本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用南瓜膳食纖維制備抗氧化性膳食纖維的方法。
背景技術(shù)：
南瓜是我國普遍種植的瓜菜，資源豐富。南瓜含有果糖、果膠、甘露醇、多種維生素和氨基酸等營養(yǎng)成分，以及南瓜多糖、膳食纖維、β- 胡蘿卜素、南瓜籽堿和葫蘆巴堿等多種生理活性物質(zhì)，其多糖和果膠類水溶性膳食纖維含量較高，是極好的水溶性膳食纖維資源，但目前尚未加以利用。
膳食纖維作為一種重要的食品組成成分，被稱為“第七大營養(yǎng)素”，具有順腸通便、調(diào)節(jié)控制血糖濃度、降血脂等多種生理功能。
按溶解性，膳食纖維可以分為水溶性膳食纖維(SDF) 和水不溶性膳食纖維(IDF)。其中SDF在預(yù)防糖尿病、心血管疾病、降低膽固醇等方面具有比IDF 更強(qiáng)的生理活性。
SDF 是由半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等聚合而成的高分子碳水化合物。單糖分子上含有大量的羥基，這些羥基能夠發(fā)生酯化反應(yīng)、醚化反應(yīng)、羧甲基化及乙酰化反應(yīng)。研究表明硫酸酯化是一種有效的化學(xué)修飾，多糖大分子單糖分子上的羥基被硫酸根所取代，具有抗凝血、抗腫瘤、抗病毒等生理活性，近年來一些硫酸酯化的香菇多糖、靈芝多糖、茯苓多糖等已應(yīng)用于臨床。
水溶性膳食纖維經(jīng)硫酸酯化后具有較強(qiáng)的抗氧化性。常用硫酸酯化的方法有：濃硫酸法、氯磺酸- 吡啶法、三氧化硫- 吡啶法、氯磺酸- 甲酰胺法。濃硫酸酯化需要在低溫條件下反應(yīng)，否則由于濃硫酸的碳化作用使產(chǎn)物顏色較深，操作條件苛刻；三氧化硫- 吡啶法成本高，僅適用于實(shí)驗(yàn)室水平；而氯磺酸- 吡啶法是目前采用較多的方法。氯磺酸- 吡啶法采用的氯磺酸是一種強(qiáng)氧化劑，遇水會發(fā)生劇烈分解，酯化試劑需要在-4℃嚴(yán)格無水條件下制備，制備條件苛刻，酯化劑穩(wěn)定性差，易結(jié)塊，獲得酯化產(chǎn)物顏色深，無機(jī)鹽含量高。
針對上述酯化方法存在的缺陷，硫酸酯化方法不斷地改進(jìn)。陜西科技大學(xué)楊陽等( 南瓜擠壓改性水溶性膳食纖維硫酸酯化修飾，食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40，61-64) 采用氨基磺酸- 吡啶法硫酸酯化南瓜膳食纖維，獲得硫酸酯化南瓜水溶性膳食纖維取代度為1.29，但是吡啶毒性大，易揮發(fā)，并且氣味刺鼻，反應(yīng)產(chǎn)物在該體系中呈褐色粘稠狀，不易攪拌。
目前，對于氨基磺酸-DMF法硫酸酯化制備抗氧化性南瓜膳食纖維尚未見報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種抗氧化性膳食纖維的制備方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
1) 將南瓜膳食纖維與南瓜膳食纖維重量20～40％的蒸餾水?dāng)嚢杌旌暇鶆蚝箪o置30～120min，靜置后進(jìn)行擠壓改性，然后依次經(jīng)烘干、粉粹以及過篩得南瓜膳食纖維擠壓改性物( 即擠壓改性南瓜膳食纖維) ；
2) 向南瓜膳食纖維擠壓改性物中加入蒸餾水后于50～70℃浸提1～2h，南瓜膳食纖維擠壓改性物與蒸餾水的質(zhì)量比為1:20～1:40，浸提結(jié)束后抽濾并收集濾液，將濾液真空濃縮后加入1～4 倍體積的95％乙醇并靜置過夜( 水提醇沉法)，然后離心并收集沉淀，將沉淀烘干得南瓜水溶性膳食纖維；
3) 將南瓜水溶性膳食纖維懸浮于N,N- 二甲基甲酰胺(DMF) 中得混合物A，在條件下向混合物A 中加入氨基磺酸，然后在超聲頻率為20～40kHz、溫度為50～80℃的條件下反應(yīng)1～3h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，然后用2～4mol/L NaOH 水溶液調(diào)節(jié)pH 值為中性，然后加入1～4 倍體積的95％乙醇并靜置過夜，然后離心并收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水并裝入透析袋中，然后用蒸餾水透析2～4 天，然后向透析液( 指透析袋內(nèi)的液體) 中加入1～4 倍體積的95％乙醇并靜置過夜，然后離心并收集沉淀，將沉淀烘干得硫酸酯化南瓜水溶性膳食纖維( 命名為SSDF)。
所述擠壓改性是在螺桿擠壓機(jī)螺桿轉(zhuǎn)速為700～900r/min 條件下擠壓膨化。
所述真空濃縮的條件為：溫度為45～60℃，真空度為0.06～0.09MPa，濃縮至濾液體積的1/4～1/6。
所述混合物A 中每1g 南瓜水溶性膳食纖維懸浮于60～90mL N,N- 二甲基甲酰胺中。
所述南瓜水溶性膳食纖維與氨基磺酸的質(zhì)量比為1:1～1:4。
所述南瓜膳食纖維的制備方法包括以下步驟：將南瓜漿與蒸餾水?dāng)嚢杌旌暇鶆蚝笥?～4mol/L NaOH 水溶液調(diào)節(jié)pH 為10～14，南瓜漿與蒸餾水的質(zhì)量比為1:3～1:5，然后于50～80℃保溫10min 得混合物B，向混合物B 中加入蒸餾水體積1～3％的雙氧水，然后于50～80℃攪拌反應(yīng)1～3h，攪拌反應(yīng)結(jié)束后用流水洗滌至中性，洗滌后依次烘干、粉碎以及過篩，得南瓜膳食纖維。
所述烘干的溫度均為35～60℃ ；所述過篩均采用20～80 目篩。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
(1) 本發(fā)明選用氨基磺酸為酯化劑，DMF 為反應(yīng)溶劑，將超聲波用于輔助南瓜SDF硫酸酯化，可以制備獲得具有良好生理活性的南瓜膳食纖維。
(2) 本發(fā)明以氨基磺酸為酯化劑，DMF 為反應(yīng)介質(zhì)，反應(yīng)條件溫和、毒性低，且DMF介質(zhì)易干燥，性質(zhì)溫和，不易揮發(fā)，南瓜SDF 在其中容易分散，產(chǎn)物顏色淺，在分離純化方面簡單易行。
(3) 本發(fā)明將超聲波用于輔助南瓜SDF 硫酸酯化，縮短了酯化時間，降低了酯化溫度，減少南瓜SDF 在強(qiáng)酸環(huán)境下的降解，增加酯化反應(yīng)速率，制得的硫酸酯化南瓜水溶性膳食纖維顏色淺，得率高。
(4) 本發(fā)明首次研究硫酸酯化南瓜水溶性膳食纖維的抗腫瘤活性，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明制備的硫酸酯化南瓜水溶性膳食纖維對乳腺癌細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。
(5) 本發(fā)明通過對南瓜漿進(jìn)行處理，不僅起到脫色作用，還提高了處理產(chǎn)物中南瓜膳食纖維的含量，通過進(jìn)一步對南瓜膳食纖維進(jìn)行擠壓改性處理，不僅顯著提高SDF 構(gòu)成比例，同時提高SDF 持水力、膨脹力等。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
南瓜膳食纖維的制備：稱取一定質(zhì)量南瓜漿，按照料液比為1:4(g:mL) 的比例加入蒸餾水，攪拌均勻，用2mol/L 氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH 為13，于70℃保溫10min，然后加入蒸餾水體積2％的雙氧水，70℃攪拌反應(yīng)2h，待反應(yīng)結(jié)束后過100 目篩，篩上物用流水洗滌至中性，將其置于65℃真空烘箱中烘干、粉碎并過40目篩，即得南瓜膳食纖維。
實(shí)施例1
1) 稱取一定質(zhì)量20目南瓜膳食纖維，加入南瓜膳食纖維質(zhì)量20％的蒸餾水，攪拌均勻，靜置30min，隨后在螺桿轉(zhuǎn)速為700r/min 條件下擠壓膨化，擠壓處理后將擠出物置于45℃烘箱中烘干，粉碎并過40目篩，獲得擠壓改性南瓜膳食纖維；
2) 稱取一定質(zhì)量40目擠壓改性南瓜膳食纖維，按1:20 的料液比(g:mL) 加入蒸餾水，于60℃浸提1h，抽濾并收集濾液，濾液在溫度為60℃，真空度為0.07MPa 下真空濃縮至1/5 體積，加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心并收集沉淀，將沉淀置于45℃烘箱中烘干，即得南瓜SDF ；
3) 準(zhǔn)確稱取1.0g 南瓜SDF，將其懸浮于60mL DMF 中，在攪拌條件下加入2.0g 氨基磺酸，隨后于超聲頻率為20kHz、溫度為50℃下反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，隨后用2.5mol/L 氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH 值為中性，加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，然后離心并收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水并裝入透析袋中，蒸餾水透析3 天，透析液加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心并收集沉淀，將沉淀置于45℃烘箱中烘干，即得到0.763g的SSDF。
實(shí)施例2
1) 稱取一定質(zhì)量40目南瓜膳食纖維，加入南瓜膳食纖維質(zhì)量30％的蒸餾水，攪拌均勻，靜置60min，隨后在螺桿轉(zhuǎn)速為800r/min 條件下擠壓膨化，擠壓處理后將擠出物置于50℃烘箱中烘干，粉碎并過60 目篩，獲得擠壓改性南瓜膳食纖維；
2) 稱取一定質(zhì)量60 目擠壓改性南瓜膳食纖維，按1:25 的料液比(g:mL) 加入蒸餾水，于70℃浸提1.5h，抽濾并收集濾液，濾液在溫度為50℃，真空度為0.06MPa 下真空濃縮至1/5 體積，加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心并收集沉淀，將沉淀置于50℃烘箱中烘干，即得南瓜SDF ；
3) 準(zhǔn)確稱取1.0g 南瓜SDF，將其懸浮于70mL DMF 中，在攪拌條件下加入3.0g 氨基磺酸，隨后于超聲頻率為30kHz、溫度為60℃下反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，隨后用2.5mol/L 氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH 值為中性，加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，然后離心并收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水并裝入透析袋中，蒸餾水透析3 天，透析液加入4倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心并收集沉淀，將沉淀置于50℃烘箱中烘干，即得到0.612gSSDF。
實(shí)施例3
1) 稱取一定質(zhì)量40目南瓜膳食纖維，加入南瓜膳食纖維質(zhì)量40％的蒸餾水，攪拌均勻，靜置90min，隨后在螺桿轉(zhuǎn)速為900r/min 條件下擠壓膨化，擠壓處理后將擠出物置于65℃真空烘箱中烘干，粉碎并過80 目篩，獲得擠壓改性南瓜膳食纖維；
2) 稱取一定質(zhì)量80 目擠壓改性南瓜膳食纖維，按1:30 的料液比(g:mL) 加入蒸餾水，于60℃浸提2h，抽濾并收集濾液，濾液在溫度為55℃，真空度為0.08MPa 下真空濃縮至1/6 體積，加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心并收集沉淀，將沉淀置于65℃真空烘箱中烘干，即得南瓜SDF ；
3) 準(zhǔn)確稱取1.0g 南瓜SDF，將其懸浮于80mL DMF 中，在攪拌條件下加入3.0g 氨基磺酸，隨后于超聲頻率為35kHz、溫度為70℃下反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，隨后用2.5mol/L 氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH 值為中性，加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，然后離心并收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水并裝入透析袋中，蒸餾水透析3 天，透析液加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心并收集沉淀將沉淀置于65℃真空烘箱中烘干，即得到0.609g的SSDF。
實(shí)施例4
1) 稱取一定質(zhì)量40目南瓜膳食纖維，加入南瓜膳食纖維質(zhì)量20％的蒸餾水，攪拌均勻，靜置120min，隨后在螺桿轉(zhuǎn)速為800r/min 條件下擠壓膨化，擠壓處理后將擠出物置于60℃烘箱中烘干，粉碎并過40 目篩，獲得擠壓改性南瓜膳食纖維；
2) 稱取一定質(zhì)量40 目擠壓改性南瓜膳食纖維，按1:40 的料液比(g:mL) 加入蒸餾水，于70℃浸提1.5h，抽濾并收集濾液，濾液在溫度為45℃，真空度為0.09MPa 下真空濃縮至1/5 體積，加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心并收集沉淀，將沉淀置于60℃烘箱中烘干，即得南瓜SDF ；
3) 準(zhǔn)確稱取1.0g 南瓜SDF，將其懸浮于90mL DMF 中，在攪拌條件下加入4.0g 氨基磺酸，隨后于超聲頻率為30kHz、溫度為80℃下反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，隨后用2.5mol/L 氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH 值為中性，加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，然后離心并收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水并裝入透析袋中，蒸餾水透析3 天，透析液加入4 倍體積95％乙醇醇沉，靜置過夜，離心并收集沉淀，將沉淀置于60℃烘箱中烘干，即得到0.543g的SSDF。
本發(fā)明首先在堿性環(huán)境下制備南瓜膳食纖維；其次對南瓜膳食纖維進(jìn)行擠壓改性處理，經(jīng)擠壓改性處理后水溶性膳食纖維含量從原料中的4.7％增加到27.3％；隨后采用水提醇沉法提取水溶性膳食纖維；然后采用氨基磺酸-N,N- 二甲基甲酰胺法對南瓜水溶性膳食纖維進(jìn)行硫酸酯化修飾，獲得硫酸酯化南瓜SDF 取代度為0.23～0.97，酯化反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物顏色淺，產(chǎn)率高。
本發(fā)明對制得的抗氧化性南瓜SDF（硫酸酯化南瓜SDF，簡稱SSDF） 分別進(jìn)行自由基清除能力的測定及對人乳腺癌細(xì)胞MM231 的增殖抑制作用研究。自由基清除能力測定結(jié)果表明，與未酯化南瓜SDF 相比，硫酸酯化南瓜SDF 對羥自由基、超氧陰離子自由基及氧自由基清除能力顯著增強(qiáng)，當(dāng)濃度為5mg/mL，對自由基清除能力分別提高22.04％、51.86％、38.98％。對乳腺癌細(xì)胞MM231的增值抑制作用研究結(jié)果表明，硫酸酯化南瓜SDF 對乳腺癌細(xì)胞MM231 的增值具有明顯抑制作用，利用Graphpad 軟件計(jì)算IC50 得到南瓜SDF、SSDF 對MM231 細(xì)胞48h 的IC50 分別為265.4mg/L，16.58mg/L。由此說明，本發(fā)明制得的抗氧化性南瓜膳食纖維具有良好的生物活性。