植物貯藏蛋白主要是球蛋白、很少的白蛋白。菜籽是最重要的植物，其種子中存在較大量的白蛋白。菜籽白蛋白被稱為napin。菜籽球蛋白被稱為cruciferin。天然地，在菜籽中存在約60％cruciferin和約20％napin。

在許多應(yīng)用領(lǐng)域商業(yè)上需要白蛋白。由于白蛋白在植物中的低豐度以及由于缺乏用于napin的工業(yè)純化方法，所以至今沒有植物來源的白蛋白可用于工業(yè)應(yīng)用。

菜籽蛋白是至今很少開發(fā)的可再生資源的儲庫(reservoir)。例如，在由菜籽的油生產(chǎn)過程中以及在其它農(nóng)業(yè)過程中，它們大量地產(chǎn)生為副產(chǎn)物。主要地，它們是用作動物飼料的廢物，因?yàn)榻柚诮?jīng)濟(jì)上和技術(shù)上適用的方法不能從其中獲得純的，從而技術(shù)上可用的組分。在菜籽中的兩種主要貯藏蛋白，napin和cruciferin，其至今僅可以獲得為粗品部分(crude fraction)，例如，基于它們的分離的組分的物理化學(xué)性能，有資格用于泡沫或膠水(glue)(napin)或有資格用于薄片(foil)的生產(chǎn)(cruciferin)。此外，它們還適用于食品行業(yè)，例如作為發(fā)泡劑或穩(wěn)定劑。

至今，主要地，沉淀和提取方法已用于在技術(shù)規(guī)模上獲得粗蛋白部分或富集的化合物。在這種情況下，它是指美國專利4,370,267和4,368,151，其中描述了在等電沉淀以后通過在合適條件下的提取，植物來源的儲存組分的富集。在WO 2008/14439 A1中描述了用于從菜籽植物中蛋白提取的另一種方法。在現(xiàn)代技術(shù)水平中的所有這些方法的特征在于低效率。此外，通過這種方式，不可能獲得純組分，而僅獲得部分，以及主要地，僅優(yōu)化這樣的方法用于從蛋白質(zhì)混合物中獲得單一組分。至今僅通過復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模過程來獲得更純的物質(zhì)，上述過程包括不同的純化步驟的組合，例如，通過沉淀、透析、凝膠層析、和離子交換層析的組合來從菜籽中獲得12S球蛋白。此外，導(dǎo)致蛋白分離物的方法是已知的，其組成隨處理?xiàng)l件而變化并不允許獲得限定的產(chǎn)物(WO 2002/089597 A1、WO 2003/043438、WO 2013/000066 A1)。在這里，既未獲得純組分(napin/cruciferin)也未獲得純蛋白質(zhì)混合物，而是獲得仍然含有高水平的其它化合物的分離物。

此外，在WO 2002/05922中，描述了從菜籽蛋白中提取napin和cruciferin，其中通過“膨脹床(expanded bed)”陽離子交換層析，從水提取物中獲得napin，以及通過“膨脹床”陰離子交換層析的運(yùn)行來獲得cruciferin。然而，通過這種描述的方法，不能從工業(yè)用原料以足夠令人滿意的純度獲得蛋白質(zhì)。在WO 2009/018660 A1中已描述了一種類似的方法。其中提出了一種方法，借此，基本上一種純的2S菜籽蛋白將獲自菜籽粗粉。在約0.25至0.35M的鹽濃度下，在約5至6的pH下，進(jìn)行從油性鹽溶液中菜籽蛋白的溶解。在陽離子交換柱上進(jìn)行2S菜籽蛋白的純化，然后通過利用鹽濃度為0.55至0.7M的鹽溶液從柱上分離蛋白質(zhì)。這是非常高的鹽濃度并且可以預(yù)期，在使用前，必須對產(chǎn)物加以脫鹽。

在2013年4月15-16日在Nuthetal(德國)的“植物蛋白(Plant Protein)”會議期間的公告上Hansen等已提出了用于菜籽蛋白混合物的另一種層析純化方法。在Kristjansson等的出版物(Annual Transactions of the Nordic Rheology Society,Vol.21,p.317-320,2013)中描述了反應(yīng)條件。在施加于兩個柱以后，獲得兩個餾分，其中一個餾分含有具有較低分子量的蛋白質(zhì)(napin)而另一個餾分則含有不同的可溶性菜籽蛋白的混合物。

因此，本發(fā)明的技術(shù)問題主要是提供從菜籽植物中分別純化菜籽蛋白napin和cruciferin或它們的混合物的方法，其避免在現(xiàn)代技術(shù)水平中描述的方法的缺點(diǎn)，即，其是工業(yè)上可擴(kuò)展的，其以至少95％的純度分別提供napin或cruciferin，或以至少50％的純度分別提供混合物，以及其與商業(yè)上/工業(yè)上可用的菜籽產(chǎn)物相容如例如菜籽粗粉作為用于純化的原料。

通過提供如在專利權(quán)利要求中披露的實(shí)施方式，已實(shí)現(xiàn)針對此技術(shù)問題的解決方案。

出人意外地，發(fā)現(xiàn)，通過根據(jù)本發(fā)明的方法，主要通過在單獨(dú)的純化步驟期間保持一定范圍的pH值和鹽濃度，可以高效率地將所期望的菜籽蛋白分離成純化合物或分別地以高純度加以分離。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，在第一步驟中，簡單地通過沉淀，可以獲得高純度的cruciferin(純度高于95％)以及通過陽離子交換層析可以從上清液獲得高純度(純度也高于95％)。根據(jù)本發(fā)明的方法還提供純菜籽蛋白混合物，其具有約55-60％，優(yōu)選約57％的napin，以及具有約40-45％，優(yōu)選約43％的cruciferin。

因此，本發(fā)明涉及用于從植物獲得菜籽蛋白napin和/或cruciferin的混合物的方法，其中，所述方法包括以下步驟：

(a)通過水提取來分解植物以獲得原始提取物；

(b)從步驟(a)的上清液獲得所期望的蛋白質(zhì)以及將上清液調(diào)節(jié)到在5.0至6.0的范圍內(nèi)的pH值；

(c)通過陽離子交換器并借助于高鹽洗脫緩沖液，分離來自步驟(b)的混合物，其中緩沖液的pH值是在5.0至6.0的范圍內(nèi)；以及

(d)獲得洗脫液。

本發(fā)明還涉及用于從植物以純形式來獲得菜籽蛋白napin和/或cruciferin的方法，其中所述方法包括以下步驟：

(a)通過水提取，來分解植物以獲得原始提取物，優(yōu)選pH為5.0-6.0；

(b)從步驟(a)的上清液獲得所期望的蛋白質(zhì)并將上清液調(diào)節(jié)到在3.5至4.5的范圍內(nèi)的pH值；

(c)離心和獲得含有cruciferin的粒料(pellet)；

(d)將來自步驟(c)的上清液調(diào)節(jié)到在7.0至8.0的范圍內(nèi)的pH值；

(e)通過陽離子交換器并借助于pH值在7.0至8.0的范圍內(nèi)的高鹽洗脫緩沖液來分離來自步驟(d)的混合物；以及

(f)獲得含有napin的洗脫液。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法并不包括進(jìn)一步的步驟，即沒有預(yù)處理步驟和/或進(jìn)一步的純化步驟，尤其是那些步驟(其基于所期望的蛋白質(zhì)的特定物理化學(xué)特性，例如分子量、沉降系數(shù)、pI值是必要的)。然而，視情況而定，可以添加預(yù)處理和/或純化步驟。

相比與其中將蛋白質(zhì)混合物施加于陽離子交換層析材料的方法，通過從步驟(a)的提取上清液沉淀cruciferin，陽離子交換層析的效率會嚴(yán)格增加。

如在這里使用的，術(shù)語“純形式(in pure form)”是指，蛋白質(zhì)基本上不含雜質(zhì)，優(yōu)選具有至少95％的純度，更優(yōu)選至少98％，以及甚至更優(yōu)選至少99％。

為了獲得蛋白質(zhì)，可以使用植物的任何部分或組織，其中選擇取決于在植物的單獨(dú)部分或組織中所期望的蛋白質(zhì)的不同濃度。優(yōu)選地，所期望的蛋白質(zhì)獲自種子。

用于分解菜籽植物的適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以選擇適用于分別采用的植物材料的分解方法。這可以，例如，包括均化如在研磨器(grinder)或混合器中以獲得植物粗粉，和/或借助于適宜的裂解劑的裂解(lysis)。

技術(shù)人員還知道適當(dāng)?shù)奶崛〗橘|(zhì)并根據(jù)所期望的蛋白質(zhì)的相應(yīng)特性來選擇那些提取介質(zhì)(尤其地(amongst others))。優(yōu)選地，提取介質(zhì)是水溶液，尤其是磷酸鹽緩沖液、TRIS緩沖液、MOPS緩沖液、HEPPS緩沖液、巴比妥-乙酸鹽緩沖液、乙酸-乙酸鹽緩沖液、PBS緩沖液、MES緩沖液、或乙醇提取介質(zhì)(ethanolic extraction medium)。

優(yōu)選地，菜籽蛋白獲自輕輕壓制的菜籽粗粉，以及為了獲得原始提取物，將菜籽粗粉切碎成最小的可能的顆粒尺寸，優(yōu)選在0.2至0.5mm的范圍內(nèi)。

優(yōu)選在40至60℃的范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行水提取，優(yōu)選約50℃。應(yīng)選擇提取的持續(xù)時間，從而盡可能完全提取所期望的蛋白質(zhì)。提取的持續(xù)時間例如可以是1小時。優(yōu)選地，在提取以后，通過離心或通過傾析器來分離可能仍然存在的固體成分。

在根據(jù)本發(fā)明的用于獲得混合物的方法中，用于步驟(b)和(c)的pH值是在6.0至5.0的范圍內(nèi)，優(yōu)選5.5至6.0。最優(yōu)選的是約5.7至5.8的pH值。在分別地離心或傾析以后，優(yōu)選借助于氫氧化鈉溶液，將上清液的pH值調(diào)節(jié)到針對隨后離子交換層析所期望的值。在用加載緩沖液來平衡層析柱到相同pH值以后，將上清液加載到柱上并隨后用加載緩沖液來洗滌柱。在通過EBA方法來進(jìn)行層析的情況下，優(yōu)選在膨脹狀態(tài)下用15-18柱體積的加載緩沖液來洗滌柱。對于其它類型的層析，用分別適合數(shù)目的柱體積來進(jìn)行洗滌。在用洗脫緩沖液來洗脫菜籽蛋白混合物以后，脫鹽并優(yōu)選冷凍干燥洗脫液。

在根據(jù)本發(fā)明的用于獲得單獨(dú)蛋白質(zhì)的方法中，在步驟(b)中的pH值是在3.5至4.5的范圍內(nèi)，優(yōu)選3.8至4.2，其中約3.9至4.1的pH值是最優(yōu)選的，以及在步驟(d)和(e)中，pH值是在7.0至8.0的范圍內(nèi)，優(yōu)選7.2至7.8。最優(yōu)選的是約7.4至7.6的pH值。

優(yōu)選用氫氧化鈉溶液來進(jìn)行pH值的調(diào)節(jié)。在根據(jù)本發(fā)明以純形式來獲得單獨(dú)蛋白質(zhì)的方法中，在分別地離心或傾析以后，優(yōu)選將提取溶液的上清液冷卻至6至10℃。然后，將冷卻溶液調(diào)節(jié)至所期望的pH值，其中為此優(yōu)選使用檸檬酸或1M HCl溶液。之后，優(yōu)選經(jīng)較長時間，例如在6-10℃下約1小時，攪拌溶液，然后在>4,000g下離心沉淀的cruciferin。粒料含有純cruciferin，以及，如果需要的話，可以通過例如用去離子水進(jìn)行的多次洗滌來實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的純化。最后，可以進(jìn)行冷凍干燥。通過離子交換層析用于napin的進(jìn)一步的純化步驟按它們的意義對應(yīng)于用于獲得混合物(如上)的那些(具有改變的pH值)。

在根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，用于層析的加載和/或洗脫緩沖液是磷酸鹽緩沖液。它的摩爾濃度優(yōu)選是在5mM至80mM的范圍內(nèi)，其中10mM至40mM的范圍是更優(yōu)選的。最優(yōu)選的是約20mM的值。

如在這里使用的，術(shù)語“高鹽洗脫緩沖液”涉及洗脫緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液)，其鹽含量是如此之高以致待洗脫的蛋白質(zhì)與用于層析的珠材料的結(jié)合是不固定的(unset)。優(yōu)選地，用于此目的的洗脫緩沖液含有在0.2至0.6M的范圍內(nèi)的NaCl。更優(yōu)選的是0.3至0.5M的范圍。最優(yōu)選的是約0.4M的值。

根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)行陽離子交換層析，以純化所期望的蛋白質(zhì)。一種適用的層析方法尤其是“膨脹床吸附層析”(EBA)。EBA技術(shù)可擴(kuò)展到大型技術(shù)規(guī)模并且不需要復(fù)雜的設(shè)備技術(shù)。吸附劑顯示很少“結(jié)垢(fouling)”的跡象從而確保層析柱的長壽命。

在根據(jù)本發(fā)明的方法中，用于陽離子交換層析的優(yōu)選的基質(zhì)材料是Streamline SP XLTM(GE Healthcare)。其它基質(zhì)材料是Amberlite吸附劑(Dow Chemical)、Antibodix吸附劑(Sepax Technologies)、Proteomix吸附劑(Sepax Technologies)、DEAE Sepharose(例如Sigma Aldrich)、SP Sepharose(例如GE Healthcare)、Whatman陽離子吸附劑(GE Healthcare)、ZirChrom-PEZ吸附劑(ZirChrom Separations)。

根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的應(yīng)用市場的實(shí)例是烘烤食品、糖果、乳制品、美食(delicacy)、油性乳液、乳化劑(emulgator)、油漆、分散體、膠水、紙、功能性發(fā)泡劑、動物飼料(例如水產(chǎn)養(yǎng)殖)、化妝品、聚合物、藥品、保健品(nutraceutical)、和功能性食品。

由于實(shí)現(xiàn)的產(chǎn)物的高純度，這些是中性味道，因此，非常適合食品添加劑，其不改變或負(fù)面影響食物的原味。

根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的napin，由于是堿性蛋白質(zhì)，所以在油和糖的存在下，如果它連同酸性蛋白質(zhì)(耐油發(fā)泡系統(tǒng))一起使用，特別適用于泡沫的穩(wěn)定。因此，連同napin一起，酸性蛋白質(zhì)(例如乳清蛋白)可以取代昂貴的雞蛋白溶菌酶。

此外，尤其對于napin，可以考慮用作素食主義者美味，在乳制品中的功能性發(fā)泡劑，用作模擬奶酪，或用作植物來源的乳油。

Cruciferin可以尤其用于其中在油的存在下需要強(qiáng)泡沫穩(wěn)定的應(yīng)用，尤其還在技術(shù)應(yīng)用中。另外，要強(qiáng)調(diào)的是它的良好的成膜、凝膠形成、和膠凝性能。

對于菜籽蛋白混合物，在食品、化妝品和技術(shù)行業(yè)中的應(yīng)用(除其它應(yīng)用之外)，其中同樣在油的存在下，需要高到非常高的泡沫容量和穩(wěn)定性與高溶解度結(jié)合，是非常感興趣的。

附圖說明

圖1：來自按照QO 2002/05922純化的napin的SDS-PAGE的結(jié)果

M：標(biāo)志物；N：napin；C：cruciferin

來自量化的典型結(jié)果：

napin：82％；cruciferin：約9％；其它蛋白質(zhì)：約9％

圖2：來自按照實(shí)施例1沉淀的cruciferin的SDS-PAGE的結(jié)果

M：標(biāo)志物；泳道1-4：沉淀的cruciferin；N：雞蛋白溶菌酶

來自量化的典型結(jié)果：

napin：<3％％；cruciferin：>95％；其它蛋白質(zhì)：<2％

圖3：來自按照實(shí)施例2純化的菜籽蛋白混合物的SDS-PAGE的結(jié)果

M：標(biāo)志物；泳道1-3：層析純化的菜籽蛋白混合物；泳道4：層析純化的napin；L：溶菌酶

來自菜籽蛋白混合物的量化的典型結(jié)果：

napin：約57％％；cruciferin：約43％

來自napin的量化的典型結(jié)果：

napin：<98％；cruciferin：<2％

圖4：當(dāng)施加變化的pH值來溶解殘留物時，來自按照實(shí)施例2純化的菜籽蛋白混合物的SDS-PAGE的結(jié)果

M：標(biāo)志物

泳道1：在pH 5,5下的蛋白質(zhì)混合物

泳道2：在pH 4.0下溶解蛋白質(zhì)混合物以后的殘留物

泳道3：在pH 7.0下溶解蛋白質(zhì)混合物以后的殘留物

泳道4：在pH 10.0下溶解蛋白質(zhì)混合物以后的殘留物

泳道5：在pH 4.0下溶解的蛋白質(zhì)混合物

泳道6：在pH 7.0下溶解的蛋白質(zhì)混合物

泳道7：在pH 10.0下溶解的蛋白質(zhì)混合物

L：溶菌酶

圖5：變性行為的研究(熱焓/方法DSC，按照Sousa改進(jìn)的(SOUSA,I.et a.；Differential scanning calorimetry of lupin and soy protein；Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung；201:566-589(1995))

白蛋白：層析純化的napin

球蛋白：沉淀的cruciferin

蛋白質(zhì)混合物：層析純化的菜籽蛋白混合物(兩種成分napin和cruciferin顯示不同的變性行為；因此數(shù)據(jù)被指示)。

Ov-白蛋白：雞蛋卵清蛋白

圖6：根據(jù)Morr(1985)(MORR,C.V.；Collaborative study to develop a standardized food protein solubility procedure；Journal of Food Science；50:1715-1718(1985))，蛋白質(zhì)溶解度的研究

圖7：根據(jù)Kroll(1984)(KROLL；J.et al.；Beeinflussung funktioneller Eigenschaften von Proteinen durch gekoppelte mechanolytische und chemische Modifizierung；Die Nahrung 28,No.4,389-396(1084))，發(fā)泡能力的研究

圖8：根據(jù)Kroll(1984)(KROLL；J.et al.；Beeinflussung funktioneller Eigenschaften von Proteinen durch gekoppelte mechanolytische und chemische Modifizierung；Die Nahrung 28,No.4,389-396(1084))，泡沫穩(wěn)定性的研究

圖9：根據(jù)Poole(POOLE,S.,WEST,S.I.and WALTERS,C.L.M.；Protein-protein interactins:Their importance in the foaming of hetergoeneous protein systems；J.Sci.Food Agrlc.,35:701-711(1984))，在酸性蛋白質(zhì)和糖的存在下，泡沫穩(wěn)定性的研究

A：0.3％napin

B：0.3％napin+1％BSA

C：0.3％napin+1％BSA+5％油

D：0.3％napin+1％BSA+5％油+10％蔗糖

E：0.3％雞蛋溶菌酶+1％BSA+5％油+10％蔗糖

圖10：根據(jù)Muschiolik(2013)(MUSCHIOLIK,Gerald；Untersuchungen zur von Proteinproben；Prüfbericht,2013)，乳化性能的研究

相穩(wěn)定性：

+++完全穩(wěn)定的

++底部少許水

-水的很少沉積

---水的較多沉積

熱穩(wěn)定性：

+++穩(wěn)定的，沒有相分離，沒有高含量的空氣，沒有油的沉積

¹)乳液顆粒吸附到空氣泡

以下實(shí)施例說明本發(fā)明。

實(shí)施例1

從未脫油的菜籽種子純化napin和cruciferin

菜籽種子的處理

在槳式干燥器型D 600(DVA Deutsche Vakuumapparate Holland Merten GmbH)中處理用于通過熱調(diào)節(jié)來滅活肌球蛋白的菜籽種子。通過鏟機(jī)制(shovel mechanism)，以10min^-1的速度混合種子。通過蒸汽加熱的槳式干燥器的雙罩(double mantle)發(fā)生熱流入(heat influx)。進(jìn)行熱處理15分鐘以及在過程結(jié)束時種子的溫度是75至80℃。隨后在用于油生產(chǎn)的螺桿壓實(shí)機(jī)(IBG Monforts Oekotec GmbH&Co.KG,)中處理菜籽種子。壓制溫度是在50和60℃之間。隨后對菜籽粗粉進(jìn)行正己烷提取。這是在公司Bio-Ingenieurtechnik GmbH(Leipzig)的小型設(shè)施中，通過固體流體提取，借助于油水混合物蒸餾(miscella distillation)，來進(jìn)行。以兩個步驟，在58至60℃的溫度下，進(jìn)行提取2小時。在正己烷提取以后，殘余油含量是1至2％(w/w)。在流化床干燥器中進(jìn)行菜籽粗粉的隨后脫溶劑化。通過15分鐘的脫溶劑期，借助于約80℃的流化床的操作溫度，從菜籽粗粉中消除己烷。在脫溶劑以后，在多個步驟中，借助于波紋輥式Haferboy(Egon Simmer Maschinenbau GmbH&Co.KG)，將菜籽粗粉切碎成0.2至0.5mm的范圍。

蛋白提取

在50℃下，以在水溶液中1:10的比率，攪拌菜籽粗粉1小時。溶液的pH值是在5.4至5.8的范圍內(nèi)。隨后，在>4,000g下離心溶液。

Cruciferin的生產(chǎn)

將來自蛋白提取的上清液冷卻至6至10℃。在借助于檸檬酸來調(diào)節(jié)至pH 4以后，攪拌溶液30分鐘，隨后在>4,000g下離心。這個步驟可以重復(fù)多次。冷凍干燥獲得的殘留物。

Napin的生產(chǎn)

借助于氫氧化鈉溶液，將來自cruciferin生產(chǎn)的干物質(zhì)含量為3.3％的上清液調(diào)節(jié)至pH 7.5。對于膨脹床吸附層析(EBA)，使用填充有160.5ml t陽離子吸附劑Streamline SP XL(GE Healthcare)的Streamline 25柱(GE Healthcare)。借助于15ml/分鐘，結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鹽緩沖液，ph 7.5)流向吸附劑并且用6柱體積的緩沖液來擴(kuò)張吸附劑。隨后，也在15ml/分鐘下，泵送溶液上清液，例如2,000ml)通過柱。在以下步驟中，通過連同結(jié)合緩沖液也在15ml/分鐘流動速率下的流動，除去在柱中存在的殘余上清液，直到達(dá)到最終UV為<180mAU。結(jié)合緩沖液的所需體積是約15至18柱體積。之后，洗脫吸附的蛋白質(zhì)。使用的洗脫緩沖液是20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)和0.4M NaCl。隨后通過膜式過濾并借助于截止為10kDa的基于盤繞PES的膜(Millipore GmbH)來脫鹽洗脫液，直到達(dá)到<500μS/cm的電導(dǎo)率，然后冷凍干燥。以四個步驟來實(shí)現(xiàn)吸附劑的結(jié)合能力的再生，其中借助于0.5M NaOH+1M NaCl溶液，借助于DI水、25％乙酸，以及最后借助于結(jié)合緩沖液。

實(shí)施例2

從未脫油的菜籽種子中純化napin和cruciferin的混合物

在分離而沒有沉淀以后，將來自按照實(shí)施例1的蛋白提取的提取溶液調(diào)節(jié)至pH 5.5。借助于在pH 6.6下的結(jié)合緩沖液來進(jìn)行吸附劑的平衡。隨后以15ml/分鐘的流動速率，泵送提取溶液通過EBA柱。以下步驟是相同于napin的生產(chǎn)的步驟。對于蛋白質(zhì)的洗脫，將洗脫緩沖液(0.4M NaCl)調(diào)節(jié)至pH 5.5。將獲得的洗脫溶液過濾到<600μS/cm的電導(dǎo)率并冷凍干燥。

實(shí)施例3

單獨(dú)蛋白質(zhì)napin和cruciferin的產(chǎn)物表征

Napin

-白蛋白(“2S蛋白質(zhì)”)

-約20％的種子蛋白質(zhì)

-14.5kDa

-2條鏈：10和4.5kDa

-強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)

-許多亞型

Cruciferin

-球蛋白(“12S蛋白質(zhì)”)

-約60％的種子蛋白質(zhì)

-300kDa

-由6個亞基組成，3至4個亞基是可以用考馬斯染色的(在20-30kDa的范圍內(nèi))

-中性

-許多亞型

等電點(diǎn)：

-溶菌酶：11.0

-BSA：4.6

-napin：>10

-cruciferin：約7.25

-卵清蛋白：4.5

(A)通過根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的純napin

蛋白質(zhì)含量98％；純度(＝napin含量)>98％(殘余<2％cruciferin)；高變性穩(wěn)定性(比卵清蛋白要高得多)；在pH 7.0下的溶解度(依據(jù)Morr，1985)：非常好(約100％，可相比于卵清蛋白)；發(fā)泡能力(依據(jù)Kroll，1984)：250％(卵清蛋白170％)，即比卵清蛋白更高；在30分鐘以后的泡沫穩(wěn)定性(依據(jù)Kroll，1984)：35％(卵清蛋白39％)，即可相比于卵清蛋白。

依據(jù)Poole(1984)對泡沫穩(wěn)定的測試(在1％BSA(即酸性蛋白、油和糖)的存在下)：

泡沫穩(wěn)定性：

0.3％napin：18％

0.3％napin+1％BSA+5％油+10％蔗糖：74％

作為比較：

0.3％溶菌酶+1％BSA+5％油+10％蔗糖：91％

排出物(drainage)：

0.3％napin：98％

0.3％napin+1％BSA+5％油+10％蔗糖：65％

作為比較：

0.3％溶菌酶+1％BSA+5％油+10％蔗糖：55％

在油和糖的存在下，如果連同酸性蛋白質(zhì)(耐油發(fā)泡系統(tǒng))一起施加，則napin(堿性蛋白)可以穩(wěn)定泡沫。因此，連同napin一起，酸性蛋白質(zhì)(例如乳清蛋白)可以取代昂貴的雞蛋白溶菌酶。

乳化性能：

相穩(wěn)定性良好，熱穩(wěn)定性非常好。

(B)通過根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的純cruciferin

蛋白質(zhì)含量>95％；純度(＝蛋白質(zhì)含量)>95％(殘余<3％napin和<2％其它蛋白質(zhì))；中等變性穩(wěn)定性，低于卵清蛋白；在pH 7.0下的溶解度(依據(jù)Morr，1985)：不良(約10％)；發(fā)泡能力(依據(jù)Kroll，1984)：100％(卵清蛋白170％)，即中等；在30分鐘以后的泡沫穩(wěn)定性(依據(jù)Kroll，1984)：38％(卵清蛋白39％)，即可相比于卵清蛋白。

乳化性能：

相穩(wěn)定性不良，熱穩(wěn)定性良好的。

(C)通過根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)混合物

蛋白質(zhì)含量>99,5％，通常含有約56-57％napin和約41-43％cruciferin；低變性穩(wěn)定性，比卵清蛋白以及比cruciferin低得多；在pH 7.0下的溶解度(依據(jù)Morr，1985)：良好(約75％)；泡沫能力(依據(jù)Kroll，1984)：300％(卵清蛋白170％)，即非常高；在30分鐘以后的泡沫穩(wěn)定性(依據(jù)Kroll，1984)：82％(卵清蛋白39％)，即也非常高。

乳化性能：

相穩(wěn)定性不良，熱穩(wěn)定性不良。

在不同pH值下的行為：

在pH 5,5下洗脫獲得的蛋白質(zhì)混合物并在純化過程結(jié)束時冷凍干燥，然后在pH值4.0、7.0和10.0下重新溶解；通過SDS凝膠層析測試蛋白質(zhì)溶液和未溶解的殘留物。

表1

如預(yù)期的，作為堿性蛋白質(zhì)的napin在pH 4.0和7.0下容易溶解(幾乎沒有殘留物)，但在pH 10.0下它是少得多可溶解的。而明顯地和如預(yù)期的，從冷凍干燥物中，cruciferin是少得多可溶解的。在pH 4.0和7.0下，它代表殘留物的主要部分。蛋白質(zhì)混合物在廣泛的pH范圍內(nèi)令人驚訝地是很好可溶解的并且不僅在pH 5.5下可再溶解的?；旧?，它具有和冷凍干燥以前相同的組成。如上概述的較低的變性穩(wěn)定性表明，在蛋白質(zhì)混合物中napin和cruciferin的相互作用/關(guān)聯(lián)，使得性能曲線不同于單獨(dú)組分結(jié)果的性能曲線。

根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的性能的匯總：

表2

這些產(chǎn)物特性圖形顯示于圖5至10。

對于SDS-PAGE分析，其示于圖1-4，使用了技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法。