本申請要求在2014年4月23日提交的美國臨時申請第61/983,003號案的優(yōu)先權，在此將其全文并入以供參考。
背景技術：
：轉(zhuǎn)基因鳥類(例如，轉(zhuǎn)基因雞，鵪鶉或者火雞)是用于獲得外源重組蛋白的理想表達系統(tǒng)，所述外源重組蛋白可用于需要大量蛋白質(zhì)供應的藥物或其他的商業(yè)應用。一只母雞每年可以產(chǎn)下多達330只雞蛋，每只雞蛋含有6.5g蛋白質(zhì)?？偟鞍踪|(zhì)中約3.5g來自蛋清，其中7種不同的蛋白質(zhì)占90％；卵清蛋白僅占有蛋清蛋白質(zhì)的2g(約50％的蛋清蛋白質(zhì))。目前，已知來源于轉(zhuǎn)基因動物的輸卵管特定表達和從所述蛋清中收獲的平均外源基因產(chǎn)物為每個雞蛋約5至10mg。在雞蛋中生產(chǎn)外源蛋白的優(yōu)點可包括世代時間短和通過人工授精的繁殖率高。各種蛋白質(zhì)已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因雞的雞蛋中表達?？蓞㈤?，例如美國專利號6730822和美國公開號2006/0015960。許多外源治療性蛋白(例如，人重組蛋白，比如細胞因子(例如，紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子(GC-SF)、干擾素、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF))、抗體、和人體的溶酶體酶)是制藥行業(yè)感興趣的。治療性蛋白易于從(例如)轉(zhuǎn)基因雞的蛋清中大量獲得。然而，從所述蛋清中分離外源蛋白的傳統(tǒng)方法，往往依賴于使用免疫親和方法或僅適用于小規(guī)模生產(chǎn)(比如，包括總蛋清體積至多5L)的其它方法。對于大規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)，基于成本、勞動力和時間這種方法是不實用的。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明基于如下意想不到的發(fā)現(xiàn)，即：向工業(yè)規(guī)模(例如，具有至少10L的體積)的蛋清池(例如，從諸如雞、鵪鶉或者火雞的轉(zhuǎn)基因鳥所下的蛋中獲得)中加入少量的酸性緩沖液(例如，單次大劑量注射(inasinglebolusinjection))，可以制備蛋清用于重組蛋白的批量層析分離，所述重組蛋白如無需稀釋蛋清的來自蛋清的人治療性蛋白。這種方法可以顯著地減少需要經(jīng)過下游分離/純化過程的蛋清物質(zhì)的量(例如，在層析分離中使用的柱的數(shù)量)，從而顯著地減少了從蛋清中分離重組蛋白的成本、勞動力和時間。因此，本發(fā)明中描述的方法可以極大地提高蛋清制備的效率，從而用于大的、工業(yè)規(guī)模的治療性蛋白生產(chǎn)。一方面，本發(fā)明的特征在于一種制備用于批量層析處理的蛋清的方法，包括以下步驟：(1)將含有酸化劑的酸性緩沖液加入到蛋清池中，每千克蛋清中所述酸性緩沖液的質(zhì)量分數(shù)約0.5wt％至約5wt％；和(2)將所述酸性緩沖液和所述蛋清混合，以形成pH約5至約6.5的混合蛋清。另一方面，本發(fā)明的特征在于一種從蛋清中分離重組蛋白的方法，包括以下步驟：(1)提供含有重組蛋白的蛋清池，所述蛋清池的體積至少10L；(2)調(diào)節(jié)所述蛋清的pH至約5至約6.5，其中所述pH已調(diào)節(jié)的蛋清的電導率為約8mS/cm至約20mS/cm；(3)過濾所述蛋清以形成溶液(即，清液)；和(4)通過柱層析從蛋清中分離重組蛋白。再一方面，本發(fā)明的特征在于一種過濾酸化的蛋清的方法，包括以下步驟：(1)使電導率在約8mS/cm和約20mS/cm之間的預處理緩沖液通過過濾器；和(2)使pH為約5至約6.5的蛋清通過所述過濾器得到過濾的蛋清。具體實施方案可以包括一個或者多個下述特征。所述酸化劑選自由乙酸、鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、氫氟酸、氫溴酸、高氯酸、檸檬酸、硼酸、酒石酸、乳酸、甲酸、草酸、尿酸和巴比妥酸構成的組。所述酸性緩沖液可以進一步包括約5M至約6M(例如，約5.7M)的醋酸鈉。每千克蛋清中，所述酸性緩沖液的質(zhì)量分數(shù)為約0.5wt％-約2wt％(例如，約0.7wt％-約1.5wt％、約0.9wt％-約1.4wt％、或約1.2wt％-約1.3wt％)。所述酸性緩沖液的pH值為約4至約6.5(例如，約4、約4.5、約5、約5.5、約6.0或者約6.5)。在將所述酸性緩沖液與所述蛋清混合之后，所述混合的蛋清的pH可以是約5至約6.5。在一些實施方案中，所述混合的蛋清的pH是約5至約6.3(例如，約5.7至約6.3、約5.8至約6.2、約5.9至約6.1、或者約6)。在一些實施方案中，所述混合的蛋清的pH是使所述混合的蛋清粘度最低的值。所述蛋清可以混合至少約1h和/或在約2℃至約25℃的溫度下混合。所述蛋清池的體積至少約10L(例如，至少約50L)。可以單次大劑量注射和/或至少約1L/min的速率將所述酸性緩沖液加入到所述蛋清池中。向所述蛋清池中加入所述酸性緩沖液和混合所述蛋清可以同時進行。所述方法可以進一步包括允許所述混合的蛋清沉降的步驟，以使所述蛋清分離成上層、中間層和下層。在這樣的實施方案中，所述方法可以進一步包括分離所述中間層的步驟。在一些實施方案中，所述方法可以進一步包括在分離步驟之后過濾所述中間層。所述過濾可以包括使所述中間層的至少一部分(例如，全部)通過平均孔徑在約0.1μm至約100μm的過濾器。在一些實施方案中，所述過濾可以包括使所述中間層的至少一部分通過多個過濾器。所述方法進一步包括過濾所述混合的蛋清，而不允許所述混合的蛋清沉降。在這樣的實施方案中，所述過濾步驟可以包括通過平均孔徑為約0.1μm至約100μm的過濾器過濾所述混合的蛋清。在一些實施方案中，在初始過濾所述混合的蛋清后，所述過濾步驟可以包括1個或者多個后續(xù)過濾步驟，所述一個或者多個后續(xù)過濾步驟使用平均孔徑為約0.1μm至約40μm的一個或者多個過濾器。所述方法進一步包括在混合步驟之后的離心分離步驟，其中將所述混合的蛋清離心，以將含有卵粘蛋白(ovomucin)-溶菌酶復合物的沉淀物與上清液分離。所述蛋清可以包括對蛋清外源的重組治療性蛋白。所述酸性緩沖液的電導率可以是約8mS/cm至約40mS/cm。在每千克所述蛋清中所述酸性緩沖液的質(zhì)量分數(shù)為約0.5wt％至約5wt％。預處理緩沖液可以用于準備用于濾過酸化的蛋清的過濾器。所述預處理緩沖液可以具有與所述蛋清的pH基本相似或者相同的pH，范圍是約5.0至約6.5。例如，所述預處理緩沖液的pH可為約5.9至約6.1(例如，約6)。所述預處理緩沖液可以包括磷酸鈉和氯化鈉。所述預處理緩沖液的電導率可為約10mS/cm至約20mS/cm。所述酸化的蛋清的電導率可為約8mS/cm至約20mS/cm。所述過濾器的過濾介質(zhì)面積可為至少約8m2。所述過濾器的平均孔徑可為約0.1μm至約100μm。所述蛋清可以在壓力差小于約30psi(例如，小于約15psi)時通過所述過濾器。所述實施方案具有以下優(yōu)點。通常，用于從蛋清中分離/純化外源蛋白質(zhì)的層析柱是非常昂貴的，這可能是在商業(yè)和工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)來自蛋清中的重組蛋白的關鍵限制因素之一。因為僅使用少量的酸性緩沖液來獲得酸化的蛋清，用于獲得純化的治療性蛋白的所述酸化的蛋清的量顯著減少(即，比常規(guī)稀釋法少至少3-4倍)。因此，隨后將所述酸化的蛋清裝到柱子中消耗的時間也明顯減少，這允許在工業(yè)過程中快速生產(chǎn)蛋白質(zhì)。此外，因為在所述蛋清制備和分離/純化過程中，一些治療性蛋白對所暴露的環(huán)境敏感，通過減少樣品體積使在制備和分離/純化過程中花費的時間最小化，對通常涉及蛋清體積為500L或者更多的商業(yè)生產(chǎn)是非常有利的?？傊ㄟ^使用本文所述的方法，可以極大地使處理的時間、材料、勞力降低到最小。從說明書和附圖以及從權利要求中，其它特征，目的和優(yōu)點將是顯而易見的。具體實施方案本發(fā)明涉及制備蛋清(例如，從轉(zhuǎn)基因雞所產(chǎn)下的蛋中取得)的有效方法，以用于從蛋清中批量層析分離蛋白質(zhì)(例如，重組蛋白)，以及從所述蛋清中分離蛋白質(zhì)的方法。本文所述的方法制備的蛋清一般是適于批量層析處理的均勻的、低粘度的溶液。在一些實施方案中，用作本文所述的方法的起始物質(zhì)的蛋清可以包括蛋清外源的重組蛋白(例如，重組治療性蛋白)。示例性的重組蛋白包括細胞因子，比如GC-SF、GM-CSF、紅細胞生成素和干擾素(如干擾素-α或者干擾素-β)；人溶酶體酶；免疫球蛋白(例如，抗體)和結構蛋白?？梢詮呐繉游鎏幚碇蟹蛛x的其它示例性的重組蛋白已經(jīng)在例如美國申請公開號2009/0299037中描述。通常，本文所述的制備蛋清的方法包括(1)將適量含有酸化劑的酸性緩沖液(例如，占每千克所述蛋清的質(zhì)量分數(shù)約0.5wt％至約5wt％)加入到蛋清池(例如，至少約10L的體積)；和(2)將所述酸性緩沖液和所述蛋清混合，以形成具有合適pH(例如，pH范圍約5至約6.5)的混合的蛋清。通常，本文所述方法中使用的蛋清池具有工業(yè)規(guī)模并且體積相對較大。例如，所述蛋清池可以具有至少10L(例如，至少約50L、至少約100L、至少約200L、至少約300L、至少約400L、至少約500L、至少約600L、至少約700L、至少約800L、至少約900L、至少約1000L、至少約1500L、至少約2000L、至少約3000L、至少約4000L、至少約5000L、至少約10000L或者至少約20000L)的體積。制備蛋清作為起始物質(zhì)用于本文所述的方法中，該制備蛋清的方法已經(jīng)在例如美國申請公開號2009/0299037中描述。在所述酸性緩沖液中的酸化劑通常可以是任意合適的酸(例如，有機酸或者無機酸)。示例性的酸化劑包括乙酸、鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、氫氟酸、氫溴酸、高氯酸、檸檬酸、硼酸、酒石酸、乳酸、甲酸、草酸、尿酸和巴比妥酸。在一些實施方案中，2種或者多種(例如，3種或者4種)酸的組合可以用作所述酸性緩沖液中的酸化劑。在一些實施方案中，所述酸性緩沖液可以包括一種或多種鹽(例如，堿性鹽)。這種鹽的例子可以是醋酸鈉。在一些實施方案中，在所述酸性緩沖液中使用的鹽可以是在所述酸性緩沖液中使用的酸化劑的鹽。在其它實施方案中，在酸性緩沖液中使用的鹽可以是與所述酸性緩沖液中使用的酸化劑不同的酸的鹽。在一些實施方案中，所述酸性緩沖液可以包括約5M至約6M(例如，約5.7M)的鹽(例如，醋酸鈉)。不希望受到理論的束縛，據(jù)信使用這種濃度的鹽可以產(chǎn)生具有適量的緩沖含量(bufferingcontent)的酸性緩沖液。如果緩沖含量太高，所述酸性緩沖液可能會變得易燃和/或具有腐蝕性，使得所述緩沖液不能安全地維持、處理、和/或儲存。如果緩沖含量太低，可能需要大量體積的酸性緩沖液將所述蛋清的pH值調(diào)節(jié)至目標值，從而降低了所述蛋清制備過程以及下游的(downstream)蛋白質(zhì)分離/純化過程的效率。通常，在所述酸性緩沖液中使用的酸化劑和鹽的量根據(jù)所述酸性緩沖液的所需pH而不同。在一些實施方案中，所述酸性緩沖液的pH為約4至約6.5(例如，約4至約5或者約4至約4.5)。例如，所述酸性緩沖液的pH為約4或pH為約4.5。所述酸性緩沖液可以通過本領域已知的任意合適的方法制成。例如，所述酸性緩沖液可以通過將酸化劑加入含堿溶液，以將所述溶液的pH值調(diào)節(jié)到所需值而形成。例如，可以將冰醋酸溶液加入適量的NaOH中，得到含有5.7M醋酸鈉的酸性緩沖液。通常，相對于所述蛋清，所述酸性緩沖液的量是少的。例如，每千克所述蛋清中，所述酸性緩沖液的量為約0.5wt％至約5wt％(例如，約0.5wt％至約2wt％、約0.7wt％至約1.5wt％、約0.9wt％至約1.4wt％、約1wt％至約1.4wt％或約1.1wt％至約1.3wt％)。通常，由于沒有預期到加入少量的酸性緩沖液會有效地將所述蛋清的pH值調(diào)節(jié)到目標值，制備適于批量層析處理的均勻的、低粘度的蛋清需要加入體積為所述蛋清體積的2-5倍(即200％至500％)的酸性緩沖液，。由于在所述蛋清制備過程中使用的層析柱和其它制備設備的尺寸限制，這種方法在大型生產(chǎn)規(guī)模上是不經(jīng)濟實用或可行的。意想不到地是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過加入與所述蛋清的量相比而言少量的酸性緩沖液(例如，每千克所述蛋清至多約5wt％)可以得到適于批量層析處理的均勻的、低粘度的蛋清，從而顯著地減少了在層析分離過程中使用的柱的數(shù)量、這些方法中使用的其他設備的尺寸、以及從所述蛋清中分離重組蛋白的成本和時間。不希望受到理論的束縛，據(jù)信與所述蛋清的量相比，加入相對較少的量的酸性緩沖液的另外的優(yōu)點包括(1)可以忽略不計的蛋清稀釋，(2)電導率上基本不改變，允許卵粘蛋白-溶酶菌復合物從蛋清中析出，轉(zhuǎn)而降低了所述蛋清在較低的pH范圍(例如，pH5至6.5)下的粘度，并且有助于在過濾和層析處理期間從所述蛋清中分離不想要的物質(zhì)，以及(3)使在粘蛋清中低pH袋(pHpocket)的形成最小化，所述pH袋可能損壞重組蛋白或者導致所述蛋清物質(zhì)的pH不均勻。通常，所述酸性緩沖液的電導率范圍在約8mS/cm至約40mS/cm。例如，所述酸性緩沖液具有至少約8mS/cm(例如，至少約9mS/cm、至少約10mS/cm、至少約11mS/cm、至少約12mS/cm、至少約13mS/cm、至少約14mS/cm、至少約15mS/cm、至少約16mS/cm、至少約17mS/cm、至少約18mS/cm、至少約19mS/cm、至少約20mS/cm、至少約21mS/cm、至少約22mS/cm、至少約23mS/cm、至少約24mS/cm、至少約25mS/cm)和/或至多約40mS/cm(例如，至多約39mS/cm、至多約38mS/cm、至多約37mS/cm、至多約36mS/cm、至多約35mS/cm、至多約34mS/cm、至多約33mS/cm、至多約32mS/cm、至多約31mS/cm、至多約30mS/cm、至多約29mS/cm、至多約28mS/cm、至多約27mS/cm、至多約26mS/cm、至多約25mS/cm)的電導率。例如，所述酸性緩沖液可以具有在約8mS/cm和約40mS/cm之間的任意值的電導率。不希望受到理論的束縛，據(jù)信使用電導率在約8mS/cm至約40mS/cm的酸性緩沖液會使所述混合的蛋清的電導率的變化最小化，以使該方法可以用下游蛋白質(zhì)分離步驟實施和簡化(streamline)，而不改變在分離步驟使用的柱層析的分離條件并且不會引起進一步的沉淀和聚集。在一些實施方案中，可以單次大劑量注射的方式將所述酸性緩沖液加入到蛋清池中。在一些實施方案中，用合適的注射速率(例如，至少約1L/min)進行單次大劑量注射，以確保在合適的時間內(nèi)(例如，至多約5min)添加所述酸性緩沖液。不希望受到理論的束縛，據(jù)信使用單次大劑量注射的優(yōu)點包括：(1)形成在重力作用下易于沉降的相對大的絮凝物，從而降低對大過濾器的需求，以及(2)避免對粘性蛋清池的連續(xù)滴定的需要，其可能會導致錯誤的pH讀數(shù)而引發(fā)酸或堿的重復添加，進而可能損壞在所述蛋清中的重組蛋白并且提高了所產(chǎn)生的蛋清溶液的濁度。在一些實施方案中，在將所述酸性緩沖液加入到所述蛋清池后，所述蛋清在適宜的溫度(例如，約2℃至約25℃)下混合合適的時間(例如，至少約1h)以形成具有合適pH的混合的蛋清。在一些實施方案中，所述酸性緩沖液的加入和所述蛋清的混合可以同時進行。通常，所述酸性緩沖液的加入和所述酸性緩沖液與所述蛋清的混合會導致大量的沉淀物(例如，卵粘蛋白-溶酶菌復合物)的形成。所述沉淀物通常會降低留在所述溶液中蛋清的粘度。在一些實施方案中，所述混合的蛋清的pH是使混合的蛋清粘度最低的值。例如，所述混合的蛋清可以具有至少約5(例如，至少約5.2、至少約5.4、至少約5.6、至少約5.7、至少約5.8或者至少約5.9)和/或至多約6.5(例如，至多約6.3、至多約6.2或者至多約6.1)的pH。在一些實施方案中，所述混合的蛋清的pH約6。不希望受到理論的束縛，據(jù)信這樣的pH(例如，約6)可以允許在重力作用下形成最大量的來自蛋清沉降的沉淀物，從而減少對過濾的需要并且有利于形成均勻的、低粘度的蛋清溶液。通常，所述混合的蛋清(即，酸化的或者經(jīng)pH調(diào)節(jié)的蛋清)具有相對低的電導率(例如，與未經(jīng)酸性緩沖液處理的蛋清的電導率類似)。例如，所述混合的蛋清的電導率至少約8mS/cm(例如，至少約8.2mS/cm、至少約8.4mS/cm、至少約8.6mS/cm、至少約8.8mS/cm、至少約9mS/cm、至少約9.2mS/cm、至少約9.4mS/cm、至少約9.6mS/cm、至少約9.8mS/cm、至少約10mS/cm、至少約11mS/cm、至少約12mS/cm、至少約13mS/cm或至少約14mS/cm)和/或至多約20mS/cm(例如，至多約19mS/cm、至多約18mS/cm、至多約17mS/cm、至多約16mS/cm、至多約15mS/cm、至多約14mS/cm、至多約13mS/cm、至多約12mS/cm、至多約11.8mS/cm、至多約11.6mS/cm、至多約11.4mS/cm、至多約11.2mS/cm、至多約11mS/cm、至多約10.8mS/cm、至多約10.6mS/cm、至多約10.4mS/cm、至多約10.2mS/cm或者至多約10mS/cm)。例如，所述混合的蛋清的電導率可以為約8mS/cm至約20mS/cm中的任意值。不希望受到理論的束縛，據(jù)信將所述混合的蛋清的電導率保持在約8mS/cm至約20mS/cm，這將允許所述混合的蛋清符合下游蛋白質(zhì)分離步驟的條件，從而所述混合的蛋清可以一致地用于所述分離步驟，而不改變在該步驟中使用的柱層析的分離條件。混合完成之后，本文所述的方法可以包括允許所述混合的蛋清沉淀合適的時間(例如，至少約6h)的可選步驟，以使所述蛋清分離為上層、中間層和下層。通常，所述上層包括某些較低密度的不需要的物質(zhì)(例如，變性蛋白質(zhì)以及包括磷脂、甘油三酯和膽固醇的泡沫脂質(zhì))，所述下層包括蛋清蛋白形成的沉淀物(例如，卵粘蛋白-溶酶菌復合物)，并且所述中間層包括相對澄清的蛋清溶液。在一些實施方案中，在所述沉淀步驟期間，如果所述混合的蛋清的pH落在所需值(例如，5.7±0.1、6.0±0.1或者6.3±0.1)之外，通過使用酸(例如，上述的酸性緩沖液)或者堿(例如，5.7M醋酸鈉或者1N氫氧化鈉溶液)調(diào)節(jié)所述混合的蛋清的pH值到所需的值。在這樣的實施方案中，pH調(diào)節(jié)后可以在室溫下另外進行混合(例如，至少約1h)和沉降(例如，至少約3h)。通常，總的混合和沉降時間不超過24h，以使所述蛋清中外源蛋白質(zhì)暴露于處理環(huán)境的時間最小化，從而保持這些蛋白質(zhì)的生物學活性。在一些實施方案中，本文所述的方法可以在沉降步驟之后包括從所述混合的蛋清中分離中間層的步驟。通常，所述中間層可以使用本領域已知的方法分離。例如，可以通過將管(例如，金屬或聚碳酸酯管)插入中間層(優(yōu)選在中間層的中心)，將中間層從含有混合的蛋清的容器中虹吸出來，從而可將中間層的內(nèi)容物(content)泵送到接收容器中而不干擾上層和下層。通常，分離所述中間層之后，可以過濾所述中間層的至少一部分(例如，所有的中間層)，以除去懸浮在所述中間層的任意顆粒，以獲得均勻的、低粘度、澄清的蛋清溶液。這個步驟也可以稱為蛋清提純(clarification)。在一些實施方案中，所述中間層可以通過一個或多個平均孔徑至多約100μm的過濾器過濾(例如，至多約90μm、至多約80μm、至多約70μm、至多約60μm、至多約50μm、至多約40μm、至多約30μm、至多約20μm、至多約10μm、至多約9μm、至多約8μm、至多約7μm、至多約6μm、至多約5μm、至多約4μm、至多約3μm、至多約2μm或者至多約1μm)和/或至少約0.1μm(例如，至少約0.2μm、至少約0.3μm、至少約0.4μm、至少約0.5μm、至少約0.6μm、至少約0.7μm、至少約0.8μm、至少約0.9μm、至少約1μm、至少約2μm或者至少約3μm)。例如，過濾器可具有約0.1μm至約100μm(例如，約0.1μm至約40μm、約40μm至約100μm、約3μm至約6μm、或約0.1μm至約0.3μm)的平均孔徑。在一些實施方案中，可以通過彼此串聯(lián)連接的多個過濾器過濾中間層，其中過濾器的平均孔徑依次減小。例如，可通過包含三個串聯(lián)連接的過濾器的過濾系統(tǒng)過濾中間層，其中，第一過濾器可具有約40μm的平均孔徑，第二過濾器可具有約3μm至約6μm的平均孔徑，并且第三過濾器可具有約0.1μm至約0.3μm的平均孔徑。這種過濾系統(tǒng)的一個例子是包括從Pall公司商購的連續(xù)深層過濾器(例如，包括T2600、K200P和Bio10深層過濾器)的系統(tǒng)。任選地，所述過濾系統(tǒng)可以進一步包括在第三過濾器下游的第四過濾器(例如，具有約0.2μm的平均孔徑)。第四過濾器的一個例子是得自Sartorius公司的SartobranP過濾器。在一些實施方案中，用于過濾所述中間層的過濾器可具有大的過濾介質(zhì)面積。例如，所述過濾器可以具有至少約1m2(例如，至少約2m2、至少約4m2、至少約6m2或至少約8m2)的過濾介質(zhì)面積。在一些實施方案中，在將所述酸性緩沖液和所述蛋清混合以形成混合的蛋清之后，可以過濾所述混合的蛋清，而不需要使所述混合的蛋清中的沉淀物沉淀。在這樣的實施方案中，可以過濾所述混合的蛋清(包括在添加/混合步驟期間形成的沉淀物和剩余的蛋清溶液)，而不用預先從所述混合的蛋清中分離沉淀物。例如，在所述酸性緩沖液和所述蛋清混合后，可以通過使用本文所述的一種或多種過濾器(例如，包括具有孔徑依次減小的三個串聯(lián)連接的過濾器的過濾系統(tǒng))過濾所述混合的蛋清而不沉淀。不希望受到理論束縛，據(jù)信通過減少沉淀步驟，這種方法可以顯著地減少制備用于批量層析處理的蛋清和用于從蛋清中分離蛋白質(zhì)的時間和成本。在一些實施方案中，在將所述酸性緩沖液和所述蛋清混合以形成混合的蛋清之后，可以將所述混合的蛋清離心，以從上清液中分離沉淀物(例如，卵粘蛋白-溶菌酶復合物)。然后可以通過使用本文所述的一種或多種過濾器過濾由此得到的上清液。通常，所述過濾的蛋清溶液可以用于通過使用柱層析分離重組蛋白，比如離子交換層析或基于疏水相互作用的層析。這種層析方法的例子已在例如美國申請公開號2009/0299037中描述。在一些實施方案中，本發(fā)明的特征在于從蛋清中分離重組蛋白的方法。例如，這樣的方法可以包括以下步驟：(1)提供含有重組蛋白的蛋清池，所述池具有至少約10升的體積；(2)將所述蛋清的pH調(diào)節(jié)至約5至約6.5，其中所述經(jīng)pH調(diào)節(jié)的蛋清的電導率為約8mS/cm至約20mS/cm；(3)過濾所述蛋清以形成溶液；以及(4)通過柱層析法分離所述蛋清中的重組蛋白。所述調(diào)節(jié)步驟可以通過與上述相同的方式向所述蛋清中加入少量的酸性緩沖液(例如，每千克蛋清約0.5wt％至約5wt％)來進行。過濾和分離步驟可以通過本文所述的方法或本領域已知的方法進行。在一些實施方案中，本發(fā)明的特征在于過濾酸化的蛋清(例如，通過上述酸性緩沖液酸化的蛋清)的方法。例如，這樣的方法可以包括以下步驟：(1)使電導率在約8mS/cm和約20mS/cm之間的預處理緩沖液通過過濾器；和(2)使pH為約5至約6.5的蛋清(例如，具有至少約50L的體積)通過所述過濾器以獲得過濾的蛋清。然后，可以通過柱層析法將過濾的蛋清用于分離重組蛋白。在一些實施方案中，在這些方法中使用的過濾器可以與上述那些過濾器類似或相同。例如，所述過濾器可以具有與上述那些過濾器相同的平均孔徑(例如，約0.1μm至約100μm)或過濾介質(zhì)面積(例如至少約8m2)。在一些實施方案中，所述預處理緩沖液可用于使所述蛋清(例如酸化的蛋清)通過過濾器之前潤濕過濾器。所述預處理緩沖液可以包括一種或多種鹽(例如堿性鹽)。示例性鹽包括磷酸鈉和氯化鈉。在一些實施方案中，所述預處理緩沖液可以包括磷酸鈉和氯化鈉的組合。通常，所述預處理緩沖液可以包括酸。示例性酸包括乙酸、鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、氫氟酸、氫溴酸、高氯酸、檸檬酸、硼酸、酒石酸、乳酸、甲酸、草酸、尿酸和巴比妥酸。在一些實施方案中，兩種或更多種(例如，三種或四種)酸的組合可以用于所述預處理緩沖液中。在一些實施方案中，所述預處理緩沖液可以具有與所述蛋清的pH基本上相同的pH。例如，所述預處理緩沖液可以具有至少約5(例如，至少約5.2、至少約5.4、至少約5.6、至少約5.7、至少約5.8或至少約5.9)的pH和/或至多約6.5(例如，至多約6.4、至多約6.3、至多約6.2或至多約6.1)。在一些實施方案中，所述預處理緩沖液可具有約6的pH。不希望受到理論的束縛，據(jù)信，使用具有與所述蛋清的pH基本上相同的pH的預處理緩沖液來處理過濾器，可以將過濾器表面的pH調(diào)節(jié)至與所述蛋清的pH類似，從而使過濾期間蛋清的沉淀最小化，過濾期間蛋清的沉淀可能導致過濾器阻塞或阻礙樣品的流動而在過濾器上引起剪切應力的，從而嚴重縮短所述過濾器的使用壽命。通常，所述預處理緩沖液可以具有與所述蛋清的電導率相容的電導率，從而使所述過濾的酸化的蛋清與在下游分離/純化過程中使用的柱層析(例如，離子交換層析)的特性相容。例如，所述預處理緩沖液的電導率可以為至少約8mS/cm(例如，至少約9mS/cm、至少約10mS/cm、至少約11mS/cm、至少約12mS/cm、至少約13mS/cm、至少約14mS/cm、至少約15mS/cm、至少約16mS/cm、至少約17mS/cm、至少約18mS/cm)，和/或至多約20mS/cm(例如，至多約19mS/cm、至多約18mS/cm、至多約17mS/cm、至多約16mS/cm、約15mS/cm、至多約14mS/cm、至多約13mS/cm、至多約12mS/cm或至多約11mS/cm)。例如，所述預處理緩沖液的電導率可以是在約8mS/cm和約20mS/cm之間的任意值。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用未經(jīng)上述預處理緩沖液處理的過濾器來過濾蛋清溶液將導致過濾器被過濾過程中形成的沉淀物快速堵塞。另一方面，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，使用具有上述電導率的預處理緩沖液處理過濾器，可以調(diào)節(jié)過濾器表面的電導率使其與所述蛋清的電導率相似，從而使過濾期間所述蛋清的沉淀最小化并顯著提高所述過濾器的使用壽命。在一些實施方案中，所述蛋清可以在相對小的差壓(例如，小于約30psi、小于約25psi、小于約20psi、小于約15psi、小于約12psipsi、小于約10psi或小于約5psi)下通過過濾器。不希望受到理論的束縛，由于過濾器可能非常昂貴，據(jù)信在相對小的壓差下使所述蛋清通過過濾器可以將對過濾器的損壞和/或阻塞最小化，從而降低產(chǎn)品成本。本文引用的所有出版物(例如，專利，專利申請出版物和文章)的內(nèi)容通過引用的方式將其整體并入本文中。以下實施例僅用于說明，而不用于限制。實施例1：制備用于具有沉淀步驟的批量層析處理的蛋清的方法將儲存在-20℃下、在4LNalgene瓶中的50至400千克冷凍蛋清在室溫下在設定在21±1℃的水浴中解凍約5至7小時。將每個瓶從水浴中每小時取出一次，目視檢查以確定解凍程度，反復顛倒并放回水浴中直到完全解凍。將已解凍的瓶子從水浴中取出，并在2至8℃下儲存。在最后一瓶蛋清解凍后，將瓶中的蛋清匯集到頂部敞口的混合容器中。在pH4.0下，將含有5.7M醋酸鈉(相對于蛋清的重量為約1.3％wt/wt)的酸性緩沖液以1千克/分鐘的速度加入到解凍的蛋清池中，確保加入酸性緩沖液的持續(xù)時間不超過5分鐘，從而在2至8℃得到最終目的pH6.0±0.1。在無溫度控制的頂部敞口的混合容器中連續(xù)攪拌蛋清混合物1小時，然后倒入密閉的一次性(singleuse)混合器中，在2至8℃冷藏，并混合6小時。在混合停止后，使沉淀物沉降6小時。根據(jù)需要，在2至8℃下使用5.7M醋酸鈉或1N氫氧化鈉進一步將pH調(diào)節(jié)至6.0±0.1，隨后再混合1小時，并在室溫下沉降3小時(混合和沉降的總時間不超過24小時)。在沉降完成后，所述混合的蛋清形成三層，即上層，中間層和下層。然后將管置于中間層中，并通過管將中間層虹吸或泵出而不干擾上層和下層。過濾器用每平方米過濾面積80升純凈水預先清洗(依次分別為40微米、3至6微米、0.1至0.3微米的Pall公司深層過濾器)以除去全部的有機碳、可過濾物和可提取物，然后排水。然后將預先清洗的過濾器用1個過濾器滯留體積的pH為6.0的含有20mM磷酸鈉和140mM氯化鈉的預處理緩沖液處理，然后排水。將蛋清溶液倒出，避開沉降的沉淀物和聚集的蛋清顆粒；并通過死端(deadend)過濾法以每種過濾器類型(filtertype)1升/平方米的流速過濾或小于30psid的壓差過濾，以除去任何未沉降的沉淀物質(zhì)并收集到無菌一次性混合器中。在蛋清過濾完成時，用1個過濾器滯留體積的pH為6.0的含有20mM磷酸鈉和140mM氯化鈉的pH6.0的預處理緩沖液清洗過濾系統(tǒng)中保留的蛋清，從而回收產(chǎn)物并將其收集在無菌一次性混合器中。對所述過濾的蛋清溶液取樣以用于酶活性和紫外(UV)吸光度的測量，并在2至8℃下儲存至多24小時，然后通過柱層析法分離蛋清中的重組蛋白。表1顯示了通過使用上述酸性緩沖液(即5.7MNaOAc、pH4.0和1.3％wt/wt)的蛋清酸化的結果。表1實施例2：沒有沉降步驟的制備用于批量層析處理的蛋清的方法在約24至72小時的時間內(nèi)，在2至8℃下(在步入式冷室中)解凍400千克(+/-10％)的冷凍蛋清(-20℃)。將解凍的蛋清匯集到夾套式單次使用的密閉混合容器中并且溫度保持在2至8℃。將pH為4.0的含有5.7M醋酸鈉(1.08％wt/wt)的酸性緩沖液以1千克/分鐘的速率加入到解凍的蛋清中，確保加入所述酸性緩沖液的持續(xù)時間不超過5分鐘，以獲得最終目的pH6.0±0.5。將酸化的蛋清溶液在2至8℃下連續(xù)攪拌3小時。然后在過濾之前，將酸化的蛋清通過夾套罐加熱至21±3℃。過濾器用每平方米過濾面積80升的純凈水預先清洗過濾器(依次分別為40微米、3至6微米、0.1至0.3微米的Pall公司的深層過濾器)以除去全部有機碳、可過濾物和可提取物。用pH為6.0的含有20mM磷酸鈉和140mM氯化鈉的預處理緩沖液置換過濾器系列(filtertrain)中的純凈水，直到過濾器流出物的電導率在預處理緩沖液可接受的電導率范圍內(nèi)(例如10至15mS/cm)。以1升/分鐘/平方米/每種過濾器的流速、或在導致差壓≤10psi的條件下，將均勻混合的酸化的蛋清通過死端過濾，以除去任何沉淀的或聚集的物質(zhì)。使用體積相當于過濾器系列滯留體積的80％的初始過濾器流出物來置換預處理緩沖液，并在產(chǎn)物收集之前丟棄。將剩余的已過濾的預處理緩沖液和蛋清收集到無菌一次性混合器中。在蛋白過濾完成時，將過濾系統(tǒng)中保留的蛋清用1.5個過濾器系列滯留體積(當1個滯留體積保留在過濾器系列中時，收集0.5個滯留體積)pH為6.0的含有20mM磷酸鈉和140mM氯化鈉的預處理緩沖液沖洗，從而回收產(chǎn)物并將其收集在所述無菌一次性混合器中。對過濾的蛋清進行取樣以測量酶活性和吸光度，并在2至8℃下儲存至多24小時，然后通過柱層析法分離蛋清中的重組蛋白。實施例3：縮減蛋清制備工藝的規(guī)模，以評估直接裝樣對深層過濾性能和蛋清酸化的魯棒性的影響原料用于提純研究的所有化學品均為USP/MC級。蛋清源材料在表2中列出。所有源材料在使用前儲存在-20℃下并在2至8℃下解凍48至72小時。匯集源材料并將其保持在2至8℃直到酸化步驟。表2：蛋清源材料實驗蛋清等分試樣(L)滴度(g/L)*接合性(Zygosity)1200.77同源2201.02同源3200.79同源*基于酶活性對于所有緩沖液制備，在溫度補償至25℃的條件下，用pH/電導率計進行電導率測量。在20℃下測量緩沖液的pH。該過程中緩沖液制備配方在下表3中列出。表3：緩沖液配方處理設備GEhealthcare公司為Processskids(AKTAExplorers)提供服務(定期維修)。在整個特性研究期間，SynagevaPD人員維護工藝設備(PallStax底盤(Chassis)和AKTAExplorers)。下表4列出了本實施例中使用的所有硬件設備。表4：設備列表使用表5所列的以下配置的STAX深層過濾器(40μm、3-6μm和0.1-0.3μm)和另外的SartobranP0.2μm過濾器來設置PallSTAX底盤(PN#SXLSC02W)。底盤#1：(底部)歧管→T2600→通氣板(頂部)底盤#2：(底部)歧管→K200P→通氣板→歧管→Bio10→通氣板(頂部)將每個過濾器夾在1.5“入口/出口歧管(P/N：7008225)和頂部排氣板之間。在初次水沖洗期間，根據(jù)經(jīng)驗來確定每個過濾器的滯留體積。表5：深層過濾設備柱XK16/20(GEHealthcare公司)用作所有苯基疏水相互作用層析(PHIC)柱的填料。所有層析在裝有Unicorn軟件版本5.31(GEHealthcare公司)的AKTAExplorer上進行。步驟在開始提純步驟之前，將冷凍的蛋清等分試樣(總共20L)在2至8℃下解凍48至72小時。將解凍的蛋清匯集到具有無菌介質(zhì)襯墊(ThermoScientific/HycloneP/N343050-0005)的適當大小的聚丙烯罐(25L)中。在2至8℃下，使用頂置式混合器(330rpm)將匯集的蛋清混合至均勻。然后通過加入pH為4.0的5.7M醋酸鈉將混合的蛋清調(diào)節(jié)至目的pH。表6列出了為實現(xiàn)目的pH進行的每次提純實驗中加入的5.7M醋酸鈉的體積。監(jiān)測pH超過2小時以確保達到目的pH。表6：匯集的蛋清酸化在過濾之前，用過濾的RO/DI水以80L/m2單獨沖洗過濾器。在水沖洗期間，每個過濾器的滯留體積根據(jù)經(jīng)驗確定。在水沖洗完成后，將過濾器連接到連續(xù)的系列中并用16L/m2的PHIC平衡緩沖液(20mM磷酸鈉、140mM氯化鈉、pH6.0)沖洗。當流出物的pH和電導率滿足沖洗緩沖液規(guī)格(例如，pH6.0±0.1，電導率16.0±2.0)時，緩沖液沖洗結束。使用3/8”浸管(I/P73管Cole)以1.0L/min連續(xù)混合(頂置式混合器，300rpm)的方式將混合的蛋清裝入到過濾器系列上。收集80％的測量的累積滯留體積(～13.2L)并引至廢物。然后將濾液收集在單獨的適當大小的容器中，直到凝結的低密度沉淀物進入浸漬管。然后用1.5倍滯留體積(～25L)平衡緩沖液沖洗過濾器系列。使用干凈的罐槳(tankpaddle)將最終濾液充分混合以確保在上樣之前的均勻性。在PHIC分離之前，濾液在2至8℃下儲存過夜。在PHIC分離之前，使用室溫條件的水浴加熱在2至8℃下儲存的濾液。將濾液通過Sartobran150柱(0.45um/0.22um，P/N5231307H4-00)二次過濾，以產(chǎn)生最終的PHIC負荷。表7列出了所使用的緩沖液和過程中的參數(shù)。表7：PHIC層析單元操作步驟結果與討論(1)直接裝樣酸化的蛋清(即，沒有沉降步驟)最初，進行單中心點運行(“實驗1”；1:20規(guī)模；pH約6的20L酸化的蛋清)以評價直接裝樣(無沉降，20L/m2的裝樣比)，對深層過濾性能建立代表性的實驗模型。對于每個過濾器(即，T2600，K200P，Bio10)，雖然過濾器入口的進料壓力在酸化的蛋清裝樣的過程中確實線性增加，但是壓差不超過10psid。此外，在緩沖液沖洗期間，進料壓力沒有進一步增加，并且在過濾器T2600中表現(xiàn)出顯著的降低。這些結果表明，在實驗期間，直接裝入到過濾器的酸化的蛋清沒有明顯阻塞所述過濾器。蛋白回收結果總結在下表8中。如表8所示，提純步驟后的蛋白回收率達到目標預期(>70％)。表8：提純后的蛋白回收*基于酶活性實驗1的PHIC柱性能與包括酸化的蛋清沉降步驟的實驗獲得的結果相當。此外，通過使用4至20％三羥甲基氨基甲烷(Tris)-甘氨酸凝膠的SDS-PAGE檢驗來測量蛋白純度。當與包括沉降步驟的實驗相比時，來自實驗1的PHIC洗脫部分沒有在條帶圖案中顯示任何差異。這些數(shù)據(jù)表明，在提純(即過濾)期間將酸化的蛋清直接裝樣在產(chǎn)量和純度方面不影響蛋白回收率或PHIC性能。上述結果表明在提純步驟期間可以將酸化的蛋清直接裝樣到過濾器中，而不經(jīng)過沉降步驟。然后將該方法應用于下一部分中描述的魯棒性研究實驗(即實驗2和3)。(2)蛋清酸化的魯棒性使用2-因子、2-水平實驗設計(高/低、低/高)來評估蛋清酸化步驟的魯棒性。實驗條件如表6所述。在實驗2中，進行酸化24小時以達到5.67的最終pH(即約5.7)。在實驗3中，進行酸化6小時以達到6.25的最終pH(即約6.3)。結果顯示，由于T2600結垢增加，兩個實驗表現(xiàn)出相當?shù)木€性進料壓力增加和相當?shù)淖畲筮M料壓力。在實驗2中觀察到較低的最大進料壓力，據(jù)信這是由于蛋清pH和蛋清粘度(即，較低的蛋清pH導致較低的蛋清粘度)之間的相互關系。在任何情況下，進料壓力都不超過10psig，示出了與實驗1相當?shù)男阅?。在提純步驟之后，實驗2和3蛋白回收率分別為71％和83％，滿足目標預期(即≥70％)并且與實驗1(即79％)相當。在PHIC分離后，實驗2和3中的蛋白產(chǎn)率分別為59％和68％，與包括沉降步驟的實驗獲得的結果相當。將實驗2和3均與實驗1比較的層析譜覆蓋圖證實了可比的柱性能。上述結果表明酸化pH和時間的變化不會導致相對于酶活性或產(chǎn)率的任何明顯的負面影響。因此，當提純步驟在兩個測試范圍內(nèi)(即酸化pH5.7至6.3，酸化時間6至24小時)進行時是具有魯棒性的。(3)工藝中蛋清的穩(wěn)定性進行工藝保持(Processhold)研究以限定以下三個單元操作待檢點(holdpoint)的最大保持時間(holdtime)：(1)解凍的蛋清(2至8℃)，(2)酸化的蛋清(2至8℃和室溫)，和(3)提純的蛋清(2至8℃和室溫)。在72至96小時的時間段內(nèi)評價產(chǎn)物的穩(wěn)定性(在酶活性方面)。進行兩個單獨的穩(wěn)定性研究，以評估在酸化和提純的蛋清步驟下，提純參數(shù)方差對產(chǎn)物保持時間的影響。從上述兩個魯棒性實驗(即實驗2和3)的每一個中取出60mL等分試樣(每個酸化和提純的蛋清各兩個)，并在2至8℃或室溫下儲存。每24小時取1.5mL樣品直到72小時(pH5.7/24小時)或96小時(pH6.3/6小時)。由于時間限制，沒有對實驗1(中心點)進行穩(wěn)定性研究。穩(wěn)定性設計參數(shù)總結在下表9中。表9：工藝中穩(wěn)定性設計*T＝0等于解凍起點(包括解凍時間的附加的保持時間)**RT＝18-25℃(平均22℃)結果顯示，在2至8℃下，該工藝中所有三個待檢點(解凍、酸化和提純的蛋清)的酶活性在整個時間過程研究(高達96小時)內(nèi)是穩(wěn)定的。此外，酸化pH或酸化時間的變化通常對酶活性沒有負面影響。用于酸化的蛋清待檢點的單組測試參數(shù)(pH5.7，室溫)確實顯示酶活性降低了～20％。然而，目前酸化的蛋清的商業(yè)方法儲存目標溫度為2至8℃，因此，該觀察結果對于所述商業(yè)方法沒有風險?；谒鰯?shù)據(jù)，解凍/匯集的蛋清在2至8℃下可穩(wěn)定長達168小時(包括最初的72小時解凍時間)，酸化的蛋清在2至8℃下可穩(wěn)定長達96小時，提純的蛋白階段在2至8℃或室溫下可穩(wěn)定長達96小時。(4)補充DNA清除研究盡管蛋清本身不含有DNA，但是蛋清獲取過程可能通過將少量蛋黃引入蛋清池而導致宿主基因組DNA的存在。對來自上述實驗1至3的研究的酸化和提純的蛋清進行宿主基因組DNA的分析。分析表明：1、在合并的和酸化的蛋清中檢測到DNA2、鑒定在提純步驟期間顯著的DNA清除。這些數(shù)據(jù)表明，除了蛋清宿主蛋白清除外，提純步驟提供了從產(chǎn)物池中去除宿主基因組DNA的方法。其他實施方案在所附權利要求的范圍內(nèi)。當前第1頁1 2 3