)明的α-葡聚糖纖維組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用葡糖基轉(zhuǎn)移酶制備本發(fā)明的α-葡聚糖纖維組合物，所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶具有氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO：17(全長(zhǎng)形式)或SEQIDNO：19(催化活性截短形式)具有至少90％，優(yōu)選地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的同一性，其中應(yīng)當(dāng)理解此類酶將保留相似的活性并產(chǎn)生與本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物一致的產(chǎn)品特征。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用葡糖基轉(zhuǎn)移酶制備本發(fā)明的α-葡聚糖纖維組合物，所述酶具有氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO：13的同系物或同系物的截短形式具有至少90％，優(yōu)選地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，其中應(yīng)當(dāng)理解此類酶將保留相似的活性并產(chǎn)生與本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物一致的產(chǎn)品特征。在某些實(shí)施方案中，同系物選自SEQIDNO：28、30、32、34、36、40、42、44和46。在某些實(shí)施方案中，同系物的截短形式選自SEQIDNO：50、52、54、58、60和62?？扇苄云暇厶抢w維合成-包含葡糖基轉(zhuǎn)移酶(Gtf)和α-葡聚糖水解酶的反應(yīng)體系本發(fā)明提供使用至少一種α-葡聚糖水解酶與至少一種上述葡糖基轉(zhuǎn)移酶的組合(同時(shí)在反應(yīng)混合物中)，酶促制備本發(fā)明可溶性葡聚糖纖維的方法。當(dāng)與相同酶的順序施用相比時(shí)(即，首先使用葡糖基轉(zhuǎn)移酶由蔗糖合成葡聚糖聚合物并且隨后利用α-葡聚糖水解酶處理葡聚糖聚合物)，同時(shí)使用兩種酶產(chǎn)生不同產(chǎn)物特征(即，可溶性纖維組合物的特征)。在一個(gè)實(shí)施方案中，特別排除了基于葡糖基轉(zhuǎn)移酶與α-葡聚糖水解酶的順序施用的葡聚糖纖維合成方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供制備可溶性α-葡聚糖纖維組合物的方法，該方法包括：a.提供反應(yīng)組分的系列，其包括：i.蔗糖；ii至少一種具有葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，所述多肽包含與選自SEQIDNO：1和3的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；iii.至少一種具有α-葡聚糖水解酶活性的多肽；以及iv.任選地一種或多種受體；b.在適當(dāng)?shù)暮磻?yīng)條件下將所述反應(yīng)組分的系列合并，由此制備包含可溶性α-葡聚糖纖維組合物的產(chǎn)物；以及c.任選地，將可溶性α-葡聚糖纖維組合物與步驟(b)的產(chǎn)物分離。當(dāng)與具有內(nèi)切水解活性的α-葡聚糖水解酶組合使用時(shí)，來自變異鏈球菌(Streptococcusmutans)NN2025(GI：290580544；本文中也被稱為“0544”葡糖基轉(zhuǎn)移酶或簡(jiǎn)稱為“GTF0544”)的葡糖基轉(zhuǎn)移酶可產(chǎn)生本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物。在一個(gè)方面，變異鏈球菌(Streptococcusmutans)GTF0544可作為gi：290580544中報(bào)道的全長(zhǎng)序列的催化活性片段產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用變異鏈球菌(Streptococcusmutans)GTF0544葡糖基轉(zhuǎn)移酶(或適用于在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)的其催化活性片段)與至少一種具有內(nèi)切水解活性的α-葡聚糖水解酶的組合來制備本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物。類似于葡糖基轉(zhuǎn)移酶，α-葡聚糖水解酶可通過針對(duì)某些α-D-糖苷鍵的內(nèi)切水解活性定義?？捎糜诒疚乃_的方法的α-葡聚糖水解酶可通過其特征結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)來識(shí)別，例如那些識(shí)別為上述突變酶和右旋糖酐酶的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。示例可包括但不限于，右旋糖酐酶(能夠水解α-(1，6)-連接的糖苷鍵；E.C.3.2.1.11)、突變酶(能夠水解α-(1，3)-連接的糖苷鍵；E.C.3.2.1.59)、霉菌右旋糖酐酶(能夠內(nèi)切水解包含(1→3)-和(1→4)-鍵兩者的α-D-葡聚糖的(1→4)-α-D-糖苷鍵；EC3.2.1.61)、葡聚糖1，6-α-葡糖苷酶(EC3.2.1.70)和交替糖酶(能夠內(nèi)切水解裂解交替糖；E.C.3.2.1.-；參見U.S.5,786,196)。各種因素包括但不限于某些α-葡聚糖內(nèi)的支化程度、支化類型和相對(duì)分支長(zhǎng)度，可不利地影響α-葡聚糖水解酶內(nèi)切水解一些糖苷鍵的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，α-葡聚糖水解酶為至少一種突變酶(EC3.1.1.59)?？捎糜诒疚乃_的方法的突變酶可通過其特征性結(jié)構(gòu)來識(shí)別。參見例如，Y.Hakamada等人，(Biochimie，(2008)90：525-533)。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變酶為可得自青霉菌屬(Penicillium)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、肉座菌屬(Hypocrea)、曲霉屬(Aspergillus)和木霉屬(Trichoderma)的突變酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，突變酶來自馬爾尼菲青霉ATCC18224或PaenibacillusHumicus。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變酶包含選自SEQIDNO：4、6、9、11和它們的任意組合的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，上述突變酶可以為催化活性的截短形式，只要保留突變酶活性即可。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在中識(shí)別為gi：257153264的腐殖質(zhì)類芽孢桿菌突變酶(本文中也稱為“3264”突變酶或簡(jiǎn)稱為“MUT3264”)或其催化活性片段可與GTF0544葡糖基轉(zhuǎn)移酶組合使用以產(chǎn)生本發(fā)明的α-葡聚糖纖維組合物。MUT3264突變酶可由其天然信號(hào)序列、替代信號(hào)序列(諸如枯草芽孢桿菌AprE信號(hào)序列，SEQIDNO：7)產(chǎn)生，或可以成熟形式(例如，缺少信號(hào)序列的截短形式)產(chǎn)生，只要保留期望的突變酶活性并且所得的產(chǎn)物(當(dāng)與GTF0544葡糖基轉(zhuǎn)移酶組合使用時(shí))為本發(fā)明的α-葡聚糖纖維組合物即可。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用葡糖基轉(zhuǎn)移酶和突變酶的組合制備本發(fā)明的α-葡聚糖纖維組合物，所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO：1(全長(zhǎng)形式)或SEQIDNO：3(催化活性截短形式)具有至少90％，優(yōu)選地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述突變酶與SEQIDNO：4(如gi：257153264中報(bào)道的全長(zhǎng)形式)或SEQIDNO：6或SEQIDNO：9具有至少90％，優(yōu)選地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，其中應(yīng)當(dāng)理解酶的組合(GTF0544和MUT3264)將保留相似的活性并產(chǎn)生與本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物一致的產(chǎn)品特征?？蓪?duì)包括同時(shí)使用至少一種葡糖基轉(zhuǎn)移酶和至少一種α-葡聚糖水解酶的酶促反應(yīng)體系的溫度進(jìn)行選擇，來控制反應(yīng)速率和酶催化劑活性的穩(wěn)定性兩者。反應(yīng)溫度范圍可為僅高于反應(yīng)制劑的凝固點(diǎn)(約0℃)至約60℃，優(yōu)選的范圍為5℃至約55℃，并且更優(yōu)選的反應(yīng)溫度范圍為約20℃至約47℃。葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性與α-葡聚糖水解酶活性的比率可根據(jù)選擇的酶變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶與α-葡聚糖水解酶的比率的范圍是從1∶0.01至0.01∶1.0。識(shí)別具有期望活性的基本上相似的酶的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，基本上相似的酶序列也可以用于本發(fā)明的組合物和方法中，只要保留期望的活性(即，能夠形成具有期望的糖苷鍵的葡聚糖的葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性或α-葡聚糖水解酶具有針對(duì)一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)糖苷鍵的內(nèi)切水解酶活性)即可。例如，已經(jīng)展示了可制備和使用催化活性截短形式，只要保留期望的活性(或甚至在特定活性方面改善)即可。在一個(gè)實(shí)施方案中，基本上類似的序列通過它們?cè)诟邍?yán)格條件下雜交到與本文例示的序列相關(guān)聯(lián)的核酸分子上的能力進(jìn)行定義。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可基于與本文提供的DNA或氨基酸序列的百分比同一性，使用序列對(duì)比算法定義基本上類似的酶。如本文所用，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)分子的單鏈能夠在合適的溫度和溶液離子濃度條件下對(duì)其它分子退火時(shí)，核酸分子對(duì)另一個(gè)核酸分子諸如cDNA、基因組DNA、或RNA來說是“可雜交的”。雜交和洗滌條件是熟知的并且例示于Sambtook，J.和Russell，D.，T.MolecularCloning：ALaboratoryManual，第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor(2001)。溫度和離子強(qiáng)度的條件確定了雜交的“嚴(yán)格性”?？梢哉{(diào)節(jié)嚴(yán)格條件以篩選中度相似的分子(諸如來自遠(yuǎn)緣生物的同源序列)到高度相似的分子(諸如從近緣生物復(fù)制功能性酶的基因)。雜交后洗滌通常決定嚴(yán)格條件。一組優(yōu)選的條件使用一系列洗滌步驟，開始是6XSSC，0.5％SDS在室溫洗滌15分鐘，然后用2XSSC，0.5％SDS在45℃重復(fù)30分鐘，然后用0.2XSSC，0.5％SDS在50℃重復(fù)洗滌兩次，每次30分鐘。一組更優(yōu)選的條件使用較高溫度，其中洗滌步驟與上述那些步驟相同，不同的是最后兩次用0.2XSSC，0.5％SDS洗滌30分鐘的洗滌溫度提高到60℃。另一組優(yōu)選的高度嚴(yán)格的雜交條件是0.1XSSC，0.1％SDS，65℃，并且用2XSSC，0.1％SDS洗滌，之后是0.1XSSC，0.1％SDS，65℃的最終洗滌。雜交需要包含互補(bǔ)序列的兩種核酸，但是取決于雜交的嚴(yán)格性，堿基之間可能會(huì)發(fā)生錯(cuò)配。用于使核酸雜交的合適的嚴(yán)格性取決于核酸的長(zhǎng)度和互補(bǔ)的程度，它們是本領(lǐng)域熟知的變量。兩個(gè)核苷酸序列之間的相似性程度越高，具有那些序列的核酸的雜交體的Tm值就越大。核酸雜交的相對(duì)穩(wěn)定性(對(duì)應(yīng)較高的Tm)按以下順序依次降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。就長(zhǎng)度大于100個(gè)核苷酸的雜交體而言，已經(jīng)導(dǎo)出了用于計(jì)算Tm的公式(Sambrook，J.和Russell，D.，T.，同上)。對(duì)于較短核酸(即寡核苷酸)的雜交，錯(cuò)配的位置變得更為重要，而且寡核苷酸的長(zhǎng)度確定了其特異性。在一個(gè)方面，可雜交核酸的長(zhǎng)度為至少約10個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，可雜交的核酸的最小長(zhǎng)度為至少約15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地至少約20個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選地至少30個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選地至少300個(gè)核苷酸，并且最優(yōu)選地至少800個(gè)核苷酸。此外，技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可根據(jù)需要根據(jù)諸如探針長(zhǎng)度之類的因素來調(diào)節(jié)溫度和洗滌溶液鹽濃度。如本文所用，術(shù)語“百分比同一性”為兩條或更多條多肽序列之間或者兩條或更多條多核苷酸序列之間的關(guān)系，該關(guān)系通過對(duì)序列進(jìn)行比較確定。在本領(lǐng)域中，“同一性”還表示多肽或多核苷酸序列之間序列關(guān)聯(lián)的程度，根據(jù)具體情況，它由這些序列的序列串之間的核苷酸或氨基酸的匹配數(shù)確定?！巴恍浴焙汀跋嗨菩浴笨扇菀椎赝ㄟ^已知方法計(jì)算，該已知方法包括但不限于以下文獻(xiàn)中所描述的那些：ComputationalMolecularBiology(Lesk，A.M.，編輯)，OxfordUniversity出版社，NY(1988)；Biocomputing：InformaticsandGenomeProjects(Smith，D.W.編輯)，Academic出版社，NY(1993)；ComputerAhalysisofSequenceData，PartI(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.編輯)Humana出版社，NJ(1994)；SequenceAnalysisinMolecularBiology(vonHeinje，G.編輯)Academic出版社(1987)；以及SequenceAnalysisPrimer(Gribskov，M.和Devereux，J.編輯)Stockton出版社，NY(1991)。確定同一性和相似性的方法在可公開獲得的計(jì)算機(jī)程序中被編成了代碼。序列比對(duì)和百分比同一性計(jì)算可使用LASERGENE生物信息學(xué)計(jì)算軟件包的Megalign程序(DNASTARInc.，Madison，WI)、VectorNTIv.7.0的AlignX程序(Informax，Inc.，Bethesda，MD)或EMBOSSOpenSoftwareSuite(EMBL-EBI；Rice等人，TrendsinGenetics16，(6)：276-277(2000))進(jìn)行?？墒褂肅LUSTAL比對(duì)方法(諸如CLUSTALW；例如版本1.83)利用默認(rèn)參數(shù)來進(jìn)行序列的多重比對(duì)(Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins等人，NucleicAcidsRes.22：4673-4680(1994)；以及Chenna等人，NucleicAcidsRes31(13)：3497-500(2003)，可通過EuropeanBioinformaticsInstitute得自EuropeanMolecularBiologyLaboratory)。CLUSTALW蛋白比對(duì)的合適參數(shù)包括GAPExistencepenalty＝15、GAPextension＝0.2、matrix＝Gonnet(例如Gonnet250)、proteinENDGAP＝-1，proteinGAPDIST＝4、以及KTUPLE＝1。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行快速或慢速比對(duì)，其中優(yōu)選慢速比對(duì)。另選地，可將使用CLUSTALW方法(例如1.83版)的參數(shù)修改為也使用KTUPLE＝1、GAPPENALTY＝10、GAPextension＝1、matrix＝BLOSUM(例如BLOSUM64)、WINDOW＝5以及TOPDIAGONALSSAVED＝5。在一個(gè)方面，合適的分離的核酸分子編碼具有下述氨基酸序列的多肽，該氨基酸序列與本文報(bào)道的氨基酸序列具有至少約20％，優(yōu)選地至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在另一方面，合適的分離的核酸分子編碼具有下述氨基酸序列的多肽，該氨基酸序列與本文報(bào)道的氨基酸序列具有至少約20％，優(yōu)選地至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；前提條件是所述多肽保留了相應(yīng)活性(即葡糖基轉(zhuǎn)移酶或α-葡聚糖水解酶活性)。氣體產(chǎn)生在下胃腸道中的快速氣體產(chǎn)生速率引起胃腸道不適，諸如腸胃氣脹和胃氣脹，然而如果氣體產(chǎn)生是漸進(jìn)的和少的，則身體可以更容易地應(yīng)付。例如，當(dāng)在當(dāng)量劑量(可溶性纖維克數(shù))下與本發(fā)明葡聚糖纖維組合物相比時(shí)，菊粉產(chǎn)生快速且高的氣體產(chǎn)生增加，然而在當(dāng)量劑量下本發(fā)明葡聚糖纖維組合物優(yōu)選具有低于菊粉的氣體釋放速率。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含本文所公開的可溶性α-葡聚糖纖維組合物的食物產(chǎn)品的食用產(chǎn)生對(duì)于食品應(yīng)用而言良好耐受的氣體產(chǎn)生速率。在一個(gè)實(shí)施方案中，在當(dāng)量劑量下，氣體產(chǎn)生的相對(duì)速率不大于在類似條件下對(duì)于菊粉所觀察到的速率，優(yōu)選地與菊粉相同或小于菊粉，更優(yōu)選地小于菊粉，并且最優(yōu)選地遠(yuǎn)小于菊粉。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用本文所用的方法，經(jīng)過3小時(shí)或24小時(shí)，測(cè)量氣體形成的相對(duì)速率。在優(yōu)選的方面，在相同反應(yīng)條件下，氣體形成速率比對(duì)于菊粉所觀察到的速率小至少1％，優(yōu)選地2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或至少30％。有益的生理特性短鏈脂肪酸產(chǎn)生使用根據(jù)本發(fā)明的化合物可有利于通過結(jié)腸發(fā)酵產(chǎn)生產(chǎn)能代謝物。使用根據(jù)本發(fā)明的化合物可有利于制備短鏈脂肪酸(SCFA)，諸如丙酸鹽和/或丁酸鹽。已知SCFA降低膽固醇。因此，本發(fā)明的化合物可降低形成高膽固醇的風(fēng)險(xiǎn)。在發(fā)酵研究中，本發(fā)明的葡聚糖纖維組合物可以促進(jìn)SCFA，尤其是丙酸鹽和/或丁酸鹽的產(chǎn)生。因?yàn)镾CFA的產(chǎn)生或SCFA與乙酸鹽的比例的增加有利于在對(duì)其有需要的哺乳動(dòng)物中控制膽固醇含量，所以本文所公開的纖維組合物對(duì)營(yíng)養(yǎng)學(xué)家和消費(fèi)者用于預(yù)防和/或治療心血管風(fēng)險(xiǎn)可以是特別有意義的。因此，另一方面，本公開提供用于改善受試者的健康的方法，所述方法包括以對(duì)所述受試者的健康施加有益效果，諸如治療膽固醇相關(guān)疾病的有效量將包含本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物的組合物施用于受試者。此外，通常已知SCFA降低腸道中的pH，并且這有助于鈣吸收。因此，根據(jù)本公開的化合物還可影響礦物質(zhì)吸收。這是指通過由于腸道中SCFA增加而降低pH，它們還可改善骨骼健康，或預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥。產(chǎn)生SCFA可增加小腸中的粘度，這減少了膽汁酸的再吸收；增加由膽固醇合成膽汁酸并減少了低密度脂蛋白(LDL)膽固醇循環(huán)。如本文所定義的，化合物或組合物的“有效量”是指在各種劑量下并對(duì)于必要的時(shí)間段而言，有效實(shí)現(xiàn)期望的有益生理效應(yīng)，諸如降低血液膽固醇、增加短鏈脂肪酸產(chǎn)生或者預(yù)防或治療胃腸道疾病的量。例如，施用于受試者的組合物的量將根據(jù)各種因素而變化，諸如受試者的病癥、受試者的體重、受試者的年齡、以及組合物是否是唯一營(yíng)養(yǎng)來源。有效量可由執(zhí)業(yè)醫(yī)師或營(yíng)養(yǎng)師容易地設(shè)定。一般來講，施用足量的組合物以向受試者提供高達(dá)約50g的膳食纖維(不溶性和可溶性)/天；例如約25g至約35g的膳食纖維/天。受試者接收的本發(fā)明可溶性α-葡聚糖纖維組合物的量?jī)?yōu)選地在約0.1g/天至約50g/天的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地以0.5g/天至20g/天，并且最優(yōu)選地1g/天至10g/天的速率。如本文所限定的，化合物或組合物可以多劑量攝取，例如1至5次，分散于一天中或急性地，或可以單劑量攝取。如本文所定義的化合物或組合物還可在期望的時(shí)間段內(nèi)連續(xù)喂食。在某些實(shí)施方案中，期望的時(shí)間段為至少一周或至少兩周或至少三周或至少一個(gè)月或至少六個(gè)月。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本公開提供通過將如本文定義的化合物或組合物施用于對(duì)其有需要的受試者來降低對(duì)其有需要的受試者中血液甘油三酯水平的方法。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本公開提供通過將如本文定義的化合物或組合物施用于對(duì)其有需要的受試者來降低對(duì)其有需要的受試者中的低密度脂蛋白水平的方法。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本公開提供通過將如本文定義的化合物或組合物施用于對(duì)其有需要的受試者來增加對(duì)其有需要的受試者中高密度脂蛋白水平的方法。餐后血糖濃度/血糖應(yīng)答的減弱在本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物中存在不是α-(1，4)主鏈鍵的鍵，提供改善的耐消化性，因?yàn)槿祟愊乐械拿缚呻y以水解此類鍵和/或支化鍵。支鏈的存在向葡聚糖纖維提供部分或完全的不可消化性，并且因此實(shí)質(zhì)上沒有葡聚糖吸收到體內(nèi)或葡聚糖更慢地吸收到體內(nèi)，這導(dǎo)致較低的血糖應(yīng)答。因此，本公開提供用于制造導(dǎo)致較低血糖應(yīng)答的食品和飲料組合物的α-葡聚糖纖維組合物。例如，這些化合物可用于替代糖或其它可快速消化的碳水化合物，從而降低食品的血糖負(fù)荷、減少卡路里和/或減低食品的能量密度。因此，具有這些類型的鍵的本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物的穩(wěn)定性使得它們?nèi)菀椎赝ㄟ^而進(jìn)入大腸中，其中它們可用作對(duì)結(jié)腸微生物菌群具有特異性的底物。改善腸道健康在另一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所公開的化合物可用于治療和/或改善腸道健康。本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物優(yōu)選在腸道中通過腸道微生物群緩慢發(fā)酵。優(yōu)選地，本發(fā)明化合物表現(xiàn)出在體外腸道模型中不差于菊粉或其它可商購獲得的纖維諸如(可溶性玉米纖維，Tate&Lyle)、(可溶性玉米纖維或糊精，Roquette)或(耐消化麥芽糖糊精，ArcherDanielsMidlandCompany&MatsutaniChemical)的耐受性，(即相似的氣體產(chǎn)生水平)，優(yōu)選地優(yōu)于一種或多種可商購獲得的纖維的改善的耐受性，即本發(fā)明葡聚糖纖維的發(fā)酵導(dǎo)致在3小時(shí)或24小時(shí)內(nèi)比菊粉更少的氣體產(chǎn)生，從而減少由于氣體形成導(dǎo)致的不適，諸如腸胃氣脹和胃氣脹。在一個(gè)方面，本公開還涉及通過將如本文所公開的化合物或組合物施用于對(duì)其有需要的受試者來緩解受試者胃腸道中氣體形成的方法，以便減少由于腸胃氣脹和胃氣脹導(dǎo)致的腸道疼痛或腸道不適。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所公開的組合物向受試者提供對(duì)食品發(fā)酵的改善的耐受性，并且可與纖維，諸如菊粉或FOS、GOS或乳果糖組合以通過減少氣體產(chǎn)生來改善耐受性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可施用本文所公開的化合物以通過增加糞便體積來改善排便或改善排便規(guī)律。益生元和益生菌一種或多種可溶性α-葡聚糖纖維組合物可用作益生元，或當(dāng)益生菌組合使用時(shí)用作“合生素”，如下所述。所謂“益生元”，是指通過選擇性地刺激胃腸道，特別是結(jié)腸中的一種或有限數(shù)量的細(xì)菌的生長(zhǎng)和/或活性，從而改善宿主的健康來有益地影響受試者的食品成分。益生元的示例包括低聚果糖、菊粉、聚右旋糖、抗性淀粉、可溶性玉米纖維、低聚葡萄糖和低聚半乳糖、阿拉伯木寡糖、乳糖醇和乳果糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含可溶性α-葡聚糖纖維組合物的組合物還包含至少一種益生菌生物。所謂“益生菌生物”是指通過它們?cè)谙乐械墓δ芟蚴茉囌咛峁┯幸嫘Ч幕钗⑸锷攀逞a(bǔ)充劑。為了有效，益生菌微生物必須能夠在消化條件下存活，并且它們必須能夠至少暫時(shí)移植于胃腸道而對(duì)受試者沒有任何傷害。僅微生物的某些菌株具有這些特性。優(yōu)選地，益生菌微生物選自：乳桿菌屬(Lactobacillusspp.)、雙歧桿菌屬(Bifidobacteriumspp.)、芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)、腸球菌屬(Enterococcusspp.)、埃希氏菌屬(Escherichiaspp.)、鏈球菌屬(Streptococcusspp.)和酵母屬(Saccharomycesspp.)。特定微生物包括但不限于，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、雙歧桿菌(Bifidobacteriumbificum)、短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)、乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)、長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)、嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacteriumthermophilum)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、屎鏈球菌(Streptococcusfaecium)、變異鏈球菌(Streptococcusmutans)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、布拉酵母(Saccharomycesboulardii)、球擬酵母(Torulopsia)、米曲霉(Aspergillusoryzae)和鏈霉菌(Streptomyces)等，包括它們的營(yíng)養(yǎng)孢子、非營(yíng)養(yǎng)孢子(芽孢桿菌)和合成衍生物。更優(yōu)選的益生菌微生物包括但不限于三種細(xì)菌屬的成員：乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和酵母屬。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，益生菌微生物是乳桿菌屬、雙歧桿菌屬以及它們的組合。可將益生菌微生物作為在益生菌保持存活的水或其它液體或半固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物摻入組合物中。在另一種技術(shù)中，可通過混合或共混將包含益生菌生物的凍干粉末摻入特定材料或液體或半固體材料中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含益生菌生物，其含量足以遞送至少10億至2000億活益生菌生物，優(yōu)選地10億至1000億，并且最優(yōu)選地10億至500億活益生菌生物。如上所述益生菌生物遞送量可按劑量和/或按天計(jì)，其中多劑量/天可適用于一些應(yīng)用?？蓪煞N或更多種益生菌生物用于一種組合物中。獲得酶促制備的可溶性α-葡聚糖纖維組合物的方法可將任何數(shù)量的常用純化技術(shù)用于從反應(yīng)體系中獲得本發(fā)明的可溶性α-葡聚糖纖維組合物，純化技術(shù)包括但不限于離心、過濾、分餾、色譜分離、滲析、蒸發(fā)、沉淀、稀釋或它們的任意組合，優(yōu)選地通過滲析或色譜分離，最優(yōu)選地通過滲析(超濾)。重組微生物表達(dá)本發(fā)明序列的基因和基因產(chǎn)物可在異源宿主細(xì)胞尤其是微生物宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。用于表達(dá)本發(fā)明基因和核酸分子的優(yōu)選異源宿主細(xì)胞是存在于真菌或細(xì)菌家族中并在寬溫度、pH值和溶劑耐受性范圍內(nèi)生長(zhǎng)的微生物宿主。例如，預(yù)期細(xì)菌、酵母和絲狀真菌中任何一種均適于作為表達(dá)本發(fā)明核酸分子的宿主。一種或多種酶可在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外或者細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外組合表達(dá)，其中相比于用于回收通過細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生的蛋白的方法，細(xì)胞外表達(dá)能夠從發(fā)酵產(chǎn)物中更容易地回收期望蛋白。轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白生物合成設(shè)備相對(duì)于用于生成細(xì)胞生物質(zhì)的細(xì)胞原料保持不變；無論如何將表達(dá)功能基因。宿主菌株的示例包括但不限于細(xì)菌、真菌或酵母物種，諸如曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、紅發(fā)夫酵母屬(Phaffia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、赤細(xì)菌屬(Erythrobacter)、綠菌屬(Chlorobium)、著色菌屬(Chromatium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、噬纖維菌屬(Cytophaga)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacteria)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、異常球菌屬(Deinococcus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、甲基單胞菌屬(Methylomonas)、甲基細(xì)菌屬(Methylobacter)、甲基球菌屬(Methylococcus)、甲基彎菌屬(Methylosinus)、甲基微菌屬(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌屬(Methylocystis)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、集胞菌屬(Synechocystis)、聚球藍(lán)細(xì)菌屬(Synechococcus)、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬(Anabaena)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和粘球菌屬(Myxococcus)。在一個(gè)實(shí)施方案中，真菌宿主細(xì)胞是木霉屬，優(yōu)選地里氏木霉菌株。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌宿主菌株包括埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)以及假單胞菌屬(Pseudomonas)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌宿主細(xì)胞為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或大腸桿菌(Escherichiacoli)。大規(guī)模微生物的生長(zhǎng)和功能基因的表達(dá)可利用各種單一碳水化合物或絡(luò)合碳水化合物、有機(jī)酸和醇或飽和烴(對(duì)于光合自養(yǎng)宿主或化能自養(yǎng)宿主而言，諸如甲烷或二氧化碳)，并可利用各種形式和數(shù)量的氮、磷、硫、氧、碳或任何微量營(yíng)養(yǎng)素(包括小無機(jī)離子)。可通過向培養(yǎng)物中加入或不加入特定的調(diào)節(jié)分子(通常不將其視為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或能量源)來影響生長(zhǎng)速率的調(diào)節(jié)?？捎糜谵D(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞的載體或盒是本領(lǐng)域熟知的。通常，載體或盒包含指導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、可選標(biāo)記和允許自主復(fù)制或染色體整合的序列。合適的載體包含含有轉(zhuǎn)錄起始控制的基因5′區(qū)和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段3′區(qū)。最優(yōu)選的是當(dāng)兩個(gè)控制區(qū)都來源于與轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞同源的基因和/或?qū)ιa(chǎn)宿主是天然的基因，盡管它們無需來源于此。可用于驅(qū)動(dòng)本發(fā)明的先鋒霉素C脫乙酰酶編碼區(qū)在所需宿主細(xì)胞中表達(dá)的起始控制區(qū)或啟動(dòng)子有很多，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。實(shí)質(zhì)上能夠驅(qū)動(dòng)這些基因的任何啟動(dòng)子均適用于本發(fā)明，其包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(可用于在酵母屬中表達(dá))；AOX1(可用于在畢赤酵母屬中表達(dá))；以及l(fā)ac、araB、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac和trc(可用于在大腸桿菌中表達(dá))以及amy、apr、npr啟動(dòng)子和用于在芽孢桿菌屬中表達(dá)的各種噬菌體啟動(dòng)子。終止控制區(qū)也可以源于優(yōu)選宿主細(xì)胞的天然的多種基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含終止控制區(qū)是任選的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合基因包括源于優(yōu)選宿主細(xì)胞的終止控制區(qū)。工業(yè)生產(chǎn)多種培養(yǎng)方法可用來制備一種或多種酶。例如，從重組微生物宿主過表達(dá)的特定基因產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)可通過分批、分批補(bǔ)料和連續(xù)培養(yǎng)的方法進(jìn)行。分批和分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法在本領(lǐng)域內(nèi)是常用的且熟知的，并且示例可見于WulfCrueger和AnnelieseCrueger(作者)的Biotechnology：ATextbookofIndustrialMicrobiology.，第二版，(SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA(1990))和ManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology，第三版，RichardH.Baltz、ArnoldL..Demain和JulianE.Davis(編輯)，(ASM出版社，Washington，DC(2010))。所需酶的商業(yè)生產(chǎn)也可用連續(xù)培養(yǎng)的方法實(shí)現(xiàn)。連續(xù)培養(yǎng)是一種開放式系統(tǒng)，其中將成分確定的培養(yǎng)基連續(xù)加入生物反應(yīng)器中，并同時(shí)移出等量條件培養(yǎng)基用于加工。連續(xù)培養(yǎng)一般使細(xì)胞保持在其中細(xì)胞主要處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的恒定高液相密度。另選地，連續(xù)培養(yǎng)可以用固定化細(xì)胞來進(jìn)行，其中連續(xù)添加碳和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且連續(xù)從細(xì)胞群中取出有價(jià)值的產(chǎn)物、副產(chǎn)物或廢棄物。細(xì)胞固定可使用范圍廣泛的固體支撐體進(jìn)行，所述固體支撐體由天然材料和/或合成材料組成。從分批發(fā)酵、分批補(bǔ)料發(fā)酵或連續(xù)培養(yǎng)中回收一種或多種期望的酶可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法完成。例如，當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生酶催化劑時(shí)，通過離心或膜過濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞漿，任選地用水或期望pH的含水緩沖液洗滌，然后將期望pH的含水緩沖液中的細(xì)胞漿懸浮液勻化，以產(chǎn)生包含期望酶催化劑的細(xì)胞提取物。細(xì)胞提取物可任選地通過合適的助濾劑諸如硅藻土或二氧化硅過濾來去除細(xì)胞碎片，然后進(jìn)行熱處理步驟，以將不需要的蛋白質(zhì)從酶催化劑溶液中沉淀出。然后通過膜過濾或離心將含有所需酶催化劑的溶液從沉淀的細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)分離，并且所得的部分純化的酶催化劑溶液通過另外的膜過濾濃縮，然后任選地與合適的載體(例如，麥芽糖糊精、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或其混合物)混合并噴霧干燥以產(chǎn)生含有所需酶催化劑的固體粉末。另選地，可通過添加多元醇諸如麥芽糖糊精、山梨醇或丙二醇，任選向其中添加防腐劑諸如山梨酸、山梨酸鈉或苯甲酸鈉，將所得的部分純化的酶催化劑溶液穩(wěn)定為液體制劑?？扇苄驭?葡聚糖纖維的制備可以通過在任何合適的含水反應(yīng)條件下將所得的一種或多種酶合并來進(jìn)行，所述反應(yīng)條件導(dǎo)致可溶性α-葡聚糖纖維的產(chǎn)生，諸如本文所公開的條件。反應(yīng)可在水溶液中進(jìn)行，或者在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)可在食物產(chǎn)品內(nèi)原位進(jìn)行。使用酶催化劑在食物產(chǎn)品中原位產(chǎn)生纖維的方法是本領(lǐng)域所熟知的。在某些實(shí)施方案中，將酶催化劑添加到包含蔗糖的液體食物產(chǎn)品中。酶催化劑可減少液體食物產(chǎn)品中蔗糖的量，同時(shí)增加可溶性α-葡聚糖纖維和果糖的量。適用于使用多肽材料(即酶催化劑)在食物產(chǎn)品內(nèi)原位產(chǎn)生纖維的方法可見于WO2013/182686，其內(nèi)容以引用方式并入本文，用于對(duì)使用酶催化劑在食物產(chǎn)品中原位產(chǎn)生纖維的方法的公開。當(dāng)含量、濃度或其它值或參數(shù)以范圍、優(yōu)選范圍或優(yōu)選上限數(shù)值和優(yōu)選下限數(shù)值的列表形式給出時(shí)，其應(yīng)理解為具體地公開由任何范圍上限或優(yōu)選數(shù)值和任何范圍下限或優(yōu)選數(shù)值中的任何一對(duì)所構(gòu)成的所有范圍，而不管所述范圍是否被單獨(dú)地公開。凡在本文中給出某一數(shù)值范圍之處，該范圍均旨在包含其端點(diǎn)以及在該范圍內(nèi)的所有整數(shù)和分?jǐn)?shù)，除非另行指出。當(dāng)定義一個(gè)范圍時(shí)，不旨在將范圍限定于所列舉的具體值。特定實(shí)施方案的描述在第一實(shí)施方案中，提供一種可溶性α-葡聚糖纖維組合物，所述可溶性α-葡聚糖纖維組合物包含：a.10％至30％的α-(1，3)糖苷鍵；b.65％至87％的α-(1，6)糖苷鍵；c.少于5％的α-(1，3，6)糖苷鍵；d.小于5000道爾頓的重均分子量；e.在20℃下，在水中12重量％下，小于0.25帕斯卡秒(Paπs)的粘度；f.在4至40范圍內(nèi)的右旋糖當(dāng)量(DE)；以及g.小于12％的可消化性，如分析化學(xué)師協(xié)會(huì)(AssociationofAnalyticalCommunities，AOAC)方法2009.01所測(cè)量；h.在25℃下，pH7水中至少20％(重量/重量)的溶解度；以及i.小于5的多分散指數(shù)。在對(duì)上述實(shí)施方案中任一個(gè)的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可溶性α-葡聚糖纖維組合物包含小于10％的還原糖。在對(duì)上述實(shí)施方案中任一個(gè)的另一個(gè)實(shí)施方案中，可溶性α-葡聚糖纖維組合物包含小于1％的α-(1，4)糖苷鍵。在對(duì)上述實(shí)施方案中任一個(gè)的另一個(gè)實(shí)施方案中，可溶性α-葡聚糖纖維組合物的特征在于介于400g/mol和2000g/mol之間的數(shù)均分子量(Mn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了碳水化合物組合物，其包含：0.01重量％至99重量％，優(yōu)選地10重量％至90重量％(基于干固體)的根據(jù)第一實(shí)施方案所述的可溶性α-葡聚糖纖維組合物。在對(duì)上述實(shí)施方案中任一個(gè)的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述碳水化合物組合物包含：?jiǎn)翁恰⒍?、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖漿、高果糖玉米糖漿、異構(gòu)化糖、麥芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纖維二糖、異麥芽糖、蜂蜜、楓糖、水果衍生的甜味劑、山梨醇、麥芽糖醇、異麥芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤蘚糖醇、二氫查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、乙?；前匪徕?、阿力甜、紐甜、甘草甜素、奇異果甜蛋白、三氯蔗糖、L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸甲酯、糖精、麥芽糖糊精、淀粉、土豆淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纖維、抗性麥芽糖糊精、支鏈麥芽糖糊精、菊粉、聚右旋糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、低聚龍膽糖、半纖維素、果糖低聚物糖漿、低聚異麥芽糖、填料、賦形劑、粘結(jié)劑或它們的任意組合。在對(duì)上述實(shí)施方案中的任一個(gè)的另一實(shí)施方案中，碳水化合物組合物呈液體、糖漿、粉末、顆粒、成形球、成形棒、成形板、成形立方體、片劑、膠囊、香囊或它們的任意組合的形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供食物產(chǎn)品、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品或藥學(xué)產(chǎn)品，其包含根據(jù)第一實(shí)施方案所述的可溶性α-葡聚糖纖維組合物或包含根據(jù)第一實(shí)施方案所述的可溶性α-葡聚糖纖維組合物的碳水化合物組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供制備可溶性α-葡聚糖纖維組合物的方法，該方法包括：a.提供反應(yīng)組分的系列，其包括：i.蔗糖；優(yōu)選地濃度為至少50g/L，優(yōu)選地至少200g/L；ii至少一種多肽，其具有葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性，所述多肽包含與SEQIDNO：1或3具有至少90％的同一性，優(yōu)選地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；iii.至少一種多肽，其具有α-葡聚糖水解酶活性；優(yōu)選地內(nèi)切突變酶活性或內(nèi)切右旋糖酐酶活性；以及iv.任選地一種或多種受體；b.在適當(dāng)?shù)暮磻?yīng)條件下將所述反應(yīng)組分的系列合并，由此制備包含可溶性α-葡聚糖纖維組合物的產(chǎn)品；c.任選地，將可溶性α-葡聚糖纖維組合物與步驟(b)的產(chǎn)物分離；以及d.任選地，將可溶性α-葡聚糖纖維組合物濃縮。在對(duì)上述實(shí)施方案中任一個(gè)的另一個(gè)實(shí)施方案中，在反應(yīng)期間至少一種具有葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽和至少一種具有α-葡聚糖水解酶活性的多肽同時(shí)存在。在對(duì)上述實(shí)施方案中任一個(gè)的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)切突變酶包含與SEQIDNO：4、6、9或11具有至少90％同一性的氨基酸序列。在對(duì)上述實(shí)施方案中任一個(gè)的另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種具有α-葡聚糖水解酶活性的多肽為來自毛殼菌(Chaetomiumerraticum)的內(nèi)切右旋糖酐酶形式L。在對(duì)上述實(shí)施方案中任一個(gè)的另一個(gè)實(shí)施方案中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性與α-葡聚糖水解酶活性的比率為0.01∶1至1∶0.01。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供制備本發(fā)明α-葡聚糖纖維組合物的方法，該方法包括：a.提供反應(yīng)組分的系列，其包括：i.蔗糖；ii至少一種具有葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，其包含與選自SEQIDNO：13、16、17、19、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60和62的至少一種序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；以及iii.任選地一種或多種受體；b.在適當(dāng)?shù)暮磻?yīng)條件下將所述反應(yīng)組分的系列合并以形成單一反應(yīng)混合物，由此形成包含葡萄糖低聚物的產(chǎn)物混合物；c.任選地，將本發(fā)明可溶性α-葡聚糖纖維組合物與包含葡萄糖低聚物的產(chǎn)物混合物分離；以及d.任選地，將可溶性α-葡聚糖纖維組合物濃縮。根據(jù)上述實(shí)施方案中任一個(gè)所述的組合物或方法，其中碳水化合物組合物包含：?jiǎn)翁?、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖漿、高果糖玉米糖漿、異構(gòu)化糖、麥芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纖維二糖、異麥芽糖、蜂蜜、楓糖、水果衍生的甜味劑、山梨醇、麥芽糖醇、異麥芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤蘚糖醇、二氫查耳酮、甜菊苷、α-葡糖基甜菊苷、乙?；前匪徕?、阿力甜、紐甜、甘草甜素、奇異果甜蛋白、三氯蔗糖、L-天冬氨?；?L-苯丙氨酸甲酯、糖精、麥芽糖糊精、淀粉、土豆淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纖維、抗性麥芽糖糊精、支鏈麥芽糖糊精、菊粉、聚右旋糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、阿拉伯木寡糖、黑曲霉寡糖、低聚龍膽糖、半纖維素、果糖低聚物糖漿、低聚異麥芽糖、填料、賦形劑、粘結(jié)劑或它們的任意組合。根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的組合物或方法，其中所述碳水化合物組合物呈液體、糖漿、粉末、顆粒、成形球、成形棒、成形板、成形立方體、片劑、粉末、膠囊、香囊或它們的任意組合的形式。根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的組合物或方法，其中所述食物產(chǎn)品為：a.烘焙產(chǎn)品，其選自：蛋糕、布朗尼、曲奇、曲奇松脆片、松餅、面包和甜面團(tuán)、擠出谷物片和涂層谷物片(coatedcerealpieces)；b.乳制品，其選自：酸乳、酸乳飲料、乳飲料、調(diào)味乳、冰沙、冰淇淋、奶昔、脫脂乳酸干酪、脫脂乳酸干酪調(diào)味品、脫脂凝乳和打發(fā)的慕斯型產(chǎn)品；c.糖果，其選自：硬糖、方旦糖、牛軋?zhí)呛兔藁ㄌ恰⒚髂z果凍糖、焦糖、果凍、巧克力、甘草、口香糖、焦糖、太妃糖、求斯糖、薄荷糖、片狀糖果和水果小吃；d.飲料，其選自：碳酸飲料、果汁、濃縮果汁混合物、清水、以及飲料干混合物；e.干棒小吃、烤酥餅、甜甜圈或曲奇的高固體填充物；f.擠出和成片的小吃，其選自：膨化小吃、梳打餅、未經(jīng)發(fā)酵的玉米片和玉米薄片；g.干棒小吃、營(yíng)養(yǎng)棒、granola棒、蛋白質(zhì)棒和谷物棒；h.奶酪、奶酪醬和其它可食用的奶酪制品；i.可食用膜；j.水溶性湯、糖漿、醬汁、調(diào)味品或咖啡奶精；或者k.膳食補(bǔ)充劑；優(yōu)選地呈片劑、粉末、膠囊或香囊的形式。一種組合物，其包含0.01重量％至99重量％(基于干固體)的本發(fā)明可溶性α-葡聚糖纖維組合物以及：合生素、肽、肽水解產(chǎn)物、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、大豆蛋白、乳蛋白、氨基酸、多元醇、多酚、維生素、礦物質(zhì)、草藥、草藥提取物、脂肪酸、多不飽和脂肪酸(PUFA)、植物甾類、甜菜堿、類胡蘿卜素、消化酶、益生菌生物或它們的任意組合。根據(jù)上述方法中任一項(xiàng)所述的方法，其中分離步驟包括離心、過濾、分餾、色譜分離、滲析、蒸發(fā)、稀釋或它們的任意組合中的任一個(gè)。根據(jù)上述方法中任一項(xiàng)所述的方法，其中當(dāng)將反應(yīng)組分的系列合并時(shí)，單一反應(yīng)混合物中的蔗糖濃度最初為至少50g/L。根據(jù)上述方法中任一項(xiàng)所述的方法，其中葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性與α-葡聚糖水解酶活性的比率的范圍是從0.01∶1至1∶0.01。根據(jù)上述方法中任一項(xiàng)所述的方法，其中合適的含水反應(yīng)條件包括介于0℃和45℃之間的反應(yīng)溫度。根據(jù)上述方法中任一項(xiàng)所述的方法，其中合適的含水反應(yīng)條件包括3至8，優(yōu)選地4至8的pH范圍。根據(jù)上述方法中任一項(xiàng)所述的方法，其中合適的含水反應(yīng)條件包括緩沖液，其選自磷酸鹽、焦磷酸鹽、碳酸氫鹽、乙酸鹽和檸檬酸鹽。根據(jù)上述方法中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一種葡糖基轉(zhuǎn)移酶選自SEQIDNO：1、3、13、16、17、19、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62以及它們的任意組合。根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一種α-葡聚糖水解酶選自SEQIDNO：4、6、9、11以及它們的任意組合。根據(jù)上述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一種葡糖基轉(zhuǎn)移酶和所述至少一種α-葡聚糖水解酶選自下列的組合：葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTF0544(SEQIDNO：1、3或它們的組合)和突變酶MUT3264(SEQIDNO：4、6、9或它們的組合)的組合。通過上述方法實(shí)施方案中任一項(xiàng)制備的產(chǎn)物；優(yōu)選地，其中所述制備的產(chǎn)物為根據(jù)第一實(shí)施方案所述的可溶性α-葡聚糖纖維組合物。實(shí)施例除非本文另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員一般理解的含義相同。Singleton等人，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY，2D編輯，JohnWiley和Sons，NewYork(1994)，和Hale&Marham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY，HarperPerennial，N.Y.(1991)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了用于本發(fā)明的許多術(shù)語的通用字典。本發(fā)明在以下實(shí)施例中進(jìn)一步限定。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例盡管說明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但僅是以例證的方式給出的。通過上述論述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定本發(fā)明的必要特征，并且在不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)的前提下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修改以適應(yīng)多種用途和條件?？s寫的含義如下：“sec”或“s”表示秒，“ms”表示毫秒，“min”表示分鐘，“h”或“hr”表示小時(shí)，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“mL/min”是毫升每分鐘，“μg/mL”是微克每毫升；“LB”是Luria肉湯；“μm”是微米，“nm”是納米；“OD”是光學(xué)密度；“IPTG”是異丙基-β-D-硫代半乳糖苷；“g”是重力；“mM”是毫摩爾；“SDS-PAGE”是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺；“mg/mL”是毫克每毫升；“N”是標(biāo)稱；“w/v”是重量/體積；“DTT”是二硫蘇糖醇；“BCA”是二喹啉甲酸；“DMAc”是N，N’-二甲基乙酰胺；“LiCl”是氯化鋰，“NMR”是核磁共振；“DMSO”是二甲基亞砜；“SEC”是尺寸排阻色譜；“GI”或“gi”表示GenInfo標(biāo)識(shí)符，由和其它序列數(shù)據(jù)庫使用的系統(tǒng)以唯一地識(shí)別相應(yīng)數(shù)據(jù)庫內(nèi)的多核苷酸和/或多肽序列；“DPx”是指在長(zhǎng)度內(nèi)具有“x”個(gè)單元的葡聚糖聚合度；“ATCC”是指美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)，“DSMZ”和“DSM”將是指萊布尼茨研究所-德國微生物菌種保藏中心(Braunschweig，Germany)；“EELA”是芬蘭食品安全局(Helsinki，F(xiàn)inland)；“CCUG”是指瑞典哥德堡大學(xué)文化收藏中心；“Suc.”是指蔗糖；“Gluc.”是指葡萄糖；“Fruc.”是指果糖；“Leuc.”是指明串珠菌二糖；并且“Rxn”是指反應(yīng)。一般方法本文所用的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA和分子克隆技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知，并且描述于Sambrook，J.和Russell，D.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(2001)；以及Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，ExperimentswithGeneFusions，ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarbor，NY(1984)；以及Ausubel，F(xiàn).M.等人，ShortProtocolsinMolecularBiology，第5版，CurrentProtocolsandJohnWileyandSons，Inc.，N.Y.，2002。適合細(xì)菌培養(yǎng)物維持及生長(zhǎng)的材料和方法在本領(lǐng)域內(nèi)也是熟知的。適用于如下實(shí)施例的技術(shù)可見于如下文獻(xiàn)列出的內(nèi)容中：ManualofMethodsforGeneralBacteriology(PhillippGerhardt，R.G.E.Murray，RalphN.Costilow，EugeneW.Nester，WillisA.Wood，NoelR.Krieg和G.BriggsPhillips編輯，AmericanSocietyforMicrobiologyPress，Washington，DC.(1994))，WulfCrueger和AnnelieseCrueger(作者)，Biotechnology：ATextbookofIndustrialMicrobiology，第二版，(SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA(1990))和ManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology，第三版，RichardH.Baltz、ArnoldL.Demain和JulianE.Davis(編輯)，(AmericanSocietyofMicrobiologyPress，Washington，DC(2010))。除非另外說明，所有用于使細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)并維持的試劑、限制性酶和材料均獲取自BDDiagnosticSystems(Sparks，MD)，Invitrogen/LifeTechnologiesCorp.(Carlsbad，CA)，Li允Technologies(Rockville，MD)，QIAGEN(Valencia，CA)，Sigma-AldrichChemicalCompany(St.Louis，MO)或PierceChemicalCo.(ThermoFisherScientificInc.的分公司(Rockford，IL)。IPTG(目錄號(hào)I6758)和三苯基四唑氯化物得自SigmaCo.(St.Louis，MO)。BELLCO旋轉(zhuǎn)燒瓶得自BellcoCo.(Vineland，NJ)。LB培養(yǎng)基得自Becton，DickinsonandCompany(FranklinLakes，NewJersey)。BCA蛋白質(zhì)測(cè)定得自Sigma-Aldrich(StLouis，MO)。用于生產(chǎn)GTF酶的重組大腸桿菌(E.coli)菌株的生長(zhǎng)在37℃和220rpm下，使用具有氨芐青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)基，使表達(dá)功能性GTF酶的大腸桿菌菌株在搖瓶中生長(zhǎng)至OD600nm＝0.4-0.5，此時(shí)添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至最終濃度為0.5mM，并且在37℃下繼續(xù)溫育2-4小時(shí)。通過在5,000×g下離心15分鐘收獲細(xì)胞并且重新懸浮于pH7.0的50mM磷酸鹽緩沖液中(20％-25％濕細(xì)胞重量/體積)。使得重懸細(xì)胞兩次通過弗氏壓碎器(SLMInstruments，Rochester，NY)以確保＞95％的細(xì)胞裂解。細(xì)胞裂解物在12,000×g和4℃下離心30分鐘。通過BCA蛋白質(zhì)測(cè)定和SDS-PAGE分析所得的上清液(細(xì)胞提取物)以確認(rèn)GTF酶的表達(dá)，并將細(xì)胞提取物儲(chǔ)存在-80℃。pHYT載體pHYT載體主鏈?zhǔn)前莶菅挎邨U菌aprE啟動(dòng)子的復(fù)制性枯草芽孢桿菌表達(dá)質(zhì)粒。其衍生自大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pHY320PLK(登錄號(hào)D00946，并且可從TakaraBioInc.(Otsu，Japan)商購獲得)。大腸桿菌和氨芐青霉素抗性基因的復(fù)制起點(diǎn)是從pACYC177(X06402，并且可從NewEnglandBiolabsInc.(Ipswich，MA)商購獲得)枯草芽孢桿菌和四環(huán)素抗性基因的復(fù)制起點(diǎn)是從pAMalpha-1(Francia等人，JBacteriol.，2002年9月；184(18)：5187-93)。為構(gòu)建pHYT，在四環(huán)素抗性基因之后插入來自噬菌體λ的終止子序列：5’-ATAAAAAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTAT-3’(SEQIDNO：24)。使用破壞HindIII位點(diǎn)的BamHI-HindIII接頭，將包含aprE啟動(dòng)子-編碼感興趣的酶的編碼序列(例如，編碼各種GTF的序列)的AprE信號(hào)肽序列-BPN’終止子的整個(gè)表達(dá)盒(EcoRI-BamHI片段)克隆到pHYT的EcoRI和HindIII位點(diǎn)中。接頭序列為5’-GGATCCTGACTGCCTGAGCTT-3’(SEQIDNO：25)中。aprE啟動(dòng)子和AprE信號(hào)肽序列(SEQIDNO：7)對(duì)于枯草芽孢桿菌是天然的。BPN′終止子來自解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的枯草桿菌蛋白酶。在使用天然信號(hào)肽的情況下，用經(jīng)表達(dá)基因的天然信號(hào)肽替代AprE信號(hào)肽。里氏木霉(T.reesei)的基因槍轉(zhuǎn)化將里氏木霉孢子懸浮液涂布在直徑為的乙酰胺酶轉(zhuǎn)化平板(150μL的5×107-5×108個(gè)孢子/mL懸浮液)的中心上。然后將板在生物罩中風(fēng)干。將停止屏(BioRad165-2336)和大載體支架(BioRad1652322)浸泡在70％乙醇中并風(fēng)干。將干燥劑(硫酸鈣干燥劑；W.A.HammondCompany(Xenia，OH))置于小皮氏培養(yǎng)皿(6emPyrex)中并用Whatman濾紙(GEHealthcareBio-Sciences，Pittsburgh，PA)覆蓋。將包含大載體(BioRad165-2335；Bio-RadLaboratories(Hercules，CA))的大載體支架平放在濾紙的頂部上并替代培養(yǎng)皿蓋。通過將60mg鎢M-10顆粒(微載體，0.7微米，BioRad#1652266，Bio-RadLaboratories)添加到Eppendorf管中來制備鎢顆粒懸浮液。添加乙醇(1mL)(100％)。將鎢在乙醇溶液中渦旋并使其浸泡15分鐘。將Eppendorf管以最大速度短暫地微離心以使鎢成粒狀。潷出乙醇并利用無菌蒸餾水洗滌三次。在第三次潷出洗滌水之后，將鎢重新懸浮于1mL的無菌50％甘油中。通過向1.5mL-Eppendorf管中添加25μL懸浮的鎢來制備轉(zhuǎn)化反應(yīng)用于每個(gè)轉(zhuǎn)化。后續(xù)添加按如下順序進(jìn)行：2μLDNApTrex3表達(dá)載體(SEQIDNO：12；參見美國專利6，426，410)、25μL2.5MCaCl2、10μL0.1M亞精胺。將反應(yīng)連續(xù)渦旋5-10分鐘，從而保持鎢懸浮。然后將Eppendorf管短暫微離心并且潷出。將鎢丸粒利用200uL的70％乙醇洗滌，短暫微離心成粒狀并潷出。所述丸粒用200μL的100％乙醇洗滌，短暫微離心成粒狀并潷出。將鎢丸粒重新懸浮于24μL100％乙醇中。將Eppendorf管置于超聲水浴中并持續(xù)15秒，并將8μL等分試樣轉(zhuǎn)移到經(jīng)干燥的大載體的中心上。將大載體保留在經(jīng)干燥的皮氏培養(yǎng)皿中干燥。將氦氣罐打開至1500psi(～10.3MPa)。將1100psi(～7.58MPa)破裂盤(BioRad165-2329)用于型號(hào)PDS-1000/HeTM顆粒遞送體系(BioRad)中。當(dāng)將鎢溶液干燥時(shí)，將停止屏和大載體支架插入PDS-1000中。將包含目標(biāo)里氏木霉孢子的乙酰胺酶平板放置在停止屏下6cm處。對(duì)室抽29英寸Hg(～98.2kPa)的真空并保持。將He顆粒遞送體系焙燒。將所述室放氣，取出乙酰胺酶平板以在28℃下溫育，直至出現(xiàn)菌落(5天)。改性的amdSBiolistic瓊脂(MABA)/升第I部分，在500mL蒸餾水(dH2O)中制備1000x鹽1mLNoble瓊脂20gpH至6.0，高壓釜第II部分，在500mLdH2O中制備乙酰胺0.6gCsCl1.68g葡萄糖20gKH2PO415gMgSO4·7H2O0.6gCaCl2·2H2O0.6gpH至4.5，0.2微米過濾滅菌；置于50℃烘箱中加熱，添加瓊脂，混合，傾注平板。在室溫下儲(chǔ)存(～21℃)1000x鹽/升FeSO4·7H2O5gMnSO4·H2O1.6gZnSO4·7H2O1.4gCoCl2·6H2O1g達(dá)到1LdH2O。0.2微米過濾滅菌測(cè)定葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定通過以下過程進(jìn)行：在存在或不存在25g/L右旋糖酐(MW～1500，Sigma-Aldrich，目錄號(hào)31394)的情況下，在37℃和125rpm軌道振蕩下，用含200g/L蔗糖的25mM或50mM乙酸鈉緩沖液(pH5.5下)溫育包含GTF酶的1％-10％(v/v)粗蛋白提取物。在1h、2h和3h時(shí)取出一份反應(yīng)混合物的等分試樣并在90℃加熱5min以使GTF失活。通過在13,000xg下離心5分鐘來去除不溶性材料，之后使其過濾通過0.2μmRC(再生纖維素)膜。在85℃下采用兩個(gè)串聯(lián)AminexHPX-87C柱(Bio-Rad，Hercules，CA)通過HPLC分析所得的濾液來定量蔗糖濃度。相對(duì)于反應(yīng)時(shí)間繪出各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的蔗糖濃度并由線性曲線的斜率確定初始反應(yīng)速率。一個(gè)GTF活性單位定義為在測(cè)定條件下每分鐘消耗一微摩爾的蔗糖所需的酶量。測(cè)定α-葡聚糖水解酶活性使用由遠(yuǎn)緣鏈球菌(Streptococcussobrinus)33478TM產(chǎn)生的分泌的酶來制備測(cè)定突變酶活性所需的不溶性變聚糖聚合物。具體地，將遠(yuǎn)緣鏈球菌33478TM的甘油原液的一個(gè)環(huán)在BHI瓊脂板(BrainHeartInfusionagar，Teknova(Hollister，CA)上劃線，并且將板在37℃下溫育2天；使用環(huán)挑取幾個(gè)菌落以接種來自Teknova的原始培養(yǎng)基瓶中的2X100mLBHI液體培養(yǎng)基，并且將培養(yǎng)物在37℃下溫育，靜置24h。通過離心去除所得的細(xì)胞并且通過0.2μm無菌過濾器將所得的上清液過濾；收集2X101mL的濾液。向?yàn)V液中添加2X11.2mL的200g/L蔗糖(最終蔗糖20g/L)。在未攪拌情況下，使反應(yīng)于37℃溫育67h。通過在5000xg下離心10min來收集所得的多糖聚合物。小心地潷出上清液。用40mL的無菌水將不溶性聚合物洗滌4次。使所得的變聚糖聚合物凍干48h。使變聚糖聚合物(390mg)懸浮于39mL的無菌水中以制備10mg/mL懸浮液。通過超聲處理(40％幅值直至較大團(tuán)塊消失，總計(jì)～10min)均化變聚糖懸浮液。將勻化的懸浮液分成等份并在4℃儲(chǔ)存。通過在pH5.5和37℃下用含有0.5mg/mL變聚糖聚合物(如上所述制備的)的25mMKOAc緩沖液溫育合適量的酶，開始突變酶測(cè)定。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取出等分試樣的反應(yīng)混合物并用等體積的100mM甘氨酸緩沖液(pH10)淬滅。通過在14,000xg下離心5min去除各個(gè)經(jīng)淬滅樣品中的不溶性材料。通過對(duì)羥基苯甲酸酰肼溶液(PAHBAH)(LeverM.，Anal.Biochem.，(1972)47：273-279)測(cè)定對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生的低聚糖和多糖聚合物的還原端進(jìn)行定量，并且初始速率由時(shí)間過程中最初三個(gè)或四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的線性曲線圖的斜率來確定。通過將10μL的反應(yīng)樣品上清液添加至100μL的PAHBAH工作溶液中進(jìn)行PAHBAH測(cè)定并在95℃加熱5min。通過混合一份試劑A(0.05g/mL對(duì)羥基苯甲酸酰肼和5體積％的濃鹽酸)與四份試劑B(0.05g/mLNaOH、0.2g/mL酒石酸鉀鈉)來制備工作溶液。記錄410nm處的吸光度，并且通過減去適當(dāng)?shù)谋尘拔詹⑹褂酶鞣N濃度的葡萄糖(作為標(biāo)準(zhǔn)物)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算還原端的濃度。測(cè)定糖苷健在使用高靈敏度冷凍探針以500MHz操作的VarianUnityInova系統(tǒng)(AgilentTechnologies，SantaClara，CA)上采集一維1HNMR數(shù)據(jù)。通過將觀測(cè)發(fā)射器頻率小心地置于“普氏(presat)”實(shí)驗(yàn)的殘余水信號(hào)的共振處，并然后使用具有完整相位循環(huán)(32多次)和10ms的混合時(shí)間的“tnnoesy”實(shí)驗(yàn)獲得水抑制。通常，將干燥的樣品溶解在1.0mL的D2O中并超聲波處理30分鐘。從樣品的可溶部分中，將100μL連同350μLD2O和包含15.3mMDSS(4，4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸鈉鹽)作為內(nèi)標(biāo)和0.29％NaN3作為殺菌劑的100μLD2O一起添加到5mmNMR管中。通過將相應(yīng)的化學(xué)位移處的峰面積積分來測(cè)量每種類型的異頭鍵的豐度。每種類型的異頭鍵的百分比由特定鍵的豐度和來自低聚糖的異頭鍵總豐度計(jì)算。甲基化分析葡聚糖中糖苷鍵的分布通過通常稱為“甲基化分析”或“部分甲基化分析”的熟知技術(shù)來測(cè)定(參見：F.A.Pettolino等人，NatureProtocols，(2012)7(9)：1590-1607)。所述技術(shù)具有多個(gè)細(xì)微變化但常常包括：1.將葡萄糖單元的所有游離羥基基團(tuán)甲基化，2.將甲基化的葡聚糖水解成獨(dú)立的單體單元；3.還原開環(huán)以消除異頭物并形成甲基化的葡萄糖醇；異頭碳通常用氘原子標(biāo)記以形成不同的質(zhì)譜；4.游離羥基基團(tuán)乙?；?通過水解和開環(huán)形成)以產(chǎn)生部分甲基化的乙酸葡萄糖醇酯，也被稱為部分甲基化產(chǎn)物，5.通過與質(zhì)譜法和/或火焰離子化檢測(cè)偶聯(lián)的氣相色譜分析所得的部分甲基化產(chǎn)物。部分甲基化產(chǎn)物包括非還原性末端葡萄糖單元、連接單元和支化點(diǎn)。單獨(dú)的產(chǎn)物通過保留時(shí)間和質(zhì)譜來識(shí)別。部分甲基化產(chǎn)物的分布是每種產(chǎn)物占所有部分甲基化產(chǎn)物的總峰面積的百分比(面積％)。氣相色譜條件如下：RTx-225柱(30m×250μmID×0.1μm膜厚度，RestekCorporation，Bellefonte(PA，USA)，氦載氣(0.9mL/min恒定流量)，烘箱溫度程序在80℃下起始(保持2分鐘)，然后30℃/min至170℃(保持0分鐘)，然后4℃/min至240℃(保持25分鐘)，1μL進(jìn)樣體積(分成5∶1)，使用電子轟擊質(zhì)譜(全掃描模式)檢測(cè)。粘度測(cè)量使用配備有錐體和板狀幾何形狀的TAInstrumentsAR-G2受控應(yīng)力旋轉(zhuǎn)流變儀(TAInstruments-Waters，LLC(NewCastle，DE)測(cè)量可溶性纖維的12重量％水性溶液的粘度。該幾何形狀由兩者均具有光滑表面的40mm2°的上錐體和peltier下板組成。在測(cè)試期間，配備有經(jīng)水飽和海綿的環(huán)境室用于使溶劑(水)蒸發(fā)最小化。在20℃下測(cè)量粘度。將peltier設(shè)置為期望的溫度，并使用Eppendorf移液管(EppendorfNorthAmerica，Hauppauge，NY)將0.65mL的樣品加載到板上。將錐體降低至錐體底部和板之間50μm的間隙。將樣品熱平衡3分鐘。在500-10s-1的剪切速率范圍內(nèi)進(jìn)行剪切速率掃描。通過在測(cè)試結(jié)束時(shí)運(yùn)行重復(fù)剪切速率點(diǎn)來確認(rèn)樣品穩(wěn)定性。測(cè)定蔗糖、葡萄糖、果糖和明串珠菌二糖的濃度通過利用兩個(gè)串聯(lián)的AminexHPX-87C柱(Bio-Rad，Hercules，CA)的HPLC定量蔗糖、葡萄糖、果糖和明串珠菌二糖。所用的色譜條件為在柱和檢測(cè)器隔室處85℃，在樣品和注射器隔室處40℃，流量為0.6mL/min，并且進(jìn)樣體積為10μL。用于數(shù)據(jù)還原的軟件包是來自Waters(WatersCorp.，Milford，MA)的EMPOWERTM版本3。用各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)每種單獨(dú)的糖進(jìn)行校準(zhǔn)。測(cè)定低聚糖的濃度可溶性低聚糖通過利用兩個(gè)串聯(lián)AminexHPX-42A柱(Bio-Rad)的HPLC來定量。所用的色譜條件為85℃柱溫和40℃檢測(cè)器溫度，水作為移動(dòng)相(流量為0.6mL/min)，并且進(jìn)樣體積為10μL。用于數(shù)據(jù)還原的軟件包為來自WatersCorp.的EMPOWERTM版本3。DP2至DP7的低聚糖樣品得自Sigma-Aldrich：麥芽七糖(DP7，目錄號(hào)47872)、麥芽六糖(DP6，目錄號(hào)47873)、麥芽五糖(DP5，目錄號(hào)47876)、麥芽四糖(DP4，目錄號(hào)47877)、麥芽三糖(DP3，目錄號(hào)47884)和麥芽糖(DP2，目錄號(hào)47288)。利用各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)每種單獨(dú)的低聚糖進(jìn)行校準(zhǔn)。測(cè)定可消化性可消化性測(cè)試規(guī)程改編自Megazyme綜合總膳食纖維測(cè)定(AOAC方法，2009.01，Ireland)。最終酶濃度保持與AOAC方法相同：50單位/mL的胰腺α-淀粉酶(PAA)，對(duì)于淀粉葡糖苷酶(AMG)而言為3.4單位/mL。如由AOAC方法所推薦的，每種反應(yīng)中的底物濃度為25mg/mL。每種反應(yīng)物的總體積為1mL，而不是由初始規(guī)程建議的40mL。在具有或不具有兩種消化酶的處理的情況下，一式兩份分析每種樣品。詳細(xì)方案過程如下：通過將來自綜合總膳食纖維測(cè)定盒的20mg純化的豬胰腺α-淀粉酶(150,000單位/g；AOAC方法2002.01)溶于29mL的馬來酸鈉緩沖液(50mM，pH6.0加2mMCaCl2)中并攪動(dòng)5分鐘，之后添加來自相同試劑盒的60uL淀粉葡糖苷酶溶液(AMG，3300單位/mL)來制備酶原液。然后在玻璃小瓶中將0.5mL酶原液與0.5mL可溶性纖維樣品(50mg/mL)混合，并將消化反應(yīng)混合物在振蕩培養(yǎng)箱中以軌道運(yùn)動(dòng)在37℃和150rpm下溫育恰好16h。對(duì)于每種纖維樣品平行進(jìn)行重復(fù)反應(yīng)。通過將0.5mL馬來酸鹽緩沖液(50mM，pH6.0加上2mMCaCl2)和0.5mL可溶性纖維樣品(50mg/mL)混合，并且反應(yīng)混合物在振蕩培養(yǎng)箱中以軌道運(yùn)動(dòng)在37℃和150rpm下溫育恰好16h，一式兩份進(jìn)行對(duì)照反應(yīng)。在16h之后，從培養(yǎng)箱中移除所有樣品并且立即添加75μL的0.75M堿性溶液以終止反應(yīng)。將小瓶立即置于95℃-100℃的加熱塊中，并且溫育20分鐘，偶爾振蕩(用手)。淬滅之后，每種反應(yīng)混合物的總體積為1.075mL。如一般方法中所述，通過利用AminexHPX-87C柱(BioRad)的HPLC定量每個(gè)反應(yīng)中釋放的葡萄糖量。將麥芽糖糊精(DE4-7，Sigma)用作酶的陽性對(duì)照。為計(jì)算可消化性，使用下式：可消化性＝100％*[用酶處理后釋放的葡萄糖量(mg)-酶不存在時(shí)釋放的葡萄糖量(mg)]/1.1*總纖維量(mg)”可溶性低聚糖纖維的純化通過尺寸排阻柱層析(SEC)純化和分離存在于產(chǎn)物混合物中的可溶性低聚糖纖維，所述產(chǎn)物混合物通過在具有或不具有添加的突變酶的情況下使用葡糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化蔗糖制備，如以下實(shí)施例中所述。在典型的過程中，將產(chǎn)物混合物在60℃至90℃下熱處理15分鐘至30分鐘，并且然后在4000rpm下離心10分鐘。將所得的上清液注入純化系統(tǒng)(SEC；GEHealthcareLifeSciences)(10mL-50mL注入量)中，所述純化系統(tǒng)連接至裝填有1.1L的Bio-GelP2凝膠(Bio-Rad，細(xì)，45μm-90μm)的GEHK50/60柱，其使用水作為洗脫劑以0.7mL/min洗脫。使用Bio-RadHPX-47A柱，通過HPLC分析低聚糖的SEC級(jí)分(～5mL/管)。將包含＞DP2低聚糖的級(jí)分合并，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)合并的級(jí)分來分離可溶性纖維，以產(chǎn)生包含3％至6％(重量/重量)固體的溶液，其中將所得的溶液凍干以產(chǎn)生可溶性纖維作為固體產(chǎn)物。純培養(yǎng)物在特定碳源上的生長(zhǎng)為測(cè)試微生物在特定碳源(低聚糖或多糖可溶性纖維)上生長(zhǎng)的能力，選擇的微生物在不含除了研究下的碳源之外的碳源的適當(dāng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。通過在無氧環(huán)境(80％N2、10％CO2、10％H2)中在600nm下定期(每30分鐘)測(cè)量光學(xué)密度來評(píng)估生長(zhǎng)。生長(zhǎng)表示為曲線下面積并且與陽性對(duì)照(葡萄糖)和陰性對(duì)照(不添加碳源)比較。低聚糖可溶性纖維的原液(10％重量/重量)在脫礦質(zhì)水中制備。所述溶液通過UV輻射或過濾(0.2μm)來滅菌。將原液冷凍儲(chǔ)存直至使用。適當(dāng)?shù)牟缓荚磁囵B(yǎng)基由單一成分制備。測(cè)試生物體在具有標(biāo)準(zhǔn)碳源的測(cè)試培養(yǎng)基中厭氧預(yù)生長(zhǎng)。將20μL原液移入蜂窩孔中，并添加180μL不含碳源的培養(yǎng)基與1％測(cè)試微生物。作為陽性對(duì)照，將葡萄糖用作碳源，并且作為陰性對(duì)照，不使用碳源。為確認(rèn)原液的無菌性，使用未接種的孔。每次運(yùn)行使用至少三個(gè)平行孔。將蜂窩板置于Bioscreen中，通過測(cè)量600nm下的吸光度來測(cè)定生長(zhǎng)。每30分鐘進(jìn)行測(cè)量，并且在測(cè)量之前，將板振蕩以確保微生物的均勻懸浮。允許生長(zhǎng)24小時(shí)。結(jié)果計(jì)算為曲線下面積(即，OD600/24h)。測(cè)試的生物體(以及它們的相應(yīng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基)為：產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)3626TM(不具有葡萄糖的厭氧強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基(得自O(shè)xoidMicrobiologyProducts，ThermoScientific)、艱難梭菌(Clostridiumdifficile)DSM1296(DeutscheSammlungvonMikroorganismenandZellkulturenDSMZ，Braunschweig，Germany)(不具有葡萄糖的厭氧強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基(得自O(shè)xoidMicrobiologyProducts，ThermoFisherScientificInc.(Waltham，MA))、大腸桿菌(Escherichiacoli)11775TM(不具有葡萄糖的厭氧胰酶解酪蛋白大豆肉湯)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)EELA(購自DSMZ(Brauchschweig，Germany))(不具有葡萄糖的厭氧胰酶解酪蛋白大豆肉湯)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)NCFM145(不具有葡萄糖的厭氧(deMan、Rogosa和Sharpe)培養(yǎng)基(得自DSMZ))、動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種Bi-07(Bifidobacteriumanimalissubsp.LactisBi-07)(厭氧的DeutscheSammlungvomMikroorgnismenundZellkulturen培養(yǎng)基58(得自DSMZ)，不具有葡萄糖)。體外氣體產(chǎn)生為了測(cè)量由腸道微生物群形成氣體，將預(yù)調(diào)理的糞便漿液與測(cè)試益生元(低聚糖或多糖可溶性纖維)一起溫育，并測(cè)量形成的氣體體積。新鮮糞便材料通過用3份(重量/體積)厭氧模擬培養(yǎng)基稀釋，在厭氧條件下攪動(dòng)1小時(shí)并通過0.3-mm金屬網(wǎng)過濾，此后將其在37℃厭氧溫育24小時(shí)來預(yù)調(diào)理。所用的模擬培養(yǎng)基如G.T.Macfarlane等人所述組成(Microb.Ecol.35(2)：180-7(1998))，其包含在蒸餾水中的以下成分(g/L)：淀粉(BDHLtd.)，5.0；蛋白胨，0.05；胰蛋白胨，5.0；酵母提取物，5.0；NaCl，4.5；KCl，4.5；粘蛋白(豬胃III型)，4.0；酪蛋白(BDHLtd.)，3.0；果膠(柑橘)，2.0；木聚糖(oatspelt)，2.0；阿拉伯半乳聚糖(落葉松木)，2.0；NaHCO3，1.5；MgSO4，1.25；瓜耳膠，1.0；菊粉，1.0；半胱氨酸，0.8；KH2PO4，0.5；K2HPO4，0.5；膽汁鹽3號(hào)，0.4；CaCl2×6H2O，0.15；FeSO4×7H2O，0.005；血紅素，0.05；和Tween80，1.0；半胱氨酸鹽酸鹽，6.3；Na2S×9H2O和作為持續(xù)厭氧條件的指示的0.1％刃天青。將模擬培養(yǎng)基通過0.3mm金屬網(wǎng)過濾，并分入密封的血清瓶中。將測(cè)試益生元從10％(重量/重量)原液添加至最終濃度為1％。在37℃下進(jìn)行溫育，同時(shí)維持厭氧條件。在使用帶刻度的氣密玻璃注射器，在24小時(shí)溫育后手動(dòng)測(cè)量由于微生物活性導(dǎo)致的氣體產(chǎn)生，從而也從模擬單元釋放過壓。實(shí)施例1在大腸桿菌TOP10中制備GTF-BGI：290580544使用優(yōu)化用于在大腸桿菌中表達(dá)的密碼子(DNA2.0)合成編碼在中識(shí)別為GI：290580544的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的截短型式(SEQIDNO：1；來自變異鏈球菌(Streptococcusmutans)NN2025)的Gtf-B)的多核苷酸。將編碼蛋白質(zhì)“GTF0544”(SEQIDNO：3)的核酸產(chǎn)物(SEQIDNO：2)亞克隆到中以生成識(shí)別為pMP67的質(zhì)粒。質(zhì)粒pMP67用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10以生成識(shí)別為TOP10/pMP67的菌株。表達(dá)Gtf-B酶“GTF0544”(SEQIDNO：3)的大腸桿菌菌株TOP10/pMP67的生長(zhǎng)和GTF0544活性的測(cè)定按照上述方法。實(shí)施例2在大腸桿菌BL21(DE3)中產(chǎn)生突變酶MUT3264GI：257153264編碼在中識(shí)別為GI：257153264(SEQIDNO：4)的來自腐殖質(zhì)類芽孢桿菌(PaenibacillusHumicus)NA1123的突變酶的基因由GenScript(GenScriptUSAInc.，Piscataway，NJ)合成。將編碼蛋白質(zhì)序列(“MUT3264”，SEQIDNO：6)的核苷酸序列(SEQIDNO：5)亞克隆到pET24a中(Novagen；MerckKGaA，Darmstadt，Germany)。將所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)(Invitrogen)中以產(chǎn)生識(shí)別為SGZY6的菌株。在以220rpm振蕩的情況下，使菌株在37℃下生長(zhǎng)至OD600為～0.7，然后使溫度降低至18℃并添加IPTG至0.4mM的最終濃度。在通過在4000g下離心收獲之前，使培養(yǎng)物生長(zhǎng)過夜。將來自600mL培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀物懸浮在22mL50mMKPi緩沖液(pH7.0)中。通過French細(xì)胞壓碎器(2通道@15,000psi(103.4MPa))破碎細(xì)胞；通過離心(SORVALLTMSS34轉(zhuǎn)子，@13,000rpm；ThermoFisherScientific，Inc.(Waltham，MA))40分鐘去除細(xì)胞碎片。通過SDS-PAGE分析上清液以確認(rèn)“mut3264”突變酶的表達(dá)并且將粗提取物用于活性測(cè)定。不具有突變酶基因的對(duì)照菌株通過利用pET24a載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞產(chǎn)生。實(shí)施例3在枯草芽孢桿菌菌株BG6006菌株SG1021-1中產(chǎn)生突變酶MUT3264GI：257153264枯草芽孢桿菌(B.subtilis)菌株BG6006菌株SG1021-1SG1021-1為枯草芽孢桿菌突變酶表達(dá)菌株，其表達(dá)來自從發(fā)酵的大豆納豆分離的PaenibacillushumicusNA1123的突變酶。就枯草芽孢桿菌中的重組表達(dá)而言，用芽孢桿菌屬AprE信號(hào)肽(登錄號(hào)AFG28208；SEQIDNO：7)替代天然信號(hào)肽。將編碼MUT3264(SEQIDNO：8)的多核苷酸可操作地連接在編碼芽孢桿菌屬表達(dá)的MUT3264(如以SEQIDNO：9提供的)的AprE信號(hào)肽(SEQIDNO：7)的下游。缺失C-端賴氨酸以在編碼聚組氨酸標(biāo)簽的序列之前提供終止密碼子?？莶菅挎邨U菌宿主BG6006菌株包含9個(gè)蛋白酶缺失(amyE：：xylRPxylAcomK-ermC、degUHy32、oppA、ΔspoIIE3501、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB)。野生型mut3264(如以GI：257153264存在)具有1146個(gè)氨基酸，其中N端33個(gè)氨基酸由SignalP4.0程序(Nordahl等人，(2011)NatureMethods，8：785-786)推導(dǎo)為天然信號(hào)肽。不具有天然信號(hào)肽的成熟mut3264由GenScript合成并且可在aprE啟動(dòng)子下克隆到復(fù)制性芽孢桿菌pHYT表達(dá)載體的NheI和HindIII位點(diǎn)中，并與載體上枯草芽孢桿菌AprE信號(hào)肽融合(SEQIDNO：7)融合。首先將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B中并在含氨芐青霉素(100ug/mL)的LB平板上進(jìn)行選擇。然后將確認(rèn)的構(gòu)建體pDCQ931轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌BG6006中，并在具有四環(huán)素(12.5μg/mL)的LB平板上選擇。將所得的枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株SG1021純化并將單菌落分離物SG1021-1用作突變酶mut3264的來源。SG1021-1菌株首先在包含10ug/mL四環(huán)素的LB中生長(zhǎng)，然后傳代培養(yǎng)到包含12.5μg/mL四環(huán)素的GrantsII培養(yǎng)基中，在37℃下生長(zhǎng)2-3天。在15,000g和4℃下使培養(yǎng)物離心30分鐘并使上清液過濾通過0.22μm過濾器。將包含MUT3264的經(jīng)過濾上清液分成等份并在-80℃冷凍。實(shí)施例4制備突變酶MUT3325GI：212533325編碼馬爾內(nèi)菲青霉(Penicilliummarneffei)18224TM突變酶(中識(shí)別為GI：212533325))的基因由GenScript(Piscataway，NJ)合成。將編碼蛋白質(zhì)序列(MUT3325；SEQIDNO：11)的核苷酸序列(SEQIDNO：10)在SacII和AscI限制性位點(diǎn)處亞克隆進(jìn)質(zhì)粒pTrex3(SEQIDNO：12)，被設(shè)計(jì)成在CBHI啟動(dòng)子和終止子的控制下，用黑曲霉乙酰胺酶進(jìn)行選擇，在里氏木霉中表達(dá)感興趣的基因的載體。如上文一般方法部分所述，通過基因槍注射將所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到里氏木霉中?；驑屴D(zhuǎn)化的具體方法描述于國際PCT專利申請(qǐng)公布WO2009/126773A1中。使用具有來自穩(wěn)定克隆的孢子的1cm2瓊脂棒TRM05-3來接種制備培養(yǎng)基(以下所述)。在28℃和220rpm下，使培養(yǎng)物在搖瓶中生長(zhǎng)4-5天。為了收獲得到分泌的蛋白質(zhì)，首先通過在4000g下離心10分鐘去除細(xì)胞群，并使上清液過濾通過0.2μM無菌過濾器。突變酶MUT3325的表達(dá)通過SDS-PAGE確認(rèn)。以下列出了制備培養(yǎng)基組分。限定的NREL-Trich乳糖里氏木霉痕量元素實(shí)施例5通過發(fā)酵制備MUT3325通過在2L帶擋板的燒瓶中用1.0mL的MUT3325表達(dá)菌株TRM05-3(實(shí)施例4)的冷凍孢子懸浮液接種0.5L的基本培養(yǎng)基來制備發(fā)酵種子培養(yǎng)物(基本培養(yǎng)基由5g/L硫酸銨、4.5g/L磷酸二氫鉀、1.0g/L七水硫酸鎂、14.4g/L無水檸檬酸、1g/L二水氯化鈣、25g/L葡萄糖，以及痕量元素(包括0.4375g/L檸檬酸、0.5g/L七水硫酸亞鐵、0.04g/L七水硫酸鋅、0.008g/L五水硫酸銅、0.0035g/L一水合硫酸錳和0.002g/L硼酸)組成。pH為5.5)。在轉(zhuǎn)移到14L發(fā)酵罐中的8L制備培養(yǎng)基之前，使培養(yǎng)物在32℃和170rpm下生長(zhǎng)48小時(shí)。制備培養(yǎng)基由75g/L葡萄糖、4.5g/L磷酸二氫鉀、0.6g/L二水合氯化鈣、1.0g/L七水硫酸鎂、7.0g/L硫酸銨、0.5g/L無水檸檬酸、0.5g/L七水硫酸亞鐵、0.04g/L七水硫酸鋅、0.00175g/L五水硫酸銅、0.0035g/L一水合硫酸錳、0.002g/L硼酸和0.3mL/Lfoamblast882組成。對(duì)于在34℃和500rpm下于葡萄糖上生長(zhǎng)24h的批次，首先運(yùn)行發(fā)酵。在24h結(jié)束時(shí)，使溫度降低至28℃并使攪拌速度增大至1000rpm。然后在0.030g葡萄糖-槐糖固體/g生物質(zhì)/小時(shí)的特定進(jìn)料速率下，用葡萄糖和槐糖的混合物(62％w/w)進(jìn)料發(fā)酵罐。在運(yùn)行結(jié)束時(shí)，通過離心去除生物質(zhì)，并且使用10-kD分子量截留超濾芯(UFP-10-E-35；GEHealthcare，LittleChalfont，Buckinghamshire，UK)通過超濾將含有突變酶的上清液濃縮約10倍。使?jié)饪s蛋白質(zhì)于-80℃儲(chǔ)存。實(shí)施例6分離通過GTF-B和MUT3264的組合產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維將包含下列物質(zhì)的200mL反應(yīng)物在37℃下攪動(dòng)24小時(shí)，然后加熱至90℃并持續(xù)15分鐘以使酶失活：100g/L蔗糖，含有來自變異鏈球菌(Streptococcusmutans)NN2025的GTF-B(GI：290580544；實(shí)施例1)的大腸桿菌粗蛋白提取物(10％v/v)，以及含有來自腐殖質(zhì)類芽孢桿菌(MUT3264，GI：257153264；實(shí)施例2)的突變酶的大腸桿菌粗蛋白提取物(10％v/v)在蒸餾的去離子H2O中的溶液。將所得的產(chǎn)物混合物離心，并且通過HPLC分析可溶性單糖、二糖和低聚糖的所得的上清液，然后通過使用BioGelP2樹脂(BioRad)的SEC純化132mL的上清液。將包含低聚糖≥DP3的SEC級(jí)分合并并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮用于通過HPLC進(jìn)行分析(表1)。表1：由GTF-B/mut3264突變酶產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維。實(shí)施例7在大腸桿菌BL21中制備GTF-CGI：3130088使用優(yōu)化用于在大腸桿菌中表達(dá)的密碼子(DNA2.0，MenloPark，CA)合成編碼在中識(shí)別為GI：3130088的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(gft)截短型式(SEQIDNO：13；來自變異鏈球菌(Streptococcusmutans)MT-4239的GtfC)的基因。將編碼變異鏈球菌GTF0088葡糖基轉(zhuǎn)移酶的截短型式(SEQIDNO：14)的核酸產(chǎn)物亞克隆到(DNA2.0，MenloParkCA)中以生成識(shí)別為pMP69的質(zhì)粒(SEQIDNO：15)。質(zhì)粒pMP69用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(EMDMillipore，Billerica，MA)以產(chǎn)生識(shí)別為BL21-GI3130088的菌株，從而產(chǎn)生變異鏈球菌gi：3130088葡糖基轉(zhuǎn)移酶的截短形式；本文也稱為“GTF0088”(SEQIDNO：16)。將來自轉(zhuǎn)化板的單個(gè)菌落在含有LB瓊脂與100ug/ml氨芐青霉素的平板上劃線，并在37℃下溫育過夜。將來自平板的單個(gè)菌落接種到包含100ug/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，并在37℃下在220rpm振蕩情況下生長(zhǎng)3.5小時(shí)。將培養(yǎng)物稀釋1250倍到包含總計(jì)2L的具有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基的8個(gè)燒瓶中，并在37℃下在220rpm振蕩情況下生長(zhǎng)4小時(shí)。添加IPTG至終濃度為0.5mM，并且使培養(yǎng)物生長(zhǎng)過夜，然后通過在9000×g下離心收獲。將細(xì)胞沉淀物以5ml緩沖液每克濕細(xì)胞重量的比率懸浮于50mMKPi緩沖液(pH7.0)中。細(xì)胞通過French細(xì)胞壓碎器(2通道@16,000psi)破碎，并且通過在25,000×g下離心去除細(xì)胞碎片。將不含細(xì)胞的提取物儲(chǔ)存在-80℃下。實(shí)施例8在大腸桿菌TOP10中制備變異鏈球菌LJ23GTFGI：387786207如在作為387786207描述的變異鏈球菌LJ23葡糖基轉(zhuǎn)移酶(gtf)的氨基酸序列以SEQIDNO：17提供。編碼來自變異鏈球菌LJ23的在中識(shí)別為387786207(“GTF6207”)的葡糖基轉(zhuǎn)移酶(gtf)的截短型式(SEQIDNO：19)的編碼序列(SEQIDNO：18)通過實(shí)施例7中所述的pMP69質(zhì)粒的誘變來制備。編碼GI：387786207(SEQIDNO：20)的一部分的1630bpDNA片段從GenScript(Piscataway，NJ)訂購。所得的質(zhì)粒(pUC57中的6207f1)用作具有引物8807f1(5’-AATACAATCAGGTGTATTCGACGGATGC-3’；SEQIDNO：21)和8807r1(5’-TCCTGATCGCTGTGATACGCTTTGATG-3’；SEQIDNO：22)的PCR的模板。用于擴(kuò)增的PCR條件如下：1.95℃下2分鐘，2.95℃下40秒，3.48℃下30秒，4.72℃下1.5分鐘，5.回到步驟2并進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，6.4℃無限期。反應(yīng)樣品包含0.5uL的在pUC57中6207f1的質(zhì)粒DNA(90ng)，引物8807f1和8807r1的4uL的混合物(各自40pmol)，5uL的10X緩沖液，2uL10mMdNTPs混合物，1uL的PfuUltraAD(AgilentTechnologies，SantaClara，CA)和37.5uL去離子水。PCR產(chǎn)物利用GFXPCRDN和凝膠帶純化試劑盒(GEHealthcareBio-SciencesCorp.，Piscataway，NJ)凝膠純化。純化產(chǎn)品用作利用QuikChangeLightning定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?AgilentTechnologies，SantaClara，CA)誘導(dǎo)pMP69的大引物。用于誘導(dǎo)反應(yīng)的條件如下：1.95℃下2分鐘，2.95℃下30秒，3.60℃下30秒，4.68℃下12分鐘，5.回到步驟2并進(jìn)行18個(gè)循環(huán)，6.68℃下7分鐘，7.4℃無限期。反應(yīng)樣品包含1uL的pMP69(50ng)、17uL的PCR產(chǎn)物(500ng)、5uL的10X緩沖液、1.5uLQuikSolution試劑、1uL的dNTP混合物、1uL的QuikChangeLightning酶以及23.5uL去離子水。添加2uL的DpnI并且將混合物在37℃下溫育1小時(shí)。然后將所得的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到ONETOP10化學(xué)性組分大腸桿菌中(LifeTechnologies，GrandIsland，NY)。來自轉(zhuǎn)化的菌落在包含100ug/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過夜，并用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(Qiaqen，Valencia，CA)分離質(zhì)粒。進(jìn)行序列分析以確認(rèn)編碼gi：387786207的基因的存在。將所得的質(zhì)粒p6207-1(SEQIDNO：22)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(EMDMillipore，Billerica，MA)中以產(chǎn)生識(shí)別為BL21-6207的菌株。將來自平板的單個(gè)菌落接種到含有100ug/mL氨芐青霉素的5mLLB培養(yǎng)基中，并在37℃下在220rpm振蕩情況下生長(zhǎng)8小時(shí)。將培養(yǎng)物稀釋200倍到包含總計(jì)1L的具有100μg/ml氨芐青霉素和1mMIPTG的LB培養(yǎng)基的4個(gè)燒瓶中。培養(yǎng)物在通過以9000xg離心收獲之前，在33℃下生長(zhǎng)過夜。將細(xì)胞沉淀物以5mL緩沖液每克濕細(xì)胞重量的比率懸浮于50mMKPi緩沖液(pH7.0)中。細(xì)胞通過French細(xì)胞壓碎器(2通道@16,000psi)破碎，并且通過在25,000×g下離心去除細(xì)胞碎片。將不含細(xì)胞的提取物儲(chǔ)存在-80℃下實(shí)施例9分離由GTF-CGI：3130088產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維將包含200g/L蔗糖、大腸桿菌濃縮粗蛋白提取物(10.0％v/v)的蒸餾去離子H2O溶液的600mL反應(yīng)物在30℃下攪動(dòng)22小時(shí)，然后加熱至90℃并持續(xù)10分鐘以使酶失活，所述大腸桿菌濃縮粗蛋白提取物包含來自變異鏈球菌MT-4239GTF-C的GTFGI：3130088(實(shí)施例7)。將所得的產(chǎn)物混合物離心，并且通過HPLC分析所得的上清液的可溶性單糖、二糖和低聚糖，然后通過使用BioGelP2樹脂(BioRad)的SEC純化上清液。將包含低聚糖≥DP3的SEC級(jí)分合并并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮用于通過HPLC進(jìn)行分析(表2)。表2：由GTFGI：3130088產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維。實(shí)施例10分離由GTFGI：：387786207產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維將包含200g/L蔗糖、大腸桿菌濃縮粗蛋白提取物(10.0％v/v)的蒸餾去離子H2O溶液的600mL反應(yīng)物在37℃下攪動(dòng)72h，然后加熱至90℃并持續(xù)10分鐘以使酶失活，所述大腸桿菌濃縮粗蛋白提取物包含來自變異鏈球菌LJ23的GTF6207(SEQIDNO：19)(實(shí)施例8)。將所得的產(chǎn)物混合物離心，并且通過HPLC分析所得的上清液的可溶性單糖、二糖和低聚糖，然后通過使用BioGelP2樹脂(BioRad)的SEC純化580mL的上清液。將包含低聚糖≥DP3的SEC級(jí)分合并并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮用于通過HPLC進(jìn)行分析(表3)。表3：由GTFGI：387786207產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維。實(shí)施例11由GTF-C和GTF-6207產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維的異頭鍵分析如實(shí)施例6、9和10中所述制備的通過色譜法純化的可溶性低聚糖纖維的溶液通過凍干干燥至恒定重量，并且通過1HNMR譜并通過GC/MS分析所得的固體，如一般方法部分中所述(上文)。這些可溶性低聚糖纖維混合物中每一種的異頭鍵記錄在表4和表5中。表4：通過1HNMR譜對(duì)可溶性低聚糖的異頭鍵進(jìn)行分析。實(shí)施例12由GTF-C和GTF-6207產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維的粘度將如實(shí)施例6、9和10中所述制備的通過色譜法純化的可溶性低聚糖纖維的溶液通過凍干干燥至恒定重量，并且將所得的固體用于制備可溶性纖維的12重量％蒸餾去離子水溶液。如一般方法部分中所述，在20℃下測(cè)量可溶性纖維溶液的粘度(以厘泊(cP)為單位記錄，其中1cP＝1毫帕斯卡-秒(mPa-s))(表6)。表6：在20℃下測(cè)量的12％(重量/重量)可溶性低聚糖纖維溶液的粘度(ND＝未測(cè)定)。實(shí)施例編號(hào)GTF粘度(cP)6GTF0544/MUT32646.79GTF-CGI：31300881.810GTFGI：3877862071.7實(shí)施例13由GTF-C和GTF-6207產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維的可消化性將如實(shí)施例6、9和10中所述制備的通過色譜法純化的可溶性低聚糖纖維的溶液通過凍干干燥至恒定重量?？上詼y(cè)試規(guī)程改編自Megazyme綜合總膳食纖維測(cè)定(AOAC方法，2009.01，Ireland)。最終酶濃度保持與AOAC方法相同：50單位/mL的胰腺α-淀粉酶(PAA)，對(duì)于淀粉葡糖苷酶(AMG)而言為3.4單位/mL。如由AOAC方法所推薦的，每種反應(yīng)中的底物濃度為25mg/mL。每種反應(yīng)物的總體積為1mL。在具有或不具有兩種消化酶的處理的情況下，一式兩份分析每種樣品。如一般方法中所述，通過利用AminexHPX-87C柱(BioRad)的HPLC定量釋放的葡萄糖量。將麥芽糖糊精(DE4-7，Sigma)用作酶的陽性對(duì)照(表7)。表7：可溶性低聚糖纖維的可消化性。實(shí)施例編號(hào)GTF可消化性(％)6GTF0544/MUT32649.09GTF-CGI：31300885.610GTFGI：3877862076.9實(shí)施例14通過GTF-C或通過GTF-B和MUT3264的組合產(chǎn)生的低聚糖纖維的分子量如一般方法部分中所述，將如實(shí)施例9和實(shí)施例6中所述制備的色譜法純化的可溶性低聚糖纖維的溶液通過凍干干燥至恒定重量，并且通過SEC色譜分析所得固體的數(shù)均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、峰值分子量(Mp)、z均分子量(Mz)、和多分散性指數(shù)(PDI＝Mw/Mn)(表8)。表8：通過SEC表征可溶性低聚糖纖維。實(shí)施例14A構(gòu)建表達(dá)GTF0088的同源基因的枯草芽孢桿菌菌株將GTF0088酶的氨基酸序列(GI3130088)用作用BLAST搜索NR數(shù)據(jù)庫(NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫的非冗余版本)的查詢物。從BLAST搜索中，識(shí)別超過60個(gè)序列在至少1000個(gè)氨基酸的比對(duì)長(zhǎng)度范圍內(nèi)具有至少80％的同一性。然后使用CLUSTALW比對(duì)這些序列。使用DiscoveryStudio，還生成系統(tǒng)發(fā)育樹。該系統(tǒng)發(fā)育樹具有三個(gè)主要的分支。多于二十幾個(gè)同系物屬于與GTF0088相同的分支。這些序列在～1455殘基的比對(duì)區(qū)中具有介于91.5％-99.5％之間的氨基酸序列同一性，其從GTF0088中的位置1延伸至1455。如實(shí)施例10-13中所述，評(píng)估同系物之一，GTF6207。通過Genscript合成10個(gè)附加的同系物，連同天然密碼子中的GTF0088(表9)，其具有N端可變區(qū)截短形式。在aprE啟動(dòng)子下將合成基因克隆到枯草芽孢桿菌整合表達(dá)質(zhì)粒p4JH的NheI和HindIII位點(diǎn)中，并且在載體上與枯草芽孢桿菌AprE信號(hào)肽融合。在一些情況下，在不具有信號(hào)肽的情況下，在aprE啟動(dòng)子下將它們克隆到枯草芽孢桿菌整合表達(dá)質(zhì)粒p4JH的SpeI和HindIII位點(diǎn)中。首先將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B中并在含氨芐青霉素(100ug/ml)的LB平板上進(jìn)行選擇。然后將經(jīng)確認(rèn)的表達(dá)特定GTF的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到包含九個(gè)蛋白酶缺失的枯草芽孢桿菌宿主中(amyE：：xylRPxylAcomK-ermC、degUHy32、oppA、ΔspoHE3501、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB)并在含氯霉素(5ug/ml)的LB平板上選擇。使在含有5ug/ml氯霉素的LB平板上生長(zhǎng)的菌落在含25ug/ml氯霉素的LB平板上劃線接種幾次。使所得的枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株首先在含5ug/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并然后傳代培養(yǎng)到GrantsII培養(yǎng)基中，在30℃下生長(zhǎng)2-3天。在4℃下以15,000g使培養(yǎng)物離心30分鐘并使上清液過濾通過0.22um過濾器。將過濾后的上清液分成等份并在-80℃下冷凍。表9：在該應(yīng)用中測(cè)試的具有N端截短形式的GTF0088同系物在蔗糖轉(zhuǎn)化測(cè)定中，測(cè)試包含具有N端截短形式的GTF0088同源酶的上清液的活性。三天之后，通過HPLC分析樣品。下表示出所有N端截短的同源酶在轉(zhuǎn)化蔗糖時(shí)的活性，并且產(chǎn)生的小分子糖和低聚物的特征相似。實(shí)施例14B構(gòu)建表達(dá)GTF0088的同源基因的C端截短形式的枯草芽孢桿菌菌株葡糖基轉(zhuǎn)移酶通常包含N-端可變結(jié)構(gòu)域、中間催化結(jié)構(gòu)域、之后是在C端的多個(gè)葡聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。實(shí)施例14A中測(cè)試的GTF0088同系物全部包含N端可變區(qū)截短形式。還制備并評(píng)估具有葡聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的部分的附加C端截短形式的同系物。該實(shí)施例描述了表達(dá)GTF0088同系物的C端截短形式中的兩種的枯草芽孢桿菌菌株的構(gòu)建體。將C端T1或T3截短形式制成實(shí)施例14A的表中所列的GTF0088、GTF5318、GTF5328和GTF5330。這些T1菌株的核苷酸序列以SEQIDNO：47-53(奇數(shù))示出；這些T1菌株的氨基酸序列以SEQIDNO：48-54(偶數(shù))示出。T3菌株的核苷酸序列以SEQIDNO：55-61(奇數(shù))示出；T3菌株的氨基酸序列以SEQIDNO：56-62(偶數(shù))示出。編碼T1或T3截短形式的DNA片段為從由Genscript提供的合成基因質(zhì)粒擴(kuò)增的PCR并且在不具有信號(hào)肽的情況下在aprE啟動(dòng)子下克隆到枯草芽孢桿菌整合表達(dá)質(zhì)粒p4JH的SpeI和HindIII位點(diǎn)中。首先將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B中并在含氨芐青霉素(100ug/ml)的LB平板上進(jìn)行選擇。然后將經(jīng)確認(rèn)的表達(dá)特定GTF的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到包含9個(gè)蛋白酶缺失的枯草芽孢桿菌宿主菌株中(amyE：：xylRPxylAcomK-ermC、degUHy32、oppA、ΔspoIIE3501、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB)并在含氯霉素(5ug/ml)的LB平板上選擇。使在含有5ug/ml氯霉素的LB平板上生長(zhǎng)的菌落在含25ug/ml氯霉素的LB平板上劃線接種幾次。使所得的枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株首先在含5ug/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并然后傳代培養(yǎng)到GrantsII培養(yǎng)基中，在30℃下生長(zhǎng)2-3天。在4℃下以15,000g使培養(yǎng)物離心30分鐘并使上清液過濾通過0.22um過濾器。將過濾后的上清液分成等份并在-80℃下冷凍。實(shí)施例14C分離通過C-端截短的GTF0088T1產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維將包含450g/L蔗糖和枯草芽孢桿菌粗蛋白提取物(5％v/v)的蒸餾去離子H2O溶液的250mL反應(yīng)物在pH5.5和47℃下攪動(dòng)22h，然后加熱至90℃并持續(xù)30min以使酶失活，所述枯草芽孢桿菌粗蛋白提取物包含來自變異鏈球菌(Streptococcusmutans)MT4239(GI：3130088；實(shí)施例14A)的GTF0088的型式，其具有葡聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的部分的附加C端截短形式(GTF0088-T1，實(shí)施例14B)。將所得的產(chǎn)物混合物離心，并且通過HPLC分析所得的上清液的可溶性單糖、二糖和低聚糖(表11)，然后通過使用DiaionUBK530(Na+形式)樹脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC將低聚糖與上清液分離。將包含低聚糖≥DP3的SEC級(jí)分合并并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮以通過HPLC進(jìn)行分析(表11)。將合并的SEC級(jí)分稀釋至5重量％干固體(DS)并且冷凍干燥以產(chǎn)生干固體形式的纖維。表11：由GTF0088-T1產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維。實(shí)施例14D分離通過C-端截短的GTF5318-T1產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維將包含450g/L蔗糖和枯草芽孢桿菌粗蛋白提取物(5％v/v)的蒸餾去離子H2O溶液的250mL反應(yīng)物在pH5.5和47℃下攪動(dòng)4h，然后加熱至90℃并持續(xù)30分鐘以使酶失活，所述枯草芽孢桿菌粗蛋白提取物包含來自變異鏈球菌(Streptococcusmutans)BZ15的GTF5318的型式(GI：440355318；實(shí)施例14A)，其具有葡聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的部分的附加C端截短形式(GTF5318-T1，實(shí)施例14A和14B)。將所得的產(chǎn)物混合物離心，并且通過HPLC分析所得的上清液的可溶性單糖、二糖和低聚糖(表12)，然后通過使用DiaionUBK530(Na+形式)樹脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC將低聚糖與上清液分離。將包含低聚糖≥DP3的SEC級(jí)分合并并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮以通過HPLC進(jìn)行分析(表12)。將合并的SEC級(jí)分稀釋至5重量％干固體(DS)并且冷凍干燥以產(chǎn)生干固體形式的纖維。表12：由GTF5318-T1產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維。實(shí)施例14E分離通過C-端截短的GTF5328-T1產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維將包含450g/L蔗糖和枯草芽孢桿菌粗蛋白提取物(5％v/v)的蒸餾去離子H2O溶液的250mL反應(yīng)物在pH5.5和47℃下攪動(dòng)4h，然后加熱至90℃并持續(xù)30min以使酶失活，所述枯草芽孢桿菌粗蛋白提取物包含來自StreptococcustroglodytaeMark的GTF5328的型式(GI：440355328；實(shí)施例14A)，其具有葡聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的部分的附加C端截短形式(GTF5328-T1，實(shí)施例14A和14B)。將所得的產(chǎn)物混合物離心，并且通過HPLC分析所得的上清液的可溶性單糖、二糖和低聚糖(表13)，然后通過使用DiaionUBK530(Na+形式)樹脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC將低聚糖與上清液分離。將包含低聚糖≥DP3的SEC級(jí)分合并并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮以通過HPLC進(jìn)行分析(表13)。將合并的SEC級(jí)分稀釋至5重量％干固體(DS)并且冷凍干燥以產(chǎn)生干固體形式的纖維。表13：由GTF5328-T1產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維。實(shí)施例14F分離通過C-端截短的GTF5330-T1產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維將包含450g/L蔗糖和枯草芽孢桿菌粗蛋白提取物(5％v/v)的蒸餾去離子H2O溶液的250mL反應(yīng)物在pH5.5和47℃下攪動(dòng)4h，然后加熱至90℃并持續(xù)30min以使酶失活，所述枯草芽孢桿菌粗蛋白提取物包含來自變異鏈球菌(Streptococcusmutans)UA113的GTF5330的型式(GI：440355330；實(shí)施例14A)，其具有葡聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的部分的附加C端截短形式(GTF5330-T1，實(shí)施例14A和14B)。將所得的產(chǎn)物混合物離心，并且通過HPLC分析所得的上清液的可溶性單糖、二糖和低聚糖(表14)，然后通過使用DiaionUBK530(Na+形式)樹脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC將低聚糖與上清液分離。將包含低聚糖≥DP3的SEC級(jí)分合并并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮以通過HPLC進(jìn)行分析(表14)。將合并的SEC級(jí)分稀釋至5重量％干固體(DS)并且冷凍干燥以產(chǎn)生干固體形式的纖維。表14：由GTF5330-T1產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維。實(shí)施例14G分離通過C-端截短的GTF5330-T3產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維將包含450g/L蔗糖和枯草芽孢桿菌粗蛋白提取物(5％v/v)的蒸餾去離子H2O溶液的250mL反應(yīng)物在pH5.5和47℃下攪拌4h，然后加熱至90℃并持續(xù)30min以使酶失活，所述枯草芽孢桿菌粗蛋白提取物包含來自變異鏈球菌(Streptococcusmutans)UA113的GTF5330的型式(GI：440355330；實(shí)施例14A)，其具有葡聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的部分的附加C端截短形式(GTF5330-T3，實(shí)施例14A和14B)。將所得的產(chǎn)物混合物離心，并且通過HPLC分析所得的上清液的可溶性單糖、二糖和低聚糖(表15)，然后通過使用DiaionUBK530(Na+形式)樹脂(Mitsubishi)由40℃下的SEC將低聚糖與上清液分離。將包含低聚糖≥DP3的SEC級(jí)分合并并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮以通過HPLC進(jìn)行分析(表15)。將合并的SEC級(jí)分稀釋至5重量％干固體(DS)并且冷凍干燥以產(chǎn)生干固體形式的纖維。表15：由GTF5330-T3產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維。實(shí)施例14H由C-端截短的GTF-0088同系物產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維的異頭鍵分析如實(shí)施例14C-14G中所述制備的通過色譜法純化的可溶性低聚糖纖維的溶液通過凍干干燥至恒定重量，并且通過1HNMR譜并通過GC/MS分析所得的固體，如一般方法部分中所述(上文)。這些可溶性低聚糖纖維混合物中每一種的異頭鍵記錄在表16和表17中，并且與使用非C端截短的GTF0088制備的可溶性低聚糖纖維(實(shí)施例9)進(jìn)行比較。表16：通過1HNMR譜對(duì)可溶性低聚糖的異頭鍵進(jìn)行分析。實(shí)施例14I可溶性低聚糖纖維的粘度將如實(shí)施例6、9和10中所述制備的通過色譜法純化的可溶性低聚糖纖維的溶液通過凍千干燥至恒定重量，并且將所得的固體用于制備可溶性纖維的12重量％蒸餾去離子水溶液。如一般方法部分中所述，在20℃下測(cè)量可溶性纖維溶液的粘度(以厘泊(cP)為單位記錄，其中1cP＝1毫帕斯卡-秒(mPa-s))(表18)。表18：在20℃下測(cè)量的12％(重量/重量)可溶性低聚糖纖維溶液的粘度(ND＝未測(cè)定)。實(shí)施例編號(hào)GTF粘度(cP)6GTF0544/MUT32646.79GTF-CGI：31300881.810GTFGI：3877862071.714DGTF5318-T14.114EGTF5328-T14.114FGTF5330-T14.114GGTF5330-T31.7實(shí)施例14J由C-端截短的GTF-0088同系物產(chǎn)生的可溶性低聚糖纖維的可消化性將如實(shí)施例14C-14G中所述制備的通過色譜法純化的可溶性低聚糖纖維的溶液通過凍干干燥至恒定重量?？上詼y(cè)試規(guī)程改編自Megazyme綜合總膳食纖維測(cè)定(AOAC方法，2009.01，Ireland)。最終酶濃度保持與AOAC方法相同：50單位/mL的胰腺α-淀粉酶(PAA)，對(duì)于淀粉葡糖苷酶(AMG)而言為3.4單位/mL。如由AOAC方法所推薦的，每種反應(yīng)中的底物濃度為25mg/mL。每種反應(yīng)物的總體積為1mL。在具有或不具有兩種消化酶的處理的情況下，一式兩份分析每種樣品。如一般方法中所述，通過使用AminexHPX-87C柱(BioRad)的HPLC定量釋放的葡萄糖量，并且與使用非C端截短的GTF0088制備的可溶性低聚糖纖維(實(shí)施例9)的可消化性進(jìn)行比較(表19)。表19：可溶性低聚糖纖維的可消化性。實(shí)施例15使用可溶性低聚糖/多糖纖維作為碳源的體外氣體產(chǎn)生將通過色譜法純化的可溶性低聚糖/多糖纖維的溶液通過凍干干燥至恒定重量。隨后，使用如一般方法中所述的方法，評(píng)估作為碳源的單獨(dú)的可溶性低聚糖/多糖可溶性纖維樣品的體外氣體產(chǎn)生。包括如下物質(zhì)作為對(duì)照碳源：85(可溶性玉米纖維，Tate&Lyle)、FM06(可溶性玉米纖維或糊精，Roquette)、600F(耐消化麥芽糖糊精，ArcherDanielsMidlandCompany&MatsutaniChemical)、GR(菊粉，得自Beneo(Mannheim，Germany))、UltraTM(聚右旋糖，Danisco)、GOS(低聚半乳糖，ClasadoInc.(Reading，UK))、P95(低聚果糖(果糖低聚糖，F(xiàn)OS，Beneo)，LACTITOLMC(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡萄糖醇一水合物，Danisco)和葡萄糖。表20列出了在3h和24h下由腸道微生物群產(chǎn)生的體外氣體產(chǎn)量。表21列出了在消化之后3小時(shí)、24.5小時(shí)和/或26小時(shí)時(shí)，由使用截短的酶制備的腸道微生物群飼養(yǎng)纖維的體外氣體產(chǎn)量對(duì)來自對(duì)照物質(zhì)的微生物群攝取的氣體產(chǎn)量。表20：由腸道微生物群產(chǎn)生的體外氣體產(chǎn)量。表21：由腸道微生物群產(chǎn)生的體外氣體產(chǎn)量。實(shí)施例16結(jié)腸發(fā)酵建模和脂肪酸的測(cè)量使用半連續(xù)結(jié)腸模擬器對(duì)結(jié)腸發(fā)酵建模，如由等人所述(Nutri.Cancer(2005)52(1)：94-104)；簡(jiǎn)單來說，結(jié)腸模擬器由包含模擬回腸液的四個(gè)玻璃容器組成，如Macfarlane等人所述(Microb.Ecol.(1998)35(2)：180-187)。模擬器用新鮮的人糞便微生物群接種，并且每三個(gè)小時(shí)用新的回腸液喂養(yǎng)，內(nèi)容物的部分從一個(gè)容器轉(zhuǎn)移到下一個(gè)容器。回腸液包含濃度為1％的所述測(cè)試組分中的一種。所述模擬持續(xù)48h，此后收獲四個(gè)容器的內(nèi)容物用于進(jìn)一步分析。進(jìn)一步分析涉及微生物代謝物諸如短鏈脂肪酸(SCFA)(也稱為揮發(fā)性脂肪酸(VFA))和支鏈脂肪酸(BCFA)的測(cè)定。分析如Holben等人(Microb.Ecol.(2002)44：175-185)所述進(jìn)行；簡(jiǎn)單來說，將模擬器內(nèi)容物離心并且將上清液用于SCFA和BCFA分析。將新戊酸(內(nèi)標(biāo))和水與上清液混合并離心。離心后，向上清液中添加草酸溶液，并且然后將混合物在4℃下溫育，并且然后再次離心。通過使用火焰離子化檢測(cè)器和氦氣作為載氣的氣相色譜來分析所得的上清液。還提供由ULTRATM(聚右旋糖，Danisco)、P95(低聚果糖；果糖低聚糖，“FOS”，Beneo)、乳糖醇(LactitolMC(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡萄糖醇一水合物，Danisco)、和陰性對(duì)照的樣品產(chǎn)生的比較數(shù)據(jù)。測(cè)定乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、2-甲基丁酸和乳酸的濃度(表22)。實(shí)施例17制備酸乳-可飲用沙冰以下實(shí)施例描述了利用本發(fā)明的纖維制備酸乳-可飲用沙冰。表23：成分wt％蒸餾水49.00SuproXT40大豆蛋白分離物6.50果糖1.00GrindstedASD525，Danisco0.30蘋果汁濃縮物(70Brix)14.79草莓果泥，單一強(qiáng)度4.00香蕉果泥，單一強(qiáng)度6.00簡(jiǎn)單的低脂酸乳-希臘風(fēng)格，Cabot9.001％Red40Soln0.17草莓風(fēng)味劑(DD-148-459-6)0.65香蕉風(fēng)味劑(#29513)0.2075/25蘋果酸/檸檬酸共混物0.40本發(fā)明可溶性纖維樣品8.00總計(jì)100.00實(shí)施例18纖維水制劑的制備以下實(shí)施例描述了利用本發(fā)明纖維制備纖維水。表24：成分wt％水，去離子的86.41淡黃綠色號(hào)065090.00本發(fā)明可溶性纖維樣品8.00蔗糖5.28檸檬酸0.08風(fēng)味劑(M748699M)0.20維生素C，抗壞血酸0.02總計(jì)100.00實(shí)施例19可勺性酸奶制劑的制備以下實(shí)施例描述了利用本發(fā)明的纖維制備可勺性酸奶。表25：成分wt％脫脂乳84.00糖5.00酸乳(6051)3.00培養(yǎng)物(添加至pH斷點(diǎn))本發(fā)明可溶性纖維8.00總計(jì)100.00實(shí)施例20模型干棒小吃的制劑的制備以下實(shí)施例描述了利用本發(fā)明的纖維制備模型干棒小吃。表26：實(shí)施例21高纖維片的制備以下實(shí)施例描述了利用本發(fā)明的纖維制備高纖維片。表27：1-Danisco.實(shí)施例22軟巧克力碎片曲奇的制備以下實(shí)施例描述了利用本發(fā)明的纖維制備軟巧克力碎片曲奇。表28：實(shí)施例23減脂油酥松餅(REDUCEDFATSHORT-CRUSTPASTRY)的制備以下實(shí)施例描述了利用本發(fā)明的纖維制備減脂油酥松餅。表29：成分wt％面粉，清蛋白液56.6水15.1人造黃油11.0酥油11.0本發(fā)明纖維6.0鹽0.3實(shí)施例24低糖谷物簇(LOWSUGARCEREALCLUSTER)的制備以下實(shí)施例描述了利用本發(fā)明纖維中的一種制備低糖谷物簇。表30：成分wt％糖漿粘結(jié)劑30.0乳糖醇，MC50％本發(fā)明纖維溶液(70Brix)25％水25％谷物混合物60.0燕麥片70％片狀燕麥10％酥脆米10％燕麥片10％植物油10.0實(shí)施例25果膠凍的制備以下實(shí)施例描述了利用本發(fā)明的纖維制備果膠凍。表31：實(shí)施例26橡皮糖(CHEWYCANDY)的制備以下實(shí)施例描述了利用本發(fā)明的纖維制備橡皮糖。表32：成分wt％本發(fā)明葡聚糖纖維35木糖醇35水10植物脂肪4.0甘油單硬脂酸酯(GMS)0.5卵磷脂0.5明膠180塊(40％溶液)4.0木糖醇，CM5010.0風(fēng)味劑、著色劑和酸q.s.實(shí)施例27咖啡-櫻桃冰淇淋的制備以下實(shí)施例描述了利用本發(fā)明的纖維制備咖啡-櫻桃冰淇淋。表33：1-Danisco.當(dāng)前第1頁1 2 3