一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法
【專(zhuān)利摘要】一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法，包括以下步驟：合成鼠李糖脂產(chǎn)生基因rhlAB的引物，應(yīng)用PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增，合成rhlAB基因片段，利用基因工程剪切、拼接技術(shù)，將rhlAB基因片段連接到pMS402質(zhì)粒上的lux發(fā)光基因之前，構(gòu)成重組質(zhì)粒，然后將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入銅綠假單胞菌DN1，將重組菌株涂布于含有200mg/L-300mg/LTmp的LB固體平板上，篩選出陽(yáng)性克隆，命名該菌株為rhlAB-lux菌株，挑選出陽(yáng)性單克隆菌落在固體LB培養(yǎng)基上富集，4℃冷藏保存?zhèn)溆?；取冷藏的rhlAB-lux菌株，過(guò)夜富集菌體；營(yíng)養(yǎng)優(yōu)化體系篩選；本發(fā)明通過(guò)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定發(fā)光值，具有高通量、篩選程序簡(jiǎn)化、快速的特點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，海洋的石油泄漏事件層出不群，給海洋和沿海環(huán)境帶來(lái)了嚴(yán)重的污染問(wèn)題，石油泄漏污染導(dǎo)致了大量的生物死亡，因此了解如何使用微生物降解烴類(lèi)是非常重要的。盡管烴類(lèi)化合物是一種相對(duì)穩(wěn)定的分子，但幾百萬(wàn)年來(lái)，隨著生物的進(jìn)化，烴類(lèi)已可以被微生物作為唯一碳源和能源降解利用，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道至今至少有175個(gè)種屬的微生物可以降解利用烴類(lèi)化合物。烴類(lèi)物質(zhì)中主要的污染物質(zhì)為芳烴類(lèi)，低分子量多環(huán)芳烴易被多種微生物降解利用，高分子量多環(huán)芳烴較低分子量多環(huán)芳烴難被微生物降解，然而根據(jù)最近幾十年的研宄，部分微生物在生長(zhǎng)的過(guò)程中可以分泌表面活性劑，表面活性劑分子由兩部分組成，一部分是疏油親水的極性基團(tuán)，另一部分是非極性基團(tuán)，由疏水親油的碳?xì)滏溄M成，正是這種特殊的結(jié)構(gòu)，使得表面活性劑具有良好的表/界面活性和乳化活性，能顯著降低發(fā)酵液的表/界面張力，使發(fā)酵液形成膠束溶液，乳化分散烴類(lèi)物質(zhì)，降低原油粘度，從而增大烴類(lèi)的溶解能力，特別是能增加較難溶于水的高分子量多環(huán)芳烴類(lèi)物質(zhì)的溶解度，從而促進(jìn)微生物對(duì)烴類(lèi)的攝取，提高微生物對(duì)烴類(lèi)的降解。
[0003]表面活性劑的種類(lèi)有很多，根據(jù)功能可劃分為乳化劑和分散劑，去垢劑，起泡劑，增稠劑，破乳劑，粘黏劑及分散劑等；根據(jù)所帶電荷可劃分為陽(yáng)離子表面活性劑，陰離子表面活性劑，非離子表面活性劑及兼性離子表面活性劑，而非離子表面活性劑與其他種類(lèi)的表面活性劑相比具有更高的表面活性，其水溶液表面張力和臨界膠束濃度更低，膠束聚集數(shù)更大，增溶作用更強(qiáng)；根據(jù)來(lái)源可劃分為化學(xué)合成表面活性劑和生物表面活性劑。化學(xué)表面活性劑是人工合成的表面活性劑，這種表面活性劑生產(chǎn)成本較低，生產(chǎn)工藝成熟，在各個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用也較早，但化學(xué)表面活性劑難被環(huán)境中的微生物降解，很容易造成環(huán)境的二次污染，由此，生物表面活性劑應(yīng)用而生。生物表面活性劑是某些微生物在生長(zhǎng)后期合成分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，通常由經(jīng)過(guò)篩選的微生物在胞外液體培養(yǎng)獲得，常用的生產(chǎn)方法有搖瓶培養(yǎng)，分批培養(yǎng)，流加培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)，混合微生物培養(yǎng)及酶處理。生物表面活性劑與傳統(tǒng)化學(xué)類(lèi)表面活性劑產(chǎn)品相比具有產(chǎn)品穩(wěn)定性好、適用范圍廣、綠色環(huán)保、可生物降解、不會(huì)帶來(lái)二次污染等優(yōu)點(diǎn)。
[0004]不同種類(lèi)微生物產(chǎn)生的生物表面活性劑種類(lèi)各不相同，研宄最多的是糖脂類(lèi)，包括槐糖脂、海藻糖脂、鼠李糖脂、蔗糖酯等，其中鼠李糖脂因?yàn)榛瘜W(xué)結(jié)構(gòu)種類(lèi)多樣，性能獨(dú)特，應(yīng)用前景廣泛，已成為當(dāng)前研宄的重點(diǎn)。鼠李糖脂是由銅綠假單胞菌合成的一種重要的生物表面活性劑，是一類(lèi)陰離子微生物糖脂，它的HLB (親水親脂平衡指數(shù))在4-6之間，是由L-(+)_鼠李糖和β -羥基烴酸單位組成，鼠李糖脂分子也是由親水部分和疏水部分兩部分組成，因此鼠李糖脂能顯著降低界面張力，或吸附在界面上形成緊密的定向排列來(lái)改變界面的親水/親油性能，使油/水兩相得以很好的分散，形成高度穩(wěn)定的乳化疏水性化合物水溶液。近年來(lái)鼠李糖脂由于其特有的生物表面活性劑的優(yōu)點(diǎn)，已逐漸被各個(gè)領(lǐng)域所重視并投入使用，如鼠李糖脂可以促進(jìn)石油的乳化、消除巖石上的油膜，降低巖層中的石油的粘滯度，從而能夠回收一次、二次采油后殘留的石油，可清洗儲(chǔ)油罐、消除海域中的石油污染，也可應(yīng)用于生物農(nóng)藥增加有機(jī)磷的溶解度，用于生物修復(fù)以及運(yùn)用于醫(yī)藥領(lǐng)域和化妝品領(lǐng)域等。
[0005]鼠李糖脂作為生物表面活性劑，其市場(chǎng)具有很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)性，已經(jīng)形成商品化的產(chǎn)品較少，其最大潛在應(yīng)用是石油工業(yè)，當(dāng)降低生產(chǎn)成本后可以代替化學(xué)表面活性劑用于石油開(kāi)采。鼠李糖脂的制備主要采用微生物發(fā)酵法，該工藝的發(fā)酵原料廣泛廉價(jià)，安全經(jīng)濟(jì)，工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)物可完全被生物降解，對(duì)生物體和環(huán)境也無(wú)危害，然而由于起步晚，鼠李糖脂的生產(chǎn)發(fā)展仍存在一些問(wèn)題和缺陷。從發(fā)酵工藝本身來(lái)說(shuō)，生產(chǎn)時(shí)具有相對(duì)較高的生產(chǎn)成本和較低的產(chǎn)量，并且微生物菌株通常具有致病性或者很難大規(guī)模處理，且產(chǎn)生的產(chǎn)品都是混合物，無(wú)法達(dá)到單一產(chǎn)品，因此加大了下游處理成本，就發(fā)酵菌株本身來(lái)說(shuō)，產(chǎn)品產(chǎn)生量較低，對(duì)培養(yǎng)基的要求和適應(yīng)能力較弱，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，如果限制某些發(fā)酵條件則可增加鼠李糖脂的產(chǎn)量，因此，如能依據(jù)此原理研宄出一種快速確定銅綠假單胞菌高產(chǎn)鼠李糖脂的營(yíng)養(yǎng)優(yōu)化體系，將會(huì)省去很多的工作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法，具有快速高效的優(yōu)點(diǎn)，可在較短時(shí)間內(nèi)確定多個(gè)影響因素，同時(shí)還可同時(shí)處理多個(gè)樣品，不僅節(jié)省了大量的時(shí)間，還節(jié)省了大量的人力、物力以及降低了原材料以及實(shí)驗(yàn)試劑的損耗，該方法將大大減少菌種營(yíng)養(yǎng)體系優(yōu)化的工作量，為以后各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的篩選和培養(yǎng)基的篩選優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法，包括以下步驟:
O合成鼠李糖脂產(chǎn)生基因474卻勺引物，應(yīng)用PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增，合成基因片段，利用基因工程剪切、拼接技術(shù)，將基因片段連接到pMS402質(zhì)粒上的7狀發(fā)光基因之前，構(gòu)成重組質(zhì)粒，然后將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入銅綠假單胞菌DN1，將重組菌株涂布于含有200mg/L-300mg/LTmp的LB固體平板上，篩選出陽(yáng)性克隆，命名該菌株為沒(méi)-7m菌株，挑選出陽(yáng)性單克隆菌落在固體LB培養(yǎng)基上富集，4°C冷藏保存?zhèn)溆茫?br> 2)取冷藏的沒(méi)-7m菌株，在含有200mg/L-300mg/LTmp(甲氧芐氨嘧啶)的LB固體培養(yǎng)基上活化24h，挑取單克隆，在含有100mg/L-200mg/LTmp的LB液體培養(yǎng)基中，pH5_7，搖床轉(zhuǎn)速為170rpm-250rpm，溫度為33°C _37°C，過(guò)夜富集菌體，將富集過(guò)的液體LB菌液8000rpm，4°C離心，去上清，BPLM無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸得菌液；
3)碳源篩選:使用含有100mg/L-200mg/LTmp的BPLM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，添加不同的碳源，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，搖床轉(zhuǎn)速為170rpm-250rpm，溫度為33°C -37°C,分別在8-18h之內(nèi)，50ul-150ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkinelmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳碳源種類(lèi)；最佳碳源為棕櫚油。
[0008]4)氮源確定:依照步驟2)所述富集菌體，使用含有100mg/L-200mg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基，添加不同的氮源，添加比例均為0.5%，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，搖床轉(zhuǎn)速為170rpm-250rpm，溫度為33°C -37°C，分別在8_18h之內(nèi)，50ul_150ul加樣于分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳氮源種類(lèi)；最佳氮源為NaNO3;
5)碳氮比的確定:依照步驟2)所述富集菌體，使用含有100mg/L-200mg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基，以0.5%的添加量固定一種氮源，按碳氮比為10，20，30，40，50，60，70，80，90，100十個(gè)梯度添加不同碳源，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為33°C -37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為170rpm-250rpm，分別在8_18h之內(nèi)，50ul_150ul加樣于分析板中，在perkinelmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳碳氮比；最佳C/N為20 ；
6)磷源確定:在碳源、氮源及碳氮比確定的前體下，依照步驟2)所述步驟富集菌體，以含有100mg/L-200mg/LTmp的BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配置不含磷源的新型培養(yǎng)基，設(shè)置0.03%,0.06%,0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同類(lèi)型的磷源，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為33°C -37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為170rpm-250rpm，分別在8_18h之內(nèi)，50ul-150ul加樣于分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳磷源種類(lèi)及其濃度；最佳磷源以及磷源的最佳濃度為 0.15% 的 KH2PO4及 0.12% 的 NaH 2P04；
7)硫源確定:在碳源、氮源、碳氮比以及磷源確定的前體下，依照步驟2)所述富集菌體，以含有100mg/L-200mg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配置不含硫源的新型培養(yǎng)基，按照0.03%,0.06%,0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同硫源，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為33°C _37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為170rpm-250rpm，分別在8-18h之內(nèi)，50ul-150ul加樣于分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳硫源種類(lèi)及其濃度；最佳硫源以及硫源的最佳濃度為0.06%的MgSO4;
8)微量元素確定:在碳源、氮源、磷源、硫源以及碳氮比確定的前提下，依照步驟2)所述富集菌體，以含有100mg/L-200mg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加或移去Cl、Fe、Mo微量元素，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為33°C -37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為170rpm_250rpm，分別在 8_18h 之內(nèi)，50ul_150ul 加樣于分析板中，在 perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定微量元素的種類(lèi)，測(cè)定結(jié)果表明有Fe無(wú)Mo時(shí)發(fā)光值最高。
[0009]所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基包括有以下組分:
磷酸鹽緩沖液 5.0mL ;MgS04 3.0mL, CaCl2 1.0mL, FeCl3 l.0mL，微量礦質(zhì)元素 LOmL0
[0010]所述的磷酸鹽緩沖液的母液包括以下組分！K2HPO4.3H20 25.82g/L，KH2PO4 8.7g/L，Na2HPO4.12H20 33.4g/L，NH4Cl 5.0go
[0011]所述的MgSO4的母液含量為22.5g/L ；CaCl 2的母液含量為36.4g/L ；FeCl 3的母液含量為0.25g/Lo
[0012]所述的微量礦質(zhì)元素包括以下組分:48mg/L的Na2MoO4,42.8mg/L的ZnSO4.H2O,34.7mg/L 的(NH4)6Mo4O24.4H20。
[0013]所述的分析板米用康寧公司3603黑色96孔的分析板。
[0014]所述的碳源包括豆油、菜籽油、甘油、葡萄糖、熒蒽、己烷、辛烷、檸檬酸鈉、蔗糖、棕櫚油和乳酸鈉，添加比例為0.5%，所述的試劑添加量固體為W/V (質(zhì)量/體積)，液體為V/V(體積/體積)。
[0015]所述的氮源包括NH4C1、NaN03、NH4N03、尿素(CON2H4),固體按照W/V (質(zhì)量/體積)添加。
[0016]所述的磷源包括NaH2P03、Na2HPO3^ Na3PO3^ KH2PO3^ K2HPO3O最佳磷源以及磷源的最佳濃度為 0.15% 的 KH2PO3及 0.12% 的 NaH 2P03。
[0017]本發(fā)明的有益效果
特定微生物分解某種有機(jī)物，從而產(chǎn)生目的產(chǎn)物的過(guò)程，即為一般的發(fā)酵過(guò)程。發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基的配方及配比以及培養(yǎng)條件的優(yōu)化對(duì)目的發(fā)酵產(chǎn)物的積累有很大的影響，根據(jù)傳統(tǒng)的方法，一般發(fā)酵過(guò)程的周期大約7-10天，因此依照傳統(tǒng)的培養(yǎng)基優(yōu)化方法，確定一套適合某種微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)優(yōu)化體系大約要90-150天。本發(fā)明利用質(zhì)粒PMS402上luxBCADE基因的發(fā)光特性，通過(guò)測(cè)定發(fā)光值來(lái)監(jiān)測(cè)銅綠假單胞菌DNl菌的累計(jì)量，從而監(jiān)測(cè)鼠李糖脂的產(chǎn)生量，依據(jù)這一原理快速確定銅綠假單胞菌高產(chǎn)鼠李糖脂的最佳培養(yǎng)基配方以及配比，形成了一套營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)快速、高通量的篩選方法。依據(jù)上述方法，可以在18-30小時(shí)內(nèi)，動(dòng)態(tài)檢測(cè)菌體的累積量，從而監(jiān)測(cè)鼠李糖脂的產(chǎn)生量。本方法與傳統(tǒng)方法相比具有快速高效的優(yōu)點(diǎn)，可在較短時(shí)間內(nèi)確定多個(gè)影響因素，同時(shí)還可同時(shí)處理多個(gè)樣品，不僅節(jié)省了大量的時(shí)間，還節(jié)省了大量的人力、物力以及降低了原材料以及實(shí)驗(yàn)試劑的損耗，該方法將大大減少菌種營(yíng)養(yǎng)體系優(yōu)化的工作量，為以后各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的篩選和培養(yǎng)基的篩選優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為pMS402質(zhì)粒圖譜。
[0019]圖2為以NaNO3S氮源時(shí)不同碳源的發(fā)光值比較圖。
[0020]圖3為以棕櫚油為碳源時(shí)不同氮源的發(fā)光值比較圖。
[0021]圖4為棕櫚油/NaNO3不同C/N發(fā)光值比較圖。
[0022]圖5為不同硫源發(fā)光值比較圖。
[0023]圖6為表面張力圖。
[0024]圖7為熒蒽降解氣相色譜圖:其中圖7 (a)為未降解的對(duì)照組圖，圖7 (b)為降解72h的實(shí)驗(yàn)組圖。
[0025]圖8為NBPLM培養(yǎng)基原油降解曲線圖示。

【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0027]實(shí)施例1
一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法，包括以下步驟:
I)在相關(guān)基因合成公司合成鼠李糖脂產(chǎn)生基因474卻勺引物，應(yīng)用PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增，合成基因片段，利用基因工程剪切、拼接技術(shù)，將基因片段連接到pMS402質(zhì)粒上的發(fā)光基因之前，構(gòu)成重組質(zhì)粒，然后將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入銅綠假單胞菌DN1，將重組菌株涂布于含有300mg/LTmp的LB固體平板上，篩選出陽(yáng)性克隆，命名該菌株為rA以沒(méi)-7^?菌株，挑選出陽(yáng)性單克隆菌落在固體LB培養(yǎng)基上富集，4°C冷藏保存?zhèn)溆茫?br> 2)取冷藏的沒(méi)-7m菌株，在含有300mg/LTmp(甲氧芐氨嘧啶)的LB固體培養(yǎng)基上活化24h，挑取單克隆，在含有l(wèi)OOmg/LTmp的LB液體培養(yǎng)基中，pH7，搖床200rpm，溫度為37°C，過(guò)夜富集菌體，將富集過(guò)的液體LB菌液8000rpm，4°C離心，去上清，用BPLM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基重懸得菌液；
3)碳源篩選:使用含有l(wèi)OOmg/LTmp的BPLM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的組分為:磷酸鹽緩沖液 5.0mL ；MgS04 3.0mL, CaCl2 1.0mL, FeCl3 1.0mL，微量礦質(zhì)元素 1.0mL，所述的磷酸鹽緩沖液的母液由 K2HPO4.3H20 25.82g/L，KH2PO4 8.7g/L，Na2HPO4.Iffi2O 33.4g/L，NH4Cl 5.0g組成，所述的MgSO4的母液含量為22.5g/L ；CaCl 2的母液含量為36.4g/L ；FeCl 3的母液含量為0.25g/L，所述的微量礦質(zhì)元素包括以下組分:48mg/L的Na2MoO4,42.8mg/L的ZnSO4.H2O, 34.7mg/L的(NH4)6Mo4O24.4Η20，添加豆油、菜籽油、甘油、葡萄糖、熒蒽、己烷、辛烷、檸檬酸鈉、蔗糖、棕櫚油和乳酸鈉，添加比例為0.5%，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為37°C，分別在8h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳碳源種類(lèi)；最佳碳源為棕櫚油；
4)氮源確定:依照步驟2)所述富集菌體，使用含有l(wèi)OOmg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基，添加不同的氮源，氮源包括NH4Cl、NaN03、NH4N03和尿素，添加比例均為0.5%，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為37°C，分別在18h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳氮源種類(lèi)；最佳氮源為NaNO3;
5)碳氮比的確定:依照步驟2)所述富集菌體，使用含有l(wèi)OOmg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基，以0.5%的添加量固定似勵(lì)3作為氮源，按碳氮比為10，20，30，40，50，60，70，80，90，100十個(gè)梯度添加不同碳源，碳源包括豆油、菜籽油、甘油、葡萄糖、熒蒽、己烷、辛烷、檸檬酸鈉、蔗糖、棕櫚油和乳酸鈉，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm離心，分別在14h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳碳氮比，最佳碳氮比為20 ；
6)磷源確定:在碳源、氮源及碳氮比確定的前體下，依照步驟2)所述步驟富集菌體，以含有100mg/L的BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配置不含磷源的新型培養(yǎng)基，設(shè)置0.03%,0.06%、0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同類(lèi)型的磷源，磷源包括NaH2P03、Na2HP03、Na3P03、KH2P03、K2HPO3,接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，分別在16h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳磷源種類(lèi)及其濃度；最佳磷源以及磷源的最佳濃度為0.15%的ΚΗ2Ρ03& 0.12%的NaH2PO3;
7)硫源確定:在碳源、氮源、碳氮比以及磷源確定的前體下，依照步驟2)所述富集菌體，以含有l(wèi)OOmg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配置不含硫源的新型培養(yǎng)基，按照0.03%,0.06%,0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同硫源，硫源包括(NH4)2SO^ MgSO4,接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，分別在14h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳硫源種類(lèi)及其濃度；最佳硫源以及硫源的最佳濃度為0.06%的MgSO4;
8)微量元素確定:在碳源、氮源、磷源、硫源以及碳氮比確定的前提下，依照步驟2)所述富集菌體，以含有l(wèi)OOmg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加或移去Cl、Fe、Mo微量元素，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，分別在1h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定微量元素的種類(lèi)，測(cè)定結(jié)果表明有Fe無(wú)Mo時(shí)發(fā)光值最高。
[0028] 實(shí)施例2
一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法，包括以下步驟:
1)在相關(guān)基因合成公司合成鼠李糖脂產(chǎn)生基因474卻勺引物，應(yīng)用PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增，合成rhlABm因片段，利用基因工程剪切、拼接技術(shù)，將rhlABm因片段連接到PMS402質(zhì)粒上的A?發(fā)光基因之前，構(gòu)成重組質(zhì)粒，然后將上述重組質(zhì)粒導(dǎo)入銅綠假單胞菌PA01，將重組菌株涂布于含有200mg/LTmp的LB固體平板上，篩選出陽(yáng)性克隆，命名該菌株為故見(jiàn)-Λ/χ菌株，挑選出陽(yáng)性單克隆菌落在固體LB培養(yǎng)基上富集，4°C冷藏保存?zhèn)溆茫?br> 2)取冷藏的菌株，在含有200mg/LTmp(甲氧芐氨嘧啶)的LB固體培養(yǎng)基上活化24h，挑取單克隆，在含有200mg/LTmp的LB液體培養(yǎng)基中，pH5，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm，溫度為33°C，過(guò)夜富集菌體，將富集過(guò)的液體LB菌液8000rpm，4°C離心，去上清，用BPLM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基重懸得菌液；
3)碳源篩選:使用含有l(wèi)OOmg/LTmp的BPLM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的組分為:磷酸鹽緩沖液 5.0mL ；MgS04 3.0mL, CaCl2 1.0mL, FeCl3 1.0mL，微量礦質(zhì)元素 1.0mL，所述的磷酸鹽緩沖液的母液由 K2HPO4.3H20 25.82g/L，KH2PO4 8.7g/L，Na2HPO4.Iffi2O 33.4g/L，NH4Cl 5.0g組成，所述的MgSO4的母液含量為22.5g/L ；CaCl 2的母液含量為36.4g/L ；FeCl 3的母液含量為0.25g/L，所述的微量礦質(zhì)元素包括以下組分:48mg/L的Na2MoO4,42.8mg/L的ZnSO4.H2O, 34.7mg/L的(NH4)6Mo4O24.4Η20，添加豆油、菜籽油、甘油、葡萄糖、熒蒽、己烷、辛烷、檸檬酸鈉、蔗糖、棕櫚油和乳酸鈉，添加比例為0.5%，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為37°C，分別在1h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳碳源種類(lèi)；最佳碳源為葡萄糖；
4)氮源確定:依照步驟2)所述富集菌體，使用含有l(wèi)OOmg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基，添加不同的氮源，氮源包括NH4Cl、NaN03、NH4N03和尿素，添加比例均為0.5%，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為37°C，分別在12h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳氮源種類(lèi)；最佳氮源為NaNO3;
5)碳氮比的確定:依照步驟2)所述富集菌體，使用含有l(wèi)OOmg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基，以0.5%的添加量固定似勵(lì)3作為氮源，按碳氮比為10，20，30，40，50，60，70，80，90，100十個(gè)梯度添加不同碳源，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm離心，在14h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳碳氮比，最佳碳氮比為40 ；
6)磷源確定:在碳源、氮源及碳氮比確定的前體下，依照步驟2)所述步驟富集菌體，以含有100mg/L的BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配置不含磷源的新型培養(yǎng)基，設(shè)置0.03%,0.06%、
0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同類(lèi)型的磷源，磷源包括NaH2P03、Na2HP03、Na3P03、KH2P03、K2HPO3,接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，分別在1h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳磷源種類(lèi)及其濃度；最佳磷源以及磷源的最佳濃度為0.09%的腿#03及0.15%的NaH2PO3;
7)硫源確定:在碳源、氮源、碳氮比以及磷源確定的前體下，依照步驟2)所述富集菌體，以含有l(wèi)OOmg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配置不含硫源的新型培養(yǎng)基，按照
0.03%,0.06%,0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同硫源，硫源包括(NH4)2SO^ MgSO4,接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，分別在12h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳硫源種類(lèi)及其濃度；最佳硫源以及硫源的最佳濃度為0.09%的MgSO4;
8)微量元素確定:在碳源、氮源、磷源、硫源以及碳氮比確定的前提下，依照步驟2)所述富集菌體，以含有100mg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加或移去Cl、Fe、Mo微量元素，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，分別在16h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定微量元素的種類(lèi)；測(cè)定結(jié)果表明有Fe無(wú)Mo時(shí)發(fā)光值最高。
[0029]表面張力的測(cè)定:
使用上述已確定成分及配比的最優(yōu)BPLM培養(yǎng)基，按照第二步a項(xiàng)所述方法富集菌體，菌液添加量為1%，330C -370C，170rpm-250rpm,搖床培養(yǎng)，分別在10h_22h之間，利用表面張力儀，每隔2h測(cè)定溶液的表面張力。結(jié)果顯示隨著時(shí)間的變化，表面張力呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，最低表面張力可達(dá)到21N/m。
[0030]原油降解實(shí)驗(yàn):
使用10ml優(yōu)化培養(yǎng)基，加入5%的原油，按照步驟2)所述方法富集菌體，接入菌液，330C -370C，170rpm-250rpm，搖床培養(yǎng)，在不同時(shí)間觀察原油的乳化及降解情況。結(jié)果表明，降解72h后，相比于M9培養(yǎng)基，NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵液對(duì)原油有明顯的乳化和沉降現(xiàn)象。
[0031]熒蒽降解實(shí)驗(yàn):
使用10ml優(yōu)化培養(yǎng)基，加入150mg/L-200mg/L的熒蒽，按照步驟2)所述方法富集菌體，接入菌液，33°C -37°C，170rpm-250rpm，搖床培養(yǎng)，每隔24h利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定熒蒽的降解量，并計(jì)算其降解率，同時(shí)將提取液進(jìn)行氣相色譜測(cè)定。紫外分光光度計(jì)測(cè)定降解率的測(cè)定結(jié)果表明，與熒蒽的初始加入量相比，第72小時(shí)時(shí)熒蒽降解了 63.5% ;氣相色譜圖像結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，第72h的峰值明顯比對(duì)照組低。
[0032]鼠李糖脂的提取
使用10ml優(yōu)化培養(yǎng)基，按照步驟2)所述方法富集菌體，接入菌液，33°C -37 °C,170rpm-250rpm,搖床培養(yǎng)7_10天，用硫酸-蒽酮顯色法測(cè)定鼠李糖脂的含量，用甲醇_氯仿萃取法提取鼠李糖脂，并通過(guò)質(zhì)量差計(jì)算提出的鼠李糖脂的含量。硫酸-蒽酮顯色法及甲醇-氯仿提取法結(jié)果同時(shí)表明第九天時(shí)發(fā)酵液內(nèi)鼠李糖脂含量達(dá)到17.6g/L。
[0033]參見(jiàn)圖1，圖1為本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒pMS402，圖中該質(zhì)粒上含有發(fā)光基因，BamHlJk.酶切位點(diǎn)。pMS402質(zhì)粒:oril及ori2為復(fù)制起始位點(diǎn)；Terminator為終止子；BamHl及Xhol為限制性酶切位點(diǎn)；luxCDABE為發(fā)光報(bào)道基因；dhfR II為T(mén)mp(甲氧芐氨嘧啶)抗性基因，Kan為卡那霉素抗性基因。圖中粗箭頭表示多克隆位點(diǎn)MCS，用于外源基因的插入，箭頭方向表示外源基因轉(zhuǎn)錄的方向，由啟動(dòng)子指向終止子。
[0034]參見(jiàn)圖2，圖2為NaNO3S固定氮源時(shí)不同碳源的發(fā)光值比較圖示，以NaNO 3為氮源，棕櫚油為碳源時(shí)發(fā)光值最高，因此最佳碳源為棕櫚油。
[0035]參見(jiàn)圖3，圖3為棕櫚油作為固定碳源時(shí)不同氮源的發(fā)光值比較圖，以棕櫚油為碳源，NaNO3S氮源時(shí)發(fā)光值最高，因此最佳氮源為NaNO 3。
[0036]參見(jiàn)圖4，圖4為棕櫚油為碳源，NaNO3S氮源時(shí)，不同碳氮比的發(fā)光值比較圖，當(dāng)棕櫚油/似勵(lì)3的C/N為20時(shí)，發(fā)光值最高，因此最佳碳氮比為20。
[0037]參見(jiàn)圖5，圖5為不同硫源的發(fā)光值比較圖，M0.03為添加濃度為0.03%的MgSO4,依此類(lèi)推，N0.03為添加濃度為0.03%的(NH4)2SO4,依此類(lèi)推，如上圖所示，當(dāng)添加0.06%的1%504或0.03%的(NH 4)#04時(shí)發(fā)光值最高，因此最佳硫源為0.06%的MgSO 4或0.03%的(NH4)2SO40
[0038]參見(jiàn)圖6，圖6為NBPLM培養(yǎng)基表面張力變化圖，以?xún)?yōu)化的BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，銅綠假單胞菌DNl為研宄菌株，10-34小時(shí)內(nèi)表面張力的變化圖示，圖示中NB表示優(yōu)化的BPLM培養(yǎng)基，DZ表示無(wú)菌對(duì)照，圖示表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的表面張力有明顯的降低。
[0039]參見(jiàn)圖7，圖7熒蒽降解氣相色譜圖，圖7 Ca)為未降解的對(duì)照組，圖7 (b)為降解72h的實(shí)驗(yàn)組，如圖標(biāo)注所示，與對(duì)照組相比，在11.445分鐘時(shí)熒蒽的最高峰已基本完全降解。
[0040]參見(jiàn)圖8，圖8為NBPLM培養(yǎng)基原油降解曲線圖示，如圖所示，搖床培養(yǎng)14天后原油降解率達(dá)到95.7%。
【權(quán)利要求】
1.一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法，其特征在于，包括以下步驟: .O合成鼠李糖脂產(chǎn)生基因474卻勺引物，應(yīng)用PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增，合成基因片段，利用基因工程剪切、拼接技術(shù)，將基因片段連接到pMS402質(zhì)粒上的7狀發(fā)光基因之前，構(gòu)成重組質(zhì)粒，然后將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入銅綠假單胞菌DN1，將重組菌株涂布于含有200mg/L-300mg/LTmp的LB固體平板上，篩選出陽(yáng)性克隆，命名該菌株為沒(méi)-7m菌株，挑選出陽(yáng)性單克隆菌落在固體LB培養(yǎng)基上富集，4°C冷藏保存?zhèn)溆茫? .2)取冷藏的沒(méi)-7m菌株，在含有200mg/L-300mg/LTmp(甲氧芐氨嘧啶)的LB固體培養(yǎng)基上活化24h，挑取單克隆，在含有100mg/L-200mg/LTmp的LB液體培養(yǎng)基中，pH5_7，搖床轉(zhuǎn)速為170rpm-250rpm，溫度為33°C _37°C，過(guò)夜富集菌體，將富集過(guò)的液體LB菌液8000rpm，4°C離心，去上清，BPLM無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸得菌液； .3)碳源篩選:使用含有100mg/L-200mg/LTmp的BPLM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，添加不同的碳源，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，搖床轉(zhuǎn)速為170rpm-250rpm，溫度為33°C -37°C,分別在8-18h之內(nèi)，50ul-150ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkinelmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳碳源種類(lèi)；最佳碳源為棕櫚油； .4)氮源確定:依照步驟2)所述富集菌體，使用含有100mg/L-200mg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基，添加不同的氮源，添加比例均為0.5%，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，搖床轉(zhuǎn)速為170rpm-250rpm，溫度為33°C _37°C，分別在8_18h之內(nèi)，50ul_150ul加樣于分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳氮源種類(lèi)；最佳氮源為NaNO3; .5)碳氮比的確定:依照步驟2)所述富集菌體，使用含有100mg/L-200mg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基，以0.5%的添加量固定一種氮源，按碳氮比為10，20，30，40，50，60，70，80，90，100十個(gè)梯度添加不同碳源，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為33°C -37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為170rpm-250rpm，分別在8_18h之內(nèi)，50ul_150ul加樣于分析板中，在perkinelmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳碳氮比；最佳C/N為20 ； .6)磷源確定:在碳源、氮源及碳氮比確定的前體下，依照步驟2)所述步驟富集菌體，以含有100mg/L-200mg/LTmp的BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配置不含磷源的新型培養(yǎng)基，設(shè)0.03%,0.06%,0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同類(lèi)型的磷源，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為33°C -37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為170rpm-250rpm，分別在8_18h之內(nèi)，50ul-150ul加樣于分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳磷源種類(lèi)及其濃度；最佳磷源以及磷源的最佳濃度為 0.15% 的 KH2PO4及 0.12% 的 NaH 2P04； .7)硫源確定:在碳源、氮源、碳氮比以及磷源確定的前體下，依照步驟2)所述富集菌體，以含有100mg/L-200mg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配置不含硫源的新型培養(yǎng)基，按照0.03%,0.06%,0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同硫源，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為33°C _37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為170rpm-250rpm，分別在8-18h之內(nèi)，50ul-150ul加樣于分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳硫源種類(lèi)及其濃度；最佳硫源以及硫源的最佳濃度為0.06%的MgSO4; .8)微量元素確定:在碳源、氮源、磷源、硫源以及碳氮比確定的前提下，依照步驟2)所述富集菌體，以含有100mg/L-200mg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加或移去Cl、Fe、Mo微量元素，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為33°C -37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為170rpm_250rpm，分別在 8_18h 之內(nèi)，50ul_150ul 加樣于分析板中，在 perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定微量元素的種類(lèi)，測(cè)定結(jié)果表明有Fe無(wú)Mo時(shí)發(fā)光值最高。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法，其特征在于，所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基包括有以下組分:磷酸鹽緩沖液5.0mL ；MgS04 3.0mL, CaCl21.0mL, FeCl3 1.0mL，微量礦質(zhì)元素 1.0mL0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法，其特征在于，所述的磷酸鹽緩沖液的母液包括以下組分:K2HP04.3H20 25.82g/L，KH2PO4 8.7g/L，Na2HPO4.12H20 33.4g/L，NH4Cl 5.0g0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法，其特征在于，所述的MgSO4的母液含量為22.5g/L ；CaCl 2的母液含量為36.4g/L ；FeCl 3的母液含量為 0.25g/Lo
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法，其特征在于，所述的微量礦質(zhì)元素包括以下組分:48mg/L的Na2MoO4,42.8mg/L的ZnSO4.H2O,34.7mg/L 的(NH4)6Mo4O24.4H20。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法，其特征在于，所述的分析板采用康寧公司3603黑色96孔的分析板。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法，其特征在于，所述的碳源包括豆油、菜籽油、甘油、葡萄糖、熒蒽、己烷、辛烷、檸檬酸鈉、蔗糖、棕櫚油和乳酸鈉，其添加比例為0.5%，固體按照W/V (質(zhì)量/體積)添加，液體按照V/V (體積/體積)添加。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法，其特征在于，所述的氮源為氯化銨、硝酸鈉、硝酸銨和尿素，其添加比例為0.5%，固體按照W/V (質(zhì)量/體積)添加。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法，其特征在于，包括以下步驟: .1)在相關(guān)基因合成公司合成鼠李糖脂產(chǎn)生基因474卻勺引物，應(yīng)用PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增，合成基因片段，利用基因工程剪切、拼接技術(shù)，將基因片段連接到pMS402質(zhì)粒上的發(fā)光基因之前，構(gòu)成重組質(zhì)粒，然后將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入銅綠假單胞菌DN1，將重組菌株涂布于含有300mg/LTmp的LB固體平板上，篩選出陽(yáng)性克隆，命名該菌株為rA以沒(méi)-7^?菌株，挑選出陽(yáng)性單克隆菌落在固體LB培養(yǎng)基上富集，4°C冷藏保存?zhèn)溆茫?. 2)取冷藏的沒(méi)-7m菌株，在含有300mg/LTmp(甲氧芐氨嘧啶)的LB固體培養(yǎng)基上活化24h，挑取單克隆，在含有100mg/LTmp的LB液體培養(yǎng)基中，pH7，搖床200rpm，溫度為37°C，過(guò)夜富集菌體，將富集過(guò)的液體LB菌液8000rpm，4°C離心，去上清，用BPLM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基重懸得菌液； .3)碳源篩選:使用含有l(wèi)OOmg/LTmp的BPLM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的組分為:磷酸鹽緩沖液 5.0mL ；MgS04 3.0mL, CaCl2 1.0mL, FeCl3 1.0mL，微量礦質(zhì)元素 1.0mL，所述的磷酸鹽緩沖液的母液由 K2HPO4.3H20 25.82g/L，KH2PO4 8.7g/L，Na2HPO4.Iffi2O 33.4g/L，NH4Cl 5.0g組成，所述的MgSO4的母液含量為22.5g/L ；CaCl 2的母液含量為36.4g/L ；FeCl 3的母液含量為0.25g/L，所述的微量礦質(zhì)元素包括以下組分:48mg/L的Na2MoO4,42.8mg/L的ZnSO4.H2O, 34.7mg/L的(NH4)6Mo4O24.4Η20，添加豆油、菜籽油、甘油、葡萄糖、熒蒽、己烷、辛烷、檸檬酸鈉、蔗糖、棕櫚油和乳酸鈉，添加比例為0.5%，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為37°C，分別在8h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳碳源種類(lèi)；最佳碳源為棕櫚油； .4)氮源確定:依照步驟2)所述富集菌體，使用含有l(wèi)OOmg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基，添加不同的氮源，氮源包括NH4Cl、NaN03、NH4N03和尿素，添加比例均為0.5%，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為37°C，分別在18h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳氮源種類(lèi)；最佳氮源為NaNO3; .5)碳氮比的確定:依照步驟2)所述富集菌體，使用含有l(wèi)OOmg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基，以0.5%的添加量固定似勵(lì)3作為氮源，按碳氮比為10，20，30，40，50，60，70，80，90，100十個(gè)梯度添加不同碳源，碳源包括豆油、菜籽油、甘油、葡萄糖、熒蒽、己烷、辛烷、檸檬酸鈉、蔗糖、棕櫚油和乳酸鈉，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm離心，分別在14h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳碳氮比，最佳碳氮比為20 ； .6)磷源確定:在碳源、氮源及碳氮比確定的前體下，依照步驟2)所述富集菌體，以含有100mg/L的BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配置不含磷源的新型培養(yǎng)基，設(shè)置0.03%、0.06%、0.09%、0.12%、0.15% 的梯度添加不同類(lèi)型的磷源，磷源包括 NaH2P03、Na2HP03、Na3P03、KH2P03、K2HP03，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，分別在16h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳磷源種類(lèi)及其濃度；最佳磷源以及磷源的最佳濃度為0.15%的ΚΗ2Ρ03& 0.12%的NaH2PO3; .7)硫源確定:在碳源、氮源、碳氮比以及磷源確定的前體下，依照步驟2)所述富集菌體，以含有l(wèi)OOmg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配置不含硫源的新型培養(yǎng)基，按照0.03%,0.06%,0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同硫源，硫源包括(NH4)2SO^ MgSO4,接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，分別在14h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳硫源種類(lèi)及其濃度；最佳硫源以及硫源的最佳濃度為0.06%的MgSO4; .8)微量元素確定:在碳源、氮源、磷源、硫源以及碳氮比確定的前提下，依照步驟2)所述富集菌體，以含有l(wèi)OOmg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加或移去Cl、Fe、Mo微量元素，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，分別在1h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定微量元素的種類(lèi)，測(cè)定結(jié)果表明有Fe無(wú)Mo時(shí)發(fā)光值最高。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速高效篩選鼠李糖脂產(chǎn)生菌營(yíng)養(yǎng)體系的方法，其特征在于，包括以下步驟: . 1)在相關(guān)基因合成公司合成鼠李糖脂產(chǎn)生基因474卻勺引物，應(yīng)用PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增，合成rhlAB基因片段，利用基因工程剪切、拼接技術(shù)，將rhlABm因片段連接到PMS402質(zhì)粒上的發(fā)光基因之前，構(gòu)成重組質(zhì)粒，然后將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入銅綠假單胞菌PA01，將重組菌株涂布于含有200mg/LTmp的LB固體平板上，篩選出陽(yáng)性克隆，命名該菌株為rA以沒(méi)-7^?菌株，挑選出陽(yáng)性單克隆菌落在固體LB培養(yǎng)基上富集，4°C冷藏保存?zhèn)溆茫?. 2)取冷藏的PAOl-1ux菌株，在含有200mg/LTmp的LB固體培養(yǎng)基上活化24h，挑取單克隆，在含有200mg/LTmp的LB液體培養(yǎng)基中，pH5，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm，溫度為33°C，過(guò)夜富集菌體，將富集過(guò)的液體LB菌液8000rpm，4°C離心，去上清，用BPLM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基重懸得菌液； .3)碳源篩選:使用含有l(wèi)OOmg/LTmp的BPLM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的組分為:磷酸鹽緩沖液 5.0mL ；MgS04 3.0mL, CaCl2 1.0mL, FeCl3 1.0mL，微量礦質(zhì)元素 1.0mL，所述的磷酸鹽緩沖液的母液由 K2HPO4.3H20 25.82g/L，KH2PO4 8.7g/L，Na2HPO4.Iffi2O 33.4g/L，NH4Cl 5.0g組成，所述的MgSO4的母液含量為22.5g/L ；CaCl 2的母液含量為36.4g/L ；FeCl 3的母液含量為0.25g/L，所述的微量礦質(zhì)元素包括以下組分:48mg/L的Na2MoO4,42.8mg/L的ZnSO4.H2O, 34.7mg/L的(NH4)6Mo4O24.4Η20，添加豆油、菜籽油、甘油、葡萄糖、熒蒽、己烷、辛烷、檸檬酸鈉、蔗糖、棕櫚油和乳酸鈉，添加比例為0.5%，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為37°C，分別在1h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳碳源種類(lèi)；最佳碳源為葡萄糖； . 4)氮源確定:依照步驟2)所述富集菌體，使用含有l(wèi)OOmg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基，添加不同的氮源，氮源包括NH4Cl、NaN03、NH4N03和尿素，添加比例均為0.5%，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為37°C，分別在12h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳氮源種類(lèi)；最佳氮源為NaNO3; . 5)碳氮比的確定:依照步驟2)所述富集菌體，使用含有l(wèi)OOmg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基，以0.5%的添加量固定似勵(lì)3作為氮源，按碳氮比為10，20，30，40，50，60，70，80，90，100十個(gè)梯度添加不同碳源，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm離心，在14h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICT0R3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳碳氮比，最佳碳氮比為40 ； .6)磷源確定:在碳源、氮源及碳氮比確定的前體下，依照步驟2)所述步驟富集菌體，以含有100mg/L的BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配置不含磷源的新型培養(yǎng)基，設(shè)置0.03%,0.06%、0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同類(lèi)型的磷源，磷源包括NaH2P03、Na2HP03、Na3P03、KH2P03、K2HPO3,接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，分別在1h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳磷源種類(lèi)及其濃度；最佳磷源以及磷源的最佳濃度為0.09%的腿#03及0.15%的NaH2PO3; .7)硫源確定:在碳源、氮源、碳氮比以及磷源確定的前體下，依照步驟2)所述富集菌體，以含有l(wèi)OOmg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配置不含硫源的新型培養(yǎng)基，按照0.03%,0.06%,0.09%,0.12%、0.15%的梯度添加不同硫源，硫源包括(NH4)2SO^ MgSO4,接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，分別在12h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定最佳硫源種類(lèi)及其濃度；最佳硫源以及硫源的最佳濃度為0.09%的MgSO4; .8)微量元素確定:在碳源、氮源、磷源、硫源以及碳氮比確定的前提下，依照步驟2)所述富集菌體，以含有l(wèi)OOmg/LTmp的基礎(chǔ)BPLM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加或移去Cl、Fe、Mo微量元素，接入步驟2)所述菌液，菌液添加量為1%，溫度為37°C，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，分別在16h之內(nèi)，10ul加樣于康寧公司3603黑色96孔的分析板中，在perkin elmerVICTOR3多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定發(fā)光值，發(fā)光值越大則表明鼠李糖脂產(chǎn)生越多，依此確定微量元素的種類(lèi)，測(cè)定結(jié)果表明有Fe無(wú)Mo時(shí)發(fā)光值最高。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK104498526SQ201510010814
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2015年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月9日
【發(fā)明者】馬艷玲, 陳富林, 羅娜, 薛姝雯, 李晶 申請(qǐng)人:西北大學(xué)