本發(fā)明屬于通過發(fā)酵進(jìn)行酸奶生產(chǎn)的領(lǐng)域。發(fā)酵是用于使用釋放酸的微生物的代謝活性來生產(chǎn)酸奶的眾所周知的技術(shù)。
背景技術(shù)：
：眾所周知，釋放酸的微生物可被使用在包括奶(milk)的進(jìn)料(feed)培養(yǎng)物中，而產(chǎn)生具有比奶更長的貨架期的酸奶。用于使用在酸奶生產(chǎn)中的眾所周知的釋放酸的微生物的示例是來自如下的屬的微生物：乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)和鏈球菌屬(Streptococcus)。在典型的酸奶發(fā)酵過程中，可以區(qū)分為三個(gè)階段。當(dāng)微生物與發(fā)酵進(jìn)料(通常為基于奶的進(jìn)料)組合時(shí)，第一個(gè)階段開始。微生物適應(yīng)于它們的新環(huán)境，并且開始攝取營養(yǎng)物，如肽、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)。在該階段，微生物生成用于細(xì)胞分裂和生長，用于消耗能量，以及用于制備儲(chǔ)備物質(zhì)，結(jié)構(gòu)單元或營養(yǎng)物所需要的酶。然而，在該階段，幾乎沒有微生物生長，也沒有表明發(fā)酵中任何事情正在發(fā)生的任何其他可見跡象。由于這個(gè)原因，該階段被稱作延滯期。延滯期的特征在于某些營養(yǎng)物的存在對于生長可能是限制因素。一個(gè)示例是這樣的系統(tǒng)，在所述系統(tǒng)中，肽的量不足以允許正常的微生物生長或者不足以維持正常的微生物生長速率。只要肽的存在繼續(xù)不足，生長就會(huì)繼續(xù)受到肽濃度的限制。盡管似乎什么都沒有發(fā)生，但是該階段對于發(fā)酵過程是非常重要的，因?yàn)槲⑸锓N群的健康決定了所得到的酸奶的質(zhì)量。當(dāng)微生物已經(jīng)適應(yīng)了它們的環(huán)境，第二個(gè)階段啟動(dòng)。該階段被稱作指數(shù)期，其特征在于非底物限制的微生物生長。在指數(shù)期期間，微生物開始通過細(xì)胞分裂來生長，并且因此以指數(shù)方式繁殖。在該階段，由于它們的代謝特性，除了別的以外，微生物還生成乳酸。在指數(shù)期結(jié)束時(shí)，適合的營養(yǎng)物的量通常已經(jīng)減少，從而發(fā)酵奶混合物不能再維持指數(shù)生長。因此，生長放緩，而發(fā)酵進(jìn)入靜止期。在該階段，盡管仍然發(fā)生細(xì)胞分裂，但是生長不再是指數(shù)的，并且發(fā)酵混合物慢慢地在所有存在的化合物中達(dá)到平衡。如果所有情況都是適合的，這會(huì)產(chǎn)生高質(zhì)量的、具有均衡的風(fēng)味和氣味的酸奶產(chǎn)品。這些階段所需要的時(shí)間是高度可變的，并且取決于所使用的一種或多種微生物的類型、發(fā)酵進(jìn)料的類型、溫度以及許多其他參數(shù)?？紤]到這些不同的階段，酸奶的生產(chǎn)通常是分批式過程。如在分批式過程中常見的，成本方面的重要因素是完成產(chǎn)品所需要的時(shí)間。生產(chǎn)時(shí)間的重要因素是延滯期。在該階段，實(shí)際發(fā)酵過程準(zhǔn)備妥當(dāng)。除了為微生物生長創(chuàng)造適當(dāng)?shù)臈l件之外，所述延滯期根本無助于感興趣的產(chǎn)品的制作，并且正因如此，較短的延滯期將對發(fā)酵過程的經(jīng)濟(jì)性具有很大的影響。然而，延滯期對于決定微生物種群的健康是非常重要的，反過來，所述微生物種群的健康對于酸奶的質(zhì)量是重要的。度過延滯期且發(fā)酵過程到達(dá)指數(shù)期所需要的時(shí)間被稱為延滯時(shí)間。以前已進(jìn)行嘗試來減少延滯時(shí)間。一個(gè)選擇是使用半連續(xù)式發(fā)酵過程，其中使微生物適應(yīng)于生產(chǎn)階段，并且在指數(shù)期保持延長的一段時(shí)間。然而，這通常是不適合的，因?yàn)殪o止期對于決定酸奶的最終味道和/或質(zhì)量是重要的，而該階段在這樣的半連續(xù)式過程中被繞過了。同樣，可能的是添加混合的微生物(被稱作發(fā)酵起始劑(starter)培養(yǎng)物)，所述混合的微生物已經(jīng)適應(yīng)于發(fā)酵的培養(yǎng)基條件。然而，這會(huì)產(chǎn)生不同的問題，因?yàn)樵谛∫?guī)模預(yù)混合微生物進(jìn)料中，工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵罐的環(huán)境很難復(fù)制。可能的是使用較大體積的預(yù)培養(yǎng)物(接種物)，但是這對生產(chǎn)過程和預(yù)培養(yǎng)階段的成本具有很大影響。因此，將優(yōu)選的是用有限量的發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物以可靠的方式減少延滯時(shí)間，所述方式可能比用該技術(shù)更進(jìn)一步地減少延滯時(shí)間。對于減少延滯時(shí)間，還可能的是向預(yù)混合物添加額外的容易運(yùn)輸?shù)牟⑶夷芰坑幸娴臓I養(yǎng)物，例如額外的肽。然而，這會(huì)產(chǎn)生附加的成本，以及例如異味和著色的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及一種用于通過發(fā)酵制備酸奶的方法，包括以下步驟：在適合的培養(yǎng)基中提供包括選定的微生物的發(fā)酵起始劑(fermentationstarter)培養(yǎng)物，向所述培養(yǎng)基添加植物蛋白蛋白酶抑制劑(優(yōu)選地馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑)，在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，以及收獲所述酸奶。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，向發(fā)酵進(jìn)料添加馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑顯著地減少發(fā)酵的延滯時(shí)間。所需要的馬鈴薯蛋白的量足夠低而不會(huì)影響酸奶的味道，并且在分批式過程和在半連續(xù)式過程兩者中都出現(xiàn)延滯時(shí)間的減少。附圖說明圖1：用于酸奶生產(chǎn)的流程圖。圖2：在不同濃度的PPII下，酸奶制造期間的時(shí)間依賴型pH降低；較高濃度的PPII導(dǎo)致更快的pH降低。圖3：酸奶產(chǎn)品的照片圖4：在有和沒有預(yù)發(fā)酵熱處理的情況中，在不同濃度的PPII下，使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物和3.5％的乳蛋白，在酸奶制造期間達(dá)到pH5時(shí)的時(shí)間減少。圖5：在酸奶制造期間，在不同濃度的PPII下、使用添加至3.5％的乳蛋白的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物而制作的酸奶，達(dá)到pH5.0、5.3和4.7時(shí)的發(fā)酵時(shí)間的生長曲線圖。圖6：使用添加至3.5％的乳蛋白的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物，在不同溫度下，在有和沒有預(yù)發(fā)酵熱處理的情況中，在不同濃度的PPII的存在下，獲得用于發(fā)酵的目標(biāo)pH5.0時(shí)的時(shí)間減少。圖7：茄酸PPII蛋白對由經(jīng)修飾的泡盛曲霉(Aspergillusawamori)生成分枝放線菌過氧化物酶(ArP)(ArthomycesramousPeroxidase)的凍干組分的蛋白酶抑制。圖8a：馬鈴薯蛋白酶抑制劑分離物、大豆蛋白酶抑制劑和豌豆蛋白酶抑制劑對酸奶生產(chǎn)時(shí)間上的劑量依賴型時(shí)間減少。圖8b：在有和沒有預(yù)發(fā)酵熱處理(80℃，30分鐘)的情況中，使用標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物并且使用PPII、豌豆蛋白和大豆粉時(shí)，在酸奶制造期間達(dá)到pH5時(shí)的劑量依賴型時(shí)間減少。圖9：使用六種不同的酸奶起始培養(yǎng)物，在酸奶制造中達(dá)到pH5時(shí)的劑量依賴型時(shí)間減少。圖10a：當(dāng)通過OD600觀察時(shí)，在增加的肽濃度下，微生物隨時(shí)間的生長。當(dāng)向培養(yǎng)基添加肽時(shí)，觀察到生長方面的明顯優(yōu)點(diǎn)。在該具體情況中，用該發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物，在超過75％的肽的肽濃度下，該培養(yǎng)基不再表現(xiàn)為肽限制的(peptide-limited)。圖10b：通過OD600nm的評估，在添加PPII后，針對不同的肽濃度的劑量依賴型時(shí)間減少。在該具體實(shí)施例中，在具有超過75％(酵母提取物和酪蛋白胨)的肽濃度的培養(yǎng)基中，針對PPII沒有觀察到延滯時(shí)間減少。在具有低于75％(YE和CP)的肽濃度的培養(yǎng)基中，示出對于該發(fā)酵通過PPII獲得的劑量依賴型時(shí)間減少。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及一種用于制備酸奶的方法，包括以下步驟：在適合的培養(yǎng)基中提供包括選定的微生物的發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物，向所述培養(yǎng)基添加植物蛋白蛋白酶抑制劑(優(yōu)選地馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑)，在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，以及收獲所述酸奶。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，向發(fā)酵進(jìn)料添加少量的馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑(如馬鈴薯蛋白酶抑制劑分離物(“PPII”))顯著地減少發(fā)酵的延滯時(shí)間，這在酸奶的生產(chǎn)中具有經(jīng)濟(jì)上的益處。所需要的馬鈴薯蛋白的量足夠低而不會(huì)影響酸奶的味道，并且在分批式過程和在半連續(xù)式過程兩者中都出現(xiàn)延滯時(shí)間的減少。在本發(fā)明的上下文中，延滯時(shí)間減少還可以被稱作“刺激活性”(SA)。同樣，本發(fā)明可以應(yīng)用在寬的pH范圍和溫度范圍內(nèi)。本方法針對用于酸奶的生產(chǎn)的發(fā)酵過程。優(yōu)選地，本發(fā)明應(yīng)用在其中微生物的生長是肽限制的發(fā)酵過程中。針對本發(fā)明的范圍，肽是由5-30個(gè)氨基酸組成的小的蛋白質(zhì)片段；這樣的片段還被稱作“營養(yǎng)肽”。肽限制的發(fā)酵是這樣的發(fā)酵，其中游離的營養(yǎng)肽的濃度受到限制，而其中其他必需的營養(yǎng)物(如(痕量)礦物質(zhì)、碳水化合物和蛋白質(zhì))是可自由獲得的。當(dāng)由蛋白酶/肽酶將營養(yǎng)肽降解為氨基酸的速率高于從蛋白質(zhì)形成營養(yǎng)肽的速率時(shí)，出現(xiàn)這種肽的限制?？梢酝ㄟ^觀察少量的肽的添加對生長和延滯時(shí)間的作用，來檢驗(yàn)發(fā)酵是否是肽限制的。當(dāng)營養(yǎng)肽的添加不導(dǎo)致實(shí)質(zhì)上更快的發(fā)酵時(shí)，那么發(fā)酵不是肽限制的。當(dāng)營養(yǎng)肽的添加的確導(dǎo)致更快的發(fā)酵時(shí)，那么發(fā)酵可以被稱作肽限制的。這意味發(fā)酵速率依賴于可獲得的營養(yǎng)肽的濃度。在肽限制的發(fā)酵的情況中，營養(yǎng)肽不足以維持或者適應(yīng)于微生物的指數(shù)生長。這導(dǎo)致延滯時(shí)間的增加。在本發(fā)明的方法中，特別是對于肽限制的發(fā)酵，并且特別是在可獲得足夠的蛋白質(zhì)的情況中，發(fā)現(xiàn)添加相對少量的馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑減少延滯時(shí)間。意想不到的是，特別是在包含肽限制的發(fā)酵的方法中，延滯時(shí)間被減少了。眾所周知，在決定發(fā)酵的延滯時(shí)間方面的重要因素是蛋白質(zhì)在培養(yǎng)基中降解為5-30個(gè)氨基酸的小的營養(yǎng)肽。該轉(zhuǎn)變受到各種各樣的蛋白酶的影響。蛋白酶抑制劑的眾所周知的功能是抑制蛋白酶，有效地抑制負(fù)責(zé)將蛋白質(zhì)降解為營養(yǎng)肽的蛋白酶。同樣，將預(yù)期的是，任何來源的蛋白酶抑制劑的添加將會(huì)由于較慢的蛋白質(zhì)的酶促降解以及相關(guān)聯(lián)的較慢的營養(yǎng)肽的形成，而導(dǎo)致增加的延滯時(shí)間。然而，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)事實(shí)上情況恰恰相反，馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的添加導(dǎo)致減少的，而非增加的延滯時(shí)間。在本發(fā)明上下文中，延滯時(shí)間被定義為微生物適應(yīng)新環(huán)境(培養(yǎng)基)所需要的持續(xù)時(shí)間。這是延滯期所需要的持續(xù)時(shí)間?？梢越?jīng)由各種適合的代謝輸出參數(shù)來監(jiān)控酸奶發(fā)酵過程。例如，pH可能是適合的代謝輸出參數(shù)?？商鎿Q地，光密度(在600nm處的OD，OD600)可能提供適合的輸出參數(shù)，以提供對所存在的微生物的量的量化。然而，技術(shù)人員可以想到許多方式來確定發(fā)酵的進(jìn)程，并且確定酸奶生產(chǎn)中延滯期所需要的時(shí)間。如本領(lǐng)域眾所周知的，發(fā)酵一般通過以輸出參數(shù)(如光密度或pH)表示的S形曲線進(jìn)行。在本發(fā)明中，達(dá)到指數(shù)曲線的中間點(diǎn)的時(shí)間通過計(jì)算來自其二次導(dǎo)數(shù)的平滑的S曲線中的拐點(diǎn)來獲得?？商鎿Q地，當(dāng)使用pH作為代謝進(jìn)程的指標(biāo)時(shí)，人們采取指數(shù)曲線的中點(diǎn)pH值，并且記錄直至達(dá)到該pH的時(shí)間。在酸奶生產(chǎn)中，可以使用pH5.0和pH5.5之間的任何pH，只要始終應(yīng)用該值，以允許適當(dāng)?shù)谋容^?？梢酝ㄟ^比較沒有添加馬鈴薯蛋白酶抑制劑的發(fā)酵與其中添加了適當(dāng)量的馬鈴薯蛋白酶抑制劑的相同的發(fā)酵的延滯時(shí)間，來確定延滯時(shí)間的減少。一般地，絕對延滯時(shí)間減少被量化為減少的小時(shí)，而相對延滯時(shí)間減少被量化為“％”。天然馬鈴薯蛋白可以暫且被分成三類：(i)馬鈴薯糖蛋白家族，高度同源的酸性的43kDa的糖蛋白(馬鈴薯蛋白的40wt.％-50wt.％)；(ii)堿性的5-25kDa的蛋白酶抑制劑(馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑)，當(dāng)被分離時(shí)，所述蛋白酶抑制劑被稱為馬鈴薯蛋白酶抑制劑分離物或“PPII”(馬鈴薯蛋白的30wt.％-40wt.％)；以及(iii)其他蛋白質(zhì)，大部分為高分子量蛋白質(zhì)(馬鈴薯蛋白的10wt.％-20wt.％)(Pots等,J.Sci.Food.Agric.1999,79,1557-1564)。PPII可以基于它們的分子量被分成不同的組。不同組的蛋白酶抑制劑被確認(rèn)為蛋白酶抑制劑I(約39kDa的分子量)、羧肽酶抑制劑(約4100Da的分子量)、蛋白酶抑制劑IIa和IIb(約20.7kDa的分子量)，以及蛋白酶抑制劑A5(約26kDa的分子量)。這些不同組的蛋白酶抑制劑在總的馬鈴薯蛋白中的比率取決于馬鈴薯的品種。針對本發(fā)明的范圍，馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑包括任何馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑，或者不同的馬鈴薯蛋白的任何混合物，所述混合物包括如上文限定的一種或更多種馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑或者抑制劑組。馬鈴薯蛋白酶抑制劑分離物(PPII)是包括馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的分離物。PPII可以以任何已知的方式獲得，如通過(例如)沉淀、在60℃-80℃下熱分級分離、膜分離、用硫酸銨或飽和脂肪酸或其他組分沉淀、過濾技術(shù)如超濾或凝膠過濾。優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用PPII?？梢匀鏦O2008/069650中描述的獲得所述PPII，所述專利的內(nèi)容通過引用被并入本文，其中描述了對來自馬鈴薯果汁(PFJ)或馬鈴薯果味水(potatofruitwater)(PFW)的蛋白酶抑制劑的分離物的詳盡描述。該過程需要使馬鈴薯果汁在7-9的pH下經(jīng)受二價(jià)金屬陽離子的絮凝作用，并且將絮凝的馬鈴薯果汁離心，由此形成上清液。隨后，使上清液經(jīng)歷擴(kuò)張床吸附層析(所述擴(kuò)張床吸附層析是使用能夠結(jié)合馬鈴薯蛋白的吸附劑、在小于11的pH以及5℃-35℃的溫度下操作的)，由此將天然的馬鈴薯蛋白吸附到吸附劑。結(jié)合一定量的天然馬鈴薯蛋白的柱材料包括混合模式的吸附劑(adsorbentia)，如(例如)AmershamStreamlineTMDirectCSTI(GE醫(yī)療)、Fastline吸附劑(UpfrontChromatographyA/S)，大孔吸附劑如AmberliteTMXAD7HP(&Haas公司)以及離子交換吸附劑?？商鎿Q地，高度優(yōu)選包括如歐洲專利申請12175944.3中公開的包括配體的吸附劑來分離適合于使用在本發(fā)明中的PPII。最后，用洗脫液從吸附劑上洗脫至少一種天然馬鈴薯蛋白分離物。除了其他以外，該方法還獲得了具有存在最少的變性蛋白并且以穩(wěn)定的溶解性為特征的高純度的PPII。因此，該方法獲得天然PPII。在本發(fā)明的方法中，天然PPII一般是優(yōu)選的。根據(jù)在Spelbrink等人，TheOpenFoodScienceJournal2011(5)p42-46“QuantitativeDeterminationTrypsinInhibitoryActivityinComplexMatrices(以復(fù)矩陣定量測定胰蛋白酶的抑制活性)”或者在ISO14902:2001E“AnimalFeedStuffs-Determinationofsoyaproducts(動(dòng)物飼料——大豆產(chǎn)品的測定)”中描述的方法，馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的數(shù)量可以通過測量針對胰蛋白酶的抑制效果來確定。作為使用馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的替換方案，如在PPII中，可能的是使用從PPII中分離的進(jìn)一步純化的蛋白質(zhì)組分。優(yōu)選的蛋白質(zhì)組分ο在pH8下是可溶的οpKa<8ο具有TIA和CTIA兩種活性，但是任一種活性都不能經(jīng)受住在80℃下熱處理30分鐘。盡管如此，延滯時(shí)間減少的能力直至至少90℃仍保持為不受影響。ο具有在17.5kDa和18.2kDa之間的分子量。根據(jù)在Spelbrink等人，TheOpenFoodScienceJournal2011(5)p42-46“QuantitativeDeterminationTrypsinInhibitoryActivityinComplexMatrices(以復(fù)矩陣定量測定胰蛋白酶的抑制活性)”或者在ISO14902:2001E“AnimalFeedStuffs-Determinationofsoyaproducts(動(dòng)物飼料——大豆產(chǎn)品的測定)”中描述的方法，TIA活性通過測量蛋白質(zhì)針對胰蛋白酶的抑制效果來確定。CTIA活性通過測量蛋白質(zhì)針對糜蛋白酶的抑制效果來確定。要使用的方法本質(zhì)上與針對TIA描述的方法相同，但是需要更高的酶劑量來補(bǔ)償糜蛋白酶較低的比活。使用馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的優(yōu)點(diǎn)在于大多數(shù)是非常熱穩(wěn)定的。馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑分離物中負(fù)責(zé)延滯時(shí)間減少的活性部分直至60℃、優(yōu)選地70℃、更優(yōu)選地80℃，并且最優(yōu)選地90℃的溫度仍能使它的天然狀態(tài)保持至少15min、優(yōu)選地至少90min。這允許在發(fā)酵過程中的不同點(diǎn)處添加馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑?？梢栽谔砑影l(fā)酵起始劑培養(yǎng)物之前、之后或者期間，將所述馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑添加到培養(yǎng)基中，或者可以將它添加到發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物本身中。同樣，可以在發(fā)酵之前加熱發(fā)酵進(jìn)料的過程中，將所述馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑添加到發(fā)酵進(jìn)料中。例如在發(fā)酵之前需要巴氏滅菌或滅菌(常見于許多酸奶生產(chǎn)過程中)的過程中就是這樣。本發(fā)明的另外的優(yōu)點(diǎn)在于，馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑在非常低的濃度下在所描述的發(fā)酵過程中也是起作用的。具體是，添加小于1g/l、優(yōu)選地小于0.5g/l、更優(yōu)選地小于0.1g/l、甚至更優(yōu)選地小于0.05g/l的馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑足以減少根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵過程中的延滯時(shí)間。需要至少0.01g/l、優(yōu)選地0.005g/l、更優(yōu)選地0.001g/l的最少量的馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑來減少根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵的延滯時(shí)間。馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的優(yōu)選濃度在例如5g/l和0.001g/l之間，優(yōu)選地在5g/l和0.05g/l之間，更優(yōu)選地在5g/l和0.01g/l之間，如在1g/l和0.01g/l之間。在本文上下文中，馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的濃度被表示為每升培養(yǎng)基中馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的g數(shù)。在這些濃度下，馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑不會(huì)賦予酸奶任何味道，這是附加的優(yōu)點(diǎn)。而且另外，這些低濃度的馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑對于酸奶的感官特性沒有可檢測的影響。然而，大于0.5％直至2％的較高濃度的馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑改善最終酸奶產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)和感官特性，例如柔滑度(smoothness)。在發(fā)酵過程中，馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑在寬的pH范圍內(nèi)起到作用也是本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。具體地，培養(yǎng)基中的pH可以為直至6.7、優(yōu)選地8.0、更優(yōu)選地直至10.0。同樣，pH可以低至4、優(yōu)選地低至3、更優(yōu)選地低至2。馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑在寬的pH范圍內(nèi)的穩(wěn)定性是有利的，因?yàn)樗试S通過發(fā)酵來加工具有各種pH的培養(yǎng)基。另外，它允許酸奶發(fā)酵在整個(gè)發(fā)酵過程中從馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的添加中受益。此外，本發(fā)明的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)在于馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑是不引起過敏的。這意味它可以被使用在由對其他蛋白質(zhì)過敏的人操作的酸奶發(fā)酵過程中。同樣，這意味它可以被使用于這樣的酸奶的發(fā)酵，其中所述酸奶可以被具有過敏癥的人食用，而不會(huì)有過敏性休克風(fēng)險(xiǎn)。另外，馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的優(yōu)點(diǎn)在于該蛋白質(zhì)的溶液，優(yōu)選地水性溶液，在直至至少10g/L、優(yōu)選地50g/L、更優(yōu)選地250g/L的濃度下，是澄清的，或者至少是基本上非渾濁的。這些濃度優(yōu)選地是在2至5、優(yōu)選地2-4、更優(yōu)選地2.5-3.5的溶液pH下達(dá)到的。澄清的或者基本上非渾濁的馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑溶液允許方便的過濾滅菌以及酸奶的誘人外觀。在馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑與來自其他來源的蛋白酶抑制劑的比較中，發(fā)現(xiàn)與馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑相反，雞蛋蛋白蛋白酶抑制劑在可比較的劑量下并沒有表現(xiàn)出延滯時(shí)間的減少。同樣，乳清蛋白分離物(WPI)和羧肽酶抑制劑(CPI)在可比較的劑量下也沒有表現(xiàn)出延滯時(shí)間的減少。然而，當(dāng)添加到適合的培養(yǎng)基(如包括奶的一種培養(yǎng)基)中時(shí)，大豆蛋白蛋白酶抑制劑和豌豆蛋白蛋白酶抑制劑可以顯示出延滯時(shí)間的減少。然而，需要更高劑量的大豆蛋白蛋白酶抑制劑或豌豆蛋白蛋白酶抑制劑，因?yàn)閷τ谕愣购痛蠖沟鞍?，在相同劑量下的延滯時(shí)間減少顯著低于馬鈴薯蛋白(參見圖8a)。目前針對馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑在具有減少的延滯時(shí)間的發(fā)酵方法中的使用所描述的所有參數(shù)也都適用于豌豆蛋白和大豆蛋白蛋白酶抑制劑，并且針對馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑所描述的任何參數(shù)或參數(shù)的組合也都被認(rèn)為對于豌豆蛋白蛋白酶抑制劑和大豆蛋白蛋白酶抑制劑是有效的。因此，植物蛋白蛋白酶抑制劑(如來源于被子植物(開花植物)或烹飪用蔬菜的那些植物蛋白蛋白酶抑制劑，優(yōu)選地豌豆、大豆和馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑)可以類似地被使用在根據(jù)本發(fā)明的具有減少的延滯時(shí)間的酸奶發(fā)酵方法中。然而，并非馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的所有優(yōu)點(diǎn)都能類似地應(yīng)用于其他植物蛋白蛋白酶抑制劑。具體地，大豆粉沒有表現(xiàn)出馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的熱穩(wěn)定性。因此，大豆粉不能被使用在其中在發(fā)酵之前大豆粉與培養(yǎng)基一起加熱的發(fā)酵方法中(如在滅菌之前包括巴氏滅菌或(過濾/加熱)滅菌步驟的方法中)來減少延滯時(shí)間。這是馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑優(yōu)于大豆粉中的大豆蛋白蛋白酶抑制劑的優(yōu)點(diǎn)。分離的豌豆和大豆蛋白蛋白酶抑制劑表現(xiàn)出熱穩(wěn)定性。當(dāng)用PPII執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵時(shí)，熱處理步驟之后的延滯時(shí)間減少與沒有之前的熱處理步驟的情況下觀察到的延滯時(shí)間減少差不多相同。這對于分離的豌豆和大豆蛋白是類似的，所述豌豆和大豆蛋白的活性與沒有之前的熱處理步驟的情況差不多相同，盡管如上文描述的，按絕對值計(jì)，豌豆和大豆蛋白的延滯時(shí)間減少低于馬鈴薯蛋白。相對于使用馬鈴薯蛋白，使用豌豆和大豆蛋白的另外的缺點(diǎn)是延滯時(shí)間減少上的較低活性使得需要更高的濃度。這導(dǎo)致所添加的蛋白質(zhì)賦予酸奶味道的增加的風(fēng)險(xiǎn)，這就是缺點(diǎn)。另外，豌豆和大豆蛋白蛋白酶抑制劑都是引起過敏的蛋白質(zhì)，所述豌豆和大豆蛋白蛋白酶抑制劑由于相對于馬鈴薯蛋白增強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)和規(guī)范而對于應(yīng)用在一般的食物生產(chǎn)過程中是難處理的。因此，關(guān)于在發(fā)酵中的熱穩(wěn)定性、延滯時(shí)間減少和一般工業(yè)適用性方面，馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑優(yōu)于來自其他來源的蛋白酶抑制劑。然而，任何植物蛋白蛋白酶抑制劑(如來源于被子植物(開花植物)或烹飪用蔬菜的那些植物蛋白蛋白酶抑制劑，優(yōu)選地豌豆、大豆和馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑)在添加到酸奶發(fā)酵進(jìn)料后都表現(xiàn)出延滯時(shí)間的減少。馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的所有上述優(yōu)點(diǎn)也都適用于PPII，其中所述PPII被用作馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑。具體地，在PPII的情況中，優(yōu)點(diǎn)在于PPII包括高量的熱穩(wěn)定部分，所述熱穩(wěn)定部分類似地允許根據(jù)本發(fā)明的馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑使用在發(fā)酵之前加熱發(fā)酵進(jìn)料的過程中。一般地，PPII包括在20wt.％和80wt.％之間，優(yōu)選地在40wt.％和60wt.％之間的熱穩(wěn)定的馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑，從而僅低量的PPII的添加導(dǎo)致減少的延滯時(shí)間。同樣在該情況中，不會(huì)向最終產(chǎn)品賦予味道。可替換地，在將馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑應(yīng)用在發(fā)酵過程之前，可以從PPII分離PPII的熱穩(wěn)定部分。這可以通過熱沉淀和之后對PPII中非熱穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的過濾來完成，于是PPII的熱穩(wěn)定部分被分離為熱穩(wěn)定的馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的溶液，所述溶液可以可選地例如通過凍干被分離為粉末?？商鎿Q地，可以通過對PPII的分級分離，如通過離子交換層析法(通過在對應(yīng)于熱穩(wěn)定的蛋白酶抑制劑中的大多數(shù)的pH下進(jìn)行洗脫)，并且還通過吸附過程、膜過濾、凝膠過濾或選擇性沉淀，來獲得熱穩(wěn)定的馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑。用于通過發(fā)酵制備酸奶的方法的微生物是適合于生產(chǎn)酸奶的那些微生物。適合的微生物包括(例如)來自乳桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬(Leuconostoc)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的微生物。發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物，在本發(fā)明上下文中，是包括適合于獲得酸奶的一種或更多種微生物的培養(yǎng)物。發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物可以包括單個(gè)微生物類型，或者它可以包括兩種或更多種微生物。適合的發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物包括存在于克非爾(Kefir)中的生物體，如乳酸菌和酵母，以及乳桿菌屬、乳球菌屬、短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、腸系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳脂鏈球菌(Lactococcuscremoris)，例如雙醋酸乳球菌(Lactococcusdiacetylactis)和乳脂明串珠菌(Leuconostoccremoris)的混合物。培養(yǎng)基必須是適合于酸奶發(fā)酵的。適合的培養(yǎng)基包括奶，如(例如)奶牛奶、山羊奶、綿羊奶、牦牛奶、馬奶、馴鹿奶、駝鹿奶、水牛奶、驢奶和/或駱駝奶，優(yōu)選地奶牛奶。發(fā)酵期間的培養(yǎng)條件可以是已知用于酸奶發(fā)酵的那些培養(yǎng)條件。培養(yǎng)條件可以是需氧的或厭氧的，并且如果是需氧的，可以包含低的、正常的或高的充氣量。培養(yǎng)可以是固態(tài)或液態(tài)培養(yǎng)，并且可以在分批式或半連續(xù)式加工方法中以任何規(guī)模完成。氧氣水平可以從無(厭氧發(fā)酵)到有(需氧發(fā)酵)變化。加工可以是攪拌以及靜態(tài)兩種。發(fā)酵期間的溫度可以從-10℃至+60℃，優(yōu)選地從13℃-45℃變化。優(yōu)選地，溫度保持恒定。pH可以從pH2-10，優(yōu)選地4–6.7變化。培養(yǎng)時(shí)間是高度可變的，并且取決于培養(yǎng)物的類型。技術(shù)人員清楚知道對于酸奶適合的培養(yǎng)時(shí)間。因此，培養(yǎng)時(shí)間可以在0.5hr和10年或以上之間變化，或者其間的任何時(shí)間。馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的添加可以發(fā)生在發(fā)酵之前的任何時(shí)間。這樣的添加可以通過將馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑與培養(yǎng)基組合為經(jīng)過濾或巴氏滅菌的蛋白質(zhì)濃縮溶液，并且隨后添加發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物來完成，或者可替換地，通過將發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物與天然馬鈴薯蛋白組合，并且將該混合物與培養(yǎng)基組合來完成。可替換地，根據(jù)具體情況，可以單獨(dú)地添加所有組分，或者與培養(yǎng)基的其他成分組合添加所有組分。這樣的培養(yǎng)基的其他成分可以包括例如碳水化合物、痕量礦物質(zhì)、大量礦物質(zhì)(bulkminerals)、蛋白質(zhì)、肽。在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以在加熱步驟之前，將馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑添加到培養(yǎng)基中。當(dāng)在添加發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物之前，如為了巴氏滅菌或滅菌要加熱培養(yǎng)基時(shí)，這是有利的。由于馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的有利的熱穩(wěn)定性，即使在這樣的加熱之后，馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑仍能保持它的天然狀態(tài)，從而甚至在加熱之后，仍保留它的天然生化功能，而減少發(fā)酵的延滯時(shí)間。馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑(優(yōu)選地，處于天然狀態(tài))的添加具有減少發(fā)酵的延滯時(shí)間的效果。取決于培養(yǎng)物和培養(yǎng)基，相對于其中不添加馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的相同的發(fā)酵方法，延滯時(shí)間被顯著地減少了如至少10％、優(yōu)選地至少25％、更優(yōu)選地至少50％、更優(yōu)選地至少60％并且最優(yōu)選地至少90％。可以采取本領(lǐng)域已知的用于發(fā)酵后分離酸奶的任何形式來收獲酸奶。具體地，可以通過監(jiān)控適合的代謝輸出參數(shù)(如pH或光密度)、確定發(fā)酵終點(diǎn)以及分離酸奶來獲得酸奶?，F(xiàn)在將通過以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1：酸奶的生產(chǎn)PPI-分離物是馬鈴薯蛋白酶抑制劑分離物，并且可以被縮寫為PPII。PPI-分離物已在過程中2個(gè)不同的點(diǎn)處被添加到發(fā)酵混合物，即1)在巴氏滅菌之前添加到奶中，以及2)在巴氏滅菌之后與發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物一起添加到奶中。第三個(gè)選擇是在發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物的生產(chǎn)期間添加PPII，記住PPII在奶/酸奶中的最終濃度。圖1中圖示地給出過程。通過巴氏滅菌奶(除非另有說明，在80℃下，30min)并且冷卻至40℃-42℃來制備新鮮的酸奶。該圖中示出可以添加PPI-分離物的可能的過程步驟。注意到，當(dāng)以更高的劑量添加PPII時(shí)，pH降低。因此，建議的是，用例如NaOH將pH重新調(diào)節(jié)至pH6.7，因?yàn)檩^低的pH會(huì)影響酸奶的質(zhì)地。為了制備酸奶，將奶與2％(w/w)的商業(yè)酸奶或者來自例如CSKFoodEnrichmentB.V.(1單位/10L≈0.02％(m/m))或來自DSM、CY(5單位/1000L)的建議量的發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物接種，并且發(fā)酵4h-7h，以達(dá)到4.5的pH。所使用的標(biāo)準(zhǔn)酸奶培養(yǎng)物(-StarY200)包含乳酸菌嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)。小規(guī)模(25-50mL)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并且接種之后立即在40℃-42℃的水浴中培育樣品。一旦pH達(dá)到pH4.5，就停止所有實(shí)驗(yàn)。在發(fā)酵期間以2-15分鐘的間隔自動(dòng)記錄pH(WTW,德國)。圖2中示出用2％的酸奶劑量作為接種物時(shí)，發(fā)酵期間的酸化曲線。具有0％的PPII的參照酸奶在5:45h后達(dá)到pH5.0。具有0.025％的PPII的酸奶在3h后達(dá)到pH5.0。以PPII制作的酸奶的發(fā)酵時(shí)間顯著地短于空白酸奶的發(fā)酵時(shí)間?？梢赃_(dá)到的時(shí)間減少很大程度上取決于接種物的生存力和生長期。當(dāng)接種物中的細(xì)胞處于靜止期時(shí)(例如，當(dāng)使用2％的酸奶作為接種物時(shí))，空白/參照酸奶的延滯時(shí)間非常大，并且因此可能的時(shí)間減少非常高。實(shí)施例2：酸奶生產(chǎn)中的延滯時(shí)間減少的PPII依賴性根據(jù)實(shí)施例1，用范圍為從0.005％(w/w)至0.025％(w/w)的不同的PPII劑量制備酸奶。針對PPII的劑量濃度標(biāo)繪出通過添加PPII所獲得的時(shí)間減少。使用發(fā)酵達(dá)到pH5.0需要的時(shí)間來比較各種劑量的PPII對于延滯時(shí)間的效果。如圖2中示出的，隨著增加的量的馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑分離物，發(fā)酵時(shí)間顯著地減少。實(shí)施例3：馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑分離物的熱穩(wěn)定性在巴氏滅菌之前或之后添加PPII都會(huì)產(chǎn)生可比較的劑量依賴型時(shí)間減少曲線(圖4和6)。如先前兩個(gè)實(shí)施例描述的，使用預(yù)先限定的發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物來制備酸奶。在巴氏滅菌之前將PPII添加到奶中。奶-PPII預(yù)混合物沒有經(jīng)過巴氏滅菌(室溫，RT)，或者在3個(gè)不同的溫度，80℃、85℃和90℃下進(jìn)行巴氏滅菌30分鐘。對于所有樣品，所獲得的(絕對和相對)時(shí)間減少都取決于PPII的劑量，并且在不同的熱處理之間沒有觀察到顯著的區(qū)別。在該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)最佳的PPII劑量為0.1％的PPII，而該劑量產(chǎn)生了顯著的相對時(shí)間減少(≈20％)。實(shí)施例4：用于使用在本發(fā)明中的馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑可以是天然的通過在50℃下將蛋白質(zhì)溶解在包含5mM的CaCl2的100mM、pH5.0的檸檬酸鹽緩沖液中(SigmaAldrich,C3881)并且冷卻回37℃，來制備30g/L的偶氮酪蛋白(SigmaAldrich,A2765)儲(chǔ)備溶液。將包含蛋白酶活性的凍干的真菌溶解產(chǎn)物溶解在1mM的HCl溶液中。將PPII溶解在pH3.0的醋酸鹽溶液中。以這樣的方式由PPII溶液制備一系列稀釋液，從而在針對最高樣品濃度培育后導(dǎo)致～50％的信號損失。從每種稀釋液取125μL與25μL的真菌蛋白酶溶液在艾本德杯(eppendorfcup)中混合，或者作為對照，與25μL的軟化水混合。針對蛋白水解反應(yīng)的陽性和陰性對照使用125μL的軟化水而非樣品材料。向這些混合物添加225μL的溫的偶氮酪蛋白，接著在37℃、0℃下培育30分鐘。隨后通過添加150μL15％w:v的TCA溶液淬滅反應(yīng)。添加偶氮酪蛋白的順序與添加TCA的順序相同，以確保對于所有樣品具有相等的培育時(shí)間。(參見圖7)使用ThermoScientific轉(zhuǎn)子，在HeraeusMultifuge1SR中，通過在40℃下15,000g離心10分鐘除去未水解的偶氮酪蛋白和其他不溶物。將100μL的上清液通過小心的移液轉(zhuǎn)移到微量滴定板，并且補(bǔ)充100μL的1.5M的NaOH溶液。隨后在BioRadModel680酶標(biāo)儀上分析所述板在450nm處的吸光度。針對板中樣品材料的量標(biāo)繪吸光度。使用最小二乘法經(jīng)由線性回歸獲得所得到的線的斜率，并且所述斜率表示每單位數(shù)量的樣品材料所損失的吸光度的量。在沒有樣品時(shí)，陽性對照表示由已知量的蛋白酶溶液造成的最大吸光度。因此，通過斜率除以陽性對照的吸光度，獲得胰蛋白酶抑制活性，所述胰蛋白酶抑制活性被表示為每單位量的樣品材料所抑制的蛋白酶的量。由此得出結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)所使用的PPII可以是天然的。實(shí)施例5：與來自其他來源而非馬鈴薯的蛋白酶抑制劑蛋白質(zhì)的比較針對它們減少酸奶發(fā)酵中的延滯時(shí)間的能力，檢驗(yàn)來自兩種植物來源，豌豆和大豆的蛋白酶抑制劑，因?yàn)閷τ诖笠?guī)模商業(yè)加工來說，這些蛋白是最容易獲得的。此外，檢驗(yàn)雞蛋蛋白，因?yàn)檫@代表動(dòng)物來源的飲食蛋白酶抑制劑的主要來源。檢驗(yàn)兩種類型的豌豆蛋白，來自Cosucra的C9和F9。同樣，使用生的大豆粉(SigmaAldrich)和大豆蛋白(Profam,ADM)，以及雞蛋蛋白和PPII。圖8a示出在使用CSKFoodEnrichmentB.V.的Y200的發(fā)酵中，針對大豆和豌豆蛋白兩者的劑量依賴型時(shí)間減少，其中，蛋白質(zhì)不經(jīng)歷發(fā)酵前的熱處理。雞蛋蛋白僅表現(xiàn)出較小的延滯時(shí)間減少(未示出)。生的大豆粉表現(xiàn)出比豌豆蛋白更高的延滯時(shí)間減少，但是在蛋白最終濃度時(shí)劑量已被耗盡，這意味需要非常高劑量的大豆粉。然而，如通過使用PPII例證的，使用大豆蛋白的延滯時(shí)間減少明顯地小于使用馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑的延滯時(shí)間減少。對于豌豆蛋白，使用C9和F9兩者。如通過使用PPII例證的，兩種類型給出相同的延滯時(shí)間減少，這遠(yuǎn)小于針對馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑觀察到的延滯時(shí)間減少。如可以從圖8a中看到的，針對酸奶發(fā)酵，PPII表現(xiàn)為具有最高的延滯時(shí)間減少，并且優(yōu)于豌豆和大豆蛋白兩者，產(chǎn)生更短的發(fā)酵時(shí)間。馬鈴薯蛋白、分離的大豆蛋白和分離的豌豆蛋白表現(xiàn)為耐熱的。針對這些蛋白，在劑量依賴型酸奶延滯時(shí)間減少方面，在熱處理(80℃，持續(xù)30分鐘)之前和之后這兩點(diǎn)之間沒有觀察到顯著變化。然而，生的大豆粉的延滯時(shí)間減少?zèng)]能經(jīng)受住熱處理(圖8b)。圖6：在各種發(fā)酵系統(tǒng)中的延滯時(shí)間減少，第一例為了證實(shí)不同的酸奶系統(tǒng)中的PPII的延滯時(shí)間減少，檢驗(yàn)了不同的商業(yè)發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物。選擇發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物，從而可以按照最終酸奶的粘度和后酸化的次序評估最大變化。所檢驗(yàn)的發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物是CSKFoodEnrichmentB.V.的酸奶培養(yǎng)物Y200、Y700、Y900、Y104和Y508(嗜熱鏈球菌(St.thermophilus)和德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌亞種(Lb.delbrueckiisubsp.bulgaricus)的各種混合物)，以及B193(嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌亞種、嗜酸乳桿菌(Lb.acidophilus)和雙歧桿菌的混合物)。在所檢驗(yàn)的6種發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物中，在以0.05％-0.20％的PPII劑量添加PPII后，所有6種都表現(xiàn)出顯著的延滯時(shí)間減少(圖9a)，導(dǎo)致減少的酸奶生產(chǎn)時(shí)間。實(shí)施例7：確定發(fā)酵系統(tǒng)是否為肽限制的可以執(zhí)行劑量響應(yīng)檢驗(yàn)來評估系統(tǒng)是否為肽限制的。此處以模型系統(tǒng)示出原理，其中在發(fā)酵期間可獲得的肽的濃度是變化的。在酸奶發(fā)酵系統(tǒng)中，肽濃度可以類似地變化，以確定酸奶發(fā)酵是否為肽限制的。該檢驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基是被標(biāo)記的培養(yǎng)基A-H，并且發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物是根據(jù)實(shí)施例1的。通過在600nm處的光密度(OD600)監(jiān)控發(fā)酵進(jìn)程。按如下制備所有的培養(yǎng)基A-H，在pH6.2-6.5時(shí)，向1000ml的水中添加：20g的葡萄糖(Merck1.08342)，1g的tween-80(Merck822187)，2g的K2HPO4(Merck1.05104)，5g的醋酸鈉(Merck1.06267)，2g的檸檬酸銨(SigmaAldrich09833)，0.2g的MgSO4-7H2O(SigmaAldrichM5921)，0.05g的MnSO4-H2O(SigmaAldrichM7634)，以及10g的肉提取物(Fluka70164)。另外，如表1中示出的，培養(yǎng)基包含許多酵母提取物(“YE”，F(xiàn)luka92144)和酪蛋白胨胰蛋白酶消化物(“CP”，肽源，F(xiàn)luka70172)。表1用于培養(yǎng)基A-H的配方培養(yǎng)基酵母提取物，YE[g]酪蛋白胨胰蛋白酶消化物，CP[g]A00B0.5(10％)0.1(10％)C1.25(25％)2.5(25％)D2.5(50％)5(50％)E3.75(75％)7.5(75％)F5(100％)10(100％)G7.5(150％)15(150％)H10(200％)20(200％)圖10a清楚地示出增加量的肽對于酸奶發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物的生長的作用。配方“E”、“F”、“G”和“H”示出差不多相同的結(jié)果，表明沒能達(dá)到延滯時(shí)間的進(jìn)一步減少。這意味配方“E”(75％的YE和CP)是用于該發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物的最佳培養(yǎng)基。相對于最小培養(yǎng)基“A”，在生長方面明顯的優(yōu)勢是針對“B”觀察到的。對于培養(yǎng)基“C”和“D”，結(jié)果相同。這意味，在這些情況中，用于該發(fā)酵起始劑培養(yǎng)物的培養(yǎng)基是肽限制的，導(dǎo)致顯著的延滯時(shí)間減少。圖10b示出PPII添加到具有不同劑量的肽(YE和CP)的培養(yǎng)基的效果。在該具體實(shí)施例中，在具有直至75％的酵母提取物和酪蛋白胨的肽濃度的培養(yǎng)基中，針對PPII的添加可以觀察到延滯時(shí)間減少。在具有75％和以下的YE和CP的肽濃度的培養(yǎng)基中，示出通過PPII對該發(fā)酵的劑量依賴型時(shí)間減少。實(shí)施例8：刺激劑(stimulatingagent)的純化和表征基本上根據(jù)Pouvreau的方法(Pouvreau2001)分級分離馬鈴薯蛋白。用除鹽水將馬鈴薯蛋白濃度(AVEBE)稀釋為1％的蛋白質(zhì)溶液，并且將pH設(shè)置為8.0。通過在環(huán)境溫度下5000g離心10分鐘除去不溶物。將上清液裝到包含Source30Q樹脂(GE醫(yī)療)的15×2.6cm的柱上，并且用0至0.6M的線性NaCl梯度洗脫。這產(chǎn)生被標(biāo)記為F1至F8的8個(gè)分離的蛋白質(zhì)組分。根據(jù)實(shí)施例1中的方法，針對延滯時(shí)間減少檢驗(yàn)了所有組分。這顯示組分F1和F6包含強(qiáng)的延滯時(shí)間減少，表明這些組分中存在有效成分，馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)，組分F2、F3、F4、F7和F8具有中等的延滯時(shí)間減少，而F5根本沒有表現(xiàn)出延滯時(shí)間減少。因此，F(xiàn)5中不存在有效成分，馬鈴薯蛋白蛋白酶抑制劑。在實(shí)驗(yàn)條件下活性成分結(jié)合到柱的事實(shí)顯示，所述活性成分在pH8.0時(shí)是水溶的，并且具有8.0或更低的等電點(diǎn)。在變性、還原條件下，根據(jù)生產(chǎn)商的說明在Experion自動(dòng)化電泳系統(tǒng)(BioRad)上測定組分的分子量。包含強(qiáng)的延滯時(shí)間減少的組分F1和F6具有共同的若干MW條帶，但是這些中只有一個(gè)不存在于組分F5中：出現(xiàn)在17.5kDa和18.2kDa之間的條帶(表2)。因此，由此得出結(jié)論，該條帶的存在表示強(qiáng)的延滯時(shí)間減少。表2根據(jù)本方法對蛋白酶抑制活性進(jìn)行的測定明確顯示，蛋白質(zhì)組分F1和F6包含胰蛋白酶抑制活性和糜蛋白酶抑制活性兩者，但是任一種活性都不能經(jīng)受住在80℃下熱處理30分鐘。盡管如此，如實(shí)施例3中示出的，延滯時(shí)間減少直至至少90℃仍保持為不受影響。這證明，TIA或CTIA都不是延滯時(shí)間減少的絕對要求。當(dāng)前第1頁1 2 3