黃牛plin2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了黃牛PLIN2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒，以包含PLIN2基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛PLIN2基因；再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小；然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行變性后，再對(duì)變性后的擴(kuò)增片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。該方法在DNA水平上篩查和檢測(cè)與黃牛生長(zhǎng)發(fā)育性狀密切相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，以用于黃牛的輔助選擇和分子育種，加快黃牛良種繁育速度。
【專利說(shuō)明】黃牛PLIN2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)方法及檢測(cè)試 劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因單核苷酸多態(tài)性（SNP)的檢測(cè)，特別涉及黃牛PLIN2基因單核苷 酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，牛肉以其蛋白質(zhì)含量高、低膽固醇、低脂肪、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)越來(lái)越受到 到人們的重視?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)指出牛肉可以益氣健胃、強(qiáng)健筋骨、止咳化痰，說(shuō)明其還具有優(yōu) 良的滋補(bǔ)保健作用。隨著近年來(lái)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、收入水平的提高，人們對(duì)牛肉質(zhì)量的重視達(dá)到 了前所未有的高度，如何進(jìn)一步提高牛肉的肉用性能成了廣大研究人員的新課題，優(yōu)質(zhì)肉 牛的生產(chǎn)正成為一個(gè)新興產(chǎn)業(yè)。
[0003] 我國(guó)地方黃牛品種資源豐富，其中，有28個(gè)地方黃牛品種、育成品種4個(gè)，是世界 上牛種最多的國(guó)家。雖然這些品種肉質(zhì)良好、抗病性強(qiáng)、飼料利用轉(zhuǎn)化率高、遺傳穩(wěn)定、適應(yīng) 能力強(qiáng)，但是長(zhǎng)期以來(lái)我國(guó)的地方黃牛一直以役用為主。盡管牛種很多，但相對(duì)國(guó)外優(yōu)質(zhì)牛 種，我國(guó)的黃牛品種體格偏小，后驅(qū)不發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)速度慢、屠宰率和凈肉率偏低，滿足不了現(xiàn) 代肉牛生產(chǎn)規(guī)?；l(fā)展的要求。因此，對(duì)我國(guó)地方優(yōu)良黃牛生長(zhǎng)性狀的選育勢(shì)在必行，只有 達(dá)到了高產(chǎn)與優(yōu)質(zhì)相統(tǒng)一，才能使我國(guó)的肉牛品種趕超歐美等國(guó)的優(yōu)質(zhì)肉牛品種。
[0004] 肉用性狀是典型的、具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的數(shù)量性狀，受環(huán)境因素影響較大，用常規(guī) 育種方法進(jìn)行育種進(jìn)展緩慢。20世紀(jì)80年代后期以來(lái)，國(guó)際上的動(dòng)物遺傳育種已經(jīng)進(jìn)入分 子水平，即分子育種，使育種朝著快速改變動(dòng)物基因型的方向發(fā)展。近幾年來(lái)，由于分子生 物學(xué)和各種分子生物技術(shù)的發(fā)展，使人們又可能直接從遺傳物質(zhì)本身的基礎(chǔ)上揭示生物的 性狀特征，它與基因產(chǎn)物的研究相比克服了年齡、性別、組織及各種內(nèi)外環(huán)境因素的影響， 而且所提供的遺傳差異，即遺傳標(biāo)記的種類又非常多，如微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記的種類也越來(lái)越 多，因此，分子育種越來(lái)越受到人們的重視。在20世紀(jì)90年代中期以后，我國(guó)逐漸開(kāi)展了 黃牛肉用性能的分子遺傳學(xué)研究。采用基因標(biāo)記等現(xiàn)代分子育種新技術(shù)結(jié)合常規(guī)育種，以 便能夠加快中國(guó)肉牛品種的培育和選育。
[0005] SSCP(single strand comformation polymorphism)即單鏈構(gòu)象多態(tài)性。 PCR-SSCP技術(shù)是PCR技術(shù)和SSCP技術(shù)的結(jié)合，其原理是變性后的產(chǎn)物在電泳時(shí)，空間構(gòu)象 不同的單鏈DNA會(huì)因其遷移率不同而得到分離，從而檢測(cè)相應(yīng)的遺傳變異。這項(xiàng)技術(shù)具有 簡(jiǎn)便、快速、敏感和經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，適用于大樣本基因變異情況的篩查。
[0006] 現(xiàn)代禽畜育種的主要目的就是改善肉牛的肉質(zhì)或提高肉牛生長(zhǎng)速度，如何加快選 育進(jìn)程，提高選擇的準(zhǔn)確性，是我國(guó)育種工作者多年不懈努力和共同追求的目標(biāo)。而一系列 的研究發(fā)現(xiàn)PLIN2基因與脂肪的沉積與代謝相關(guān)，間接的與體重、胸圍等生長(zhǎng)性狀存在連 鎖關(guān)系，是與能量平衡調(diào)控密切相關(guān)的重要候選基因。研究該基因的分子遺傳基礎(chǔ)與經(jīng)濟(jì) 性狀之間的相關(guān)性，對(duì)于改善我國(guó)的肉牛育種工作具有促進(jìn)作用，也具有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值 和重要的科學(xué)意義。
[0007] PLIN2來(lái)源于一組序列相似、可以與脂滴結(jié)合的蛋白家族成員。研究人員將已經(jīng)確 定的脂滴包被蛋白（perilipin或PLIN1)、脂肪分化相關(guān)蛋白（ADRP或PLIN2)和47kDa的 尾連互作蛋白（TIP47或PLIN3)三個(gè)成員，取每個(gè)蛋白名字的首個(gè)字母，統(tǒng)稱它們?yōu)?PAT" 家族蛋白。PAT家族的進(jìn)化樹(shù)相當(dāng)古老，其家族成員存在于許多動(dòng)物物種中（如青蛙和蒼 蠅），甚至在真菌、粘菌中也有它們的身影。該蛋白家族的保守性表明了其在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)脂 肪沉積存儲(chǔ)的重要地位。
[0008] 脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程中，PLIN2蛋白含量及其mRNA含量不斷降低。而PLINl的 mRNA含量及其蛋白質(zhì)含量不斷升高。反之，早期的細(xì)胞系含有大量PLIN2包被的小脂滴， 成熟的細(xì)胞含有PLINl包被的大脂滴。因此，PLIN2和PLINl通常被認(rèn)為是脂質(zhì)包裹蛋白 CPATs的基本要素，但在脂肪細(xì)胞中PLINl會(huì)和PLIN2競(jìng)爭(zhēng)與脂滴相結(jié)合。但是PLINl只能 分布在有限的組織細(xì)胞中（脂肪細(xì)胞、類固醇生成的細(xì)胞和巨噬細(xì)胞），PLIN2可以在除成 熟的人類脂肪細(xì)胞外的其他許多積累脂肪的細(xì)胞中存在。可見(jiàn)其對(duì)前脂肪細(xì)胞的早期分化 具有重要的作用。
[0009] 關(guān)于動(dòng)物PLIN2基因遺傳變異的研究國(guó)內(nèi)外多見(jiàn)于人、鼠等動(dòng)物，還未見(jiàn)黃牛 PLIN2基因遺傳變異或SNP研究的報(bào)道。由于目前黃牛PLIN2基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱 乏，使該基因位點(diǎn)的功能研究及該基因遺傳變異與經(jīng)濟(jì)性狀（如：生長(zhǎng)發(fā)育性狀、肌內(nèi)脂肪 沉積性狀）關(guān)聯(lián)的研究成為空白。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明目的在于提供一種黃牛PLIN2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)方法及檢 測(cè)試劑盒，以加快黃牛良種繁育速度。
[0011] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0012] 黃牛PLIN2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0013] (1)以待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛PLIN2基 因部分序列；
[0014] 所述的引物對(duì)P為：
[0015] 上游引物 P1(SEQ. ID.N0. 1) :5, TGATGATGGCTGGTTTACA 3,；
[0016] 下游引物 P2 (SEQ. ID. NO. 2) :5' TCCAGCCAGGACAGATAGA 3'
[0017] (2)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè)：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性劑變性處理后進(jìn)行聚丙 烯酰胺凝膠電泳，然后根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果結(jié)合測(cè)序判定多態(tài)性位點(diǎn)的基因型， 所述多態(tài)性位點(diǎn)為：
[0018] 在黃牛PLIN2基因第6458位為G或T的堿基多態(tài)性位點(diǎn)，表現(xiàn)為GG、GT以及TT 二種基因型。
[0019] 所述的？0?擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?51：預(yù)變性51^11;941：變性458,58.71：退火458， 72°C延伸60s，34個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0020] 所述聚丙烯酰胺凝膠電泳采用10%的聚丙烯酰胺凝膠。
[0021] 所述變性處理包括以下步驟：取4 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與6 μ L SSCP變性劑混合，然 后于98°C變性lOmin，然后再冰浴5min。
[0022] 黃牛PLIN2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒，包括引物對(duì)P，所述的引物對(duì) P為：
[0023] 上游引物 P1(SEQ. ID.NO. 1) :5' TGATGATGGCTGGTTTACA 3' ；
[0024] 下游引物 P2 (SEQ. ID. NO. 2) : 5 ' TCCAGCCAGGACAGATAGA 3 '。
[0025]
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
[0027] 本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)特定的PCR引物擴(kuò)增片段，運(yùn)用SSCP方法并結(jié)合DNA測(cè)序方法， 簡(jiǎn)單、快速、低成本、精確的檢測(cè)其單核苷酸的多態(tài)性，為PLIN2基因的SNP與體尺性狀關(guān)系 的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國(guó)黃牛標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1為黃牛血樣基因組DNA電泳檢測(cè)圖。
[0029] 圖2為黃牛PLIN2基因第6外顯子176bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1%的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0030] 圖3為黃牛PLIN2基因第6外顯子176bp PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè) PLIN2基因多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；泳道1、2、4、6、8為GG基因型個(gè)體；泳道3為GT基因型個(gè) 體；泳道5、7為TT基因型個(gè)體。
[0031] 圖4為黃牛PLIN2基因 SNP的不同基因型測(cè)序峰圖，箭頭所指代表PLIN2基因第 6458位SNP的位置及不同的基因型表現(xiàn)。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限 定。
[0033] 本發(fā)明以PLIN2基因保守序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增PLIN2基因第6外顯子176bp片段， 分別以4種黃牛品種的基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物純化，經(jīng)SSCP分析和測(cè) 序后尋找該擴(kuò)增片段的單核苷酸多態(tài)；針對(duì)發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)性分析，并 提供其檢測(cè)方法，使得PLIN2基因的核苷酸多態(tài)性成為一種能夠快速、方便檢測(cè)的分子遺 傳標(biāo)記，為加快建立具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀的黃牛種群提供依據(jù)。
[0034] a、黃牛PLIN2基因部分DNA序列的擴(kuò)增及其多態(tài)性的檢測(cè)
[0035] 1、黃牛血樣的采集及處理
[0036] 取黃牛血樣10mL，加入0. 5mol/L的EDTA 500 μ L抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰 盒，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0037] 本發(fā)明采用了 4個(gè)黃牛品種，具體如表1所示。
[0038] 表1黃牛樣品來(lái)源表
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 黃牛PLIN2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于：包括以下步驟： ⑴以待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛PLIN2基因部 分序列； 所述的引物對(duì)P為： 上游引物 P1 :5' TGATGATGGCTGGITTACA 3' ； 下游引物 P2 :5' TCCAGCCAGGACAGATAGA 3' (2)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè)：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性劑變性處理后進(jìn)行聚丙烯酰 胺凝膠電泳，然后根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果結(jié)合測(cè)序判定多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，所述 多態(tài)性位點(diǎn)為： 在黃牛PLIN2基因第6458位為G或T的堿基多態(tài)性位點(diǎn)，表現(xiàn)為GG、GT以及TT三種 基因型。
2. 如權(quán)利要求1所述黃牛PLIN2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于：所述的？〇?擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?51：預(yù)變性51^11;941：變性458,58.71：退火458,721：延伸 6〇8,34個(gè)循環(huán)；最后721：延伸1〇111111。
3. 如權(quán)利要求1所述黃牛PLIN2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝膠電泳采用10%的聚丙烯酰胺凝膠。
4. 如權(quán)利要求1所述黃牛PLIN2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于：所述變性處理包括以下步驟：取4 ii L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與6 ii L SSCP變性劑混合，然后于98°C 變性lOmin，然后再冰浴5min。
5. 黃牛PLIN2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒，其特征在于：包括引物對(duì)P，所 述的引物對(duì)P為： 上游引物 P1 :5' TGATGATGGCTGGITTACA 3' ； 下游引物 P2 :5' TCCAGCCAGGACAGATAGA 3'。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104480212SQ201410812179
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月22日
【發(fā)明者】陳宏 , 邵斯旻, 張春雷, 房興堂, 高曉猛, 李景景, 張海燕 申請(qǐng)人:江蘇師范大學(xué)