山羊 lmcd1 基因單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了山羊LMCD1基因單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方法及檢測試劑盒，以包含LMCD1基因的待測山羊全基因組DNA為模板，PCR擴增山羊LMCD1基因，然后進行SSCP多態(tài)性的檢測。其基因多態(tài)性位點包括：在山羊的LMCD1基因第681位為A或G的堿基多態(tài)性；在山羊的LMCD1基因第2825位為C或T的堿基多態(tài)性。本發(fā)明提供了一種簡單、快速、低成本、精確度高的檢測方法，便于推廣應用在DNA水平上篩查和檢測與山羊生長性狀密切相關(guān)的遺傳標記，可用于山羊的輔助選擇和分子育種。
【專利說明】山羊LMCD1基因單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方法及檢測試 劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因單核苷酸多態(tài)性（SNP)的檢測，特別涉及山羊LMCD1基因單核苷 酸多態(tài)性位點的檢測。

【背景技術(shù)】
[0002] 單核苷酸多態(tài)性（SNP)指基因組DNA序列中由于單個核苷酸（A/T/C/G)的替換而 引起的多態(tài)性，主要由單個堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起。具有轉(zhuǎn)換型變異的SNPs約占2/3， 其他幾種SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發(fā)生突變的位點，其 中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。
[0003] 根據(jù)對遺傳性狀的影響，基因多態(tài)性又可分為兩種：一種是同義突變多態(tài)性，即 SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)中氨基酸序列，突變堿基與未突變堿 基的"含義"相同；另一種是非同義突變多態(tài)性，即堿基序列的改變將導致編碼氨基酸的改 變，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。因此，對編碼區(qū)SNPs的非 同義突變來說，它們可能對基因功能有直接的重要影響；尤其對于無義密碼子突變來說，更 可能會導致所編碼的蛋白發(fā)生重大變化，從而影響它的功能發(fā)揮，對個體的表現(xiàn)型產(chǎn)生重 要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的 研究中也具有重要意義。
[0004] 近年來，人們發(fā)展了許多用于探尋分子遺傳標記的方法，最常見的有單鏈構(gòu)象多 態(tài)技術(shù)（SSCP)、PCR-RFLP和直接測序技術(shù)等。SSCP可以發(fā)現(xiàn)靶DNA片段中未知位置的堿 基突變。Takao經(jīng)實驗證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發(fā)現(xiàn)，他 認為現(xiàn)在知道的所有單堿基改變絕大多數(shù)可用該方法檢測出來。另外，SSCP方法可通過聚 丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進一步提純。用這種方 法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。該方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的 儀器。
[0005] LM結(jié)構(gòu)域蛋白是細胞調(diào)控結(jié)構(gòu)的主要成分，對細胞生長、細胞命運決定、細胞分 化以及細胞骨架的形成有重要作用。LIM結(jié)構(gòu)域是一個鋅指結(jié)構(gòu)，存在于多種類型的蛋白 中，包括同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，激酶以及由幾個LIM結(jié)構(gòu)域組成的蛋白。該結(jié)構(gòu)域蛋白對肌 肉相關(guān)基因的調(diào)控起作用，LIM基因突變或者缺陷導致肌肉、神經(jīng)、心血管以及垂體等組織 細胞的分化與發(fā)育障礙。LMCD1基因?qū)儆贚IM結(jié)構(gòu)域蛋白基因，在骨骼肌中豐度表達，表明 該基因可能參與骨骼肌蛋白質(zhì)相互作用。LMCD1基因是對心臟肥大以及纖維癥起作用的關(guān) 鍵性信號分子。LMCD1使得神經(jīng)鈣蛋白活化，活化的神經(jīng)鈣蛋白直接與活化的T細胞核因 子（NFAT)結(jié)合，導致NFAT脫磷酸化以及核轉(zhuǎn)運，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶調(diào)節(jié)蛋白l(MCIPl)是心 肌癥calcineurin/NFAT信號轉(zhuǎn)導的直接轉(zhuǎn)錄目標，NFAT與MCIP1結(jié)合，并促進導致心臟肥 大的基因表達。
[0006] 目前，關(guān)于LMCD1基因在病理學上研究主要是心臟肥大與壓力負荷過大誘導的心 臟纖維癥，以及該基因變異引起的肝細胞癌中細胞遷移和瘤轉(zhuǎn)移。關(guān)于LMCD1基因在家畜 上的研究表明該基因的變異與豬的背膘、瘦肉率以及肥肉率顯著相關(guān)，有利于育種選擇。山 羊LMCD1基因多態(tài)性及其生長性狀相關(guān)性的研究迄今沒有報道。目前亟需提供一種檢測方 法為LMCD1基因SNP與體尺性狀關(guān)系的建立奠定了基礎，以便用于中國山羊生長性狀的標 記輔助選擇（MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的山羊種群。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種山羊LMCD1基因單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方法及 檢測試劑盒，以加快良種選育速度和提高種群品質(zhì)。
[0008] 為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0009] 山羊LMCD1基因單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方法，包括以下步驟：
[0010] ⑴以待測山羊全基因組DNA為模板，以引物對P1或引物對P2為引物，PCR擴增 山羊LMCD1基因中對應包含第681位的部分序列或包含2825位的部分序列；
[0011] 所述的引物對pis:
[0012] 上游引物 Pla(SEQ. ID. NO. 1) :5' CCTTCAGGAGCGTTTGGACT 3'
[0013] 下游引物 Plb (SEQ. ID. NO. 2) : 5' GCACAACTGGGCITTGGAIT 3'
[0014] 所述的引物對P2為：
[0015] 上游引物 P2a (SEQ. ID. NO. 3) : 5 ' GGTCCTCACCTCATCACAGC 3 '
[0016] 下游引物 P2b (SEQ. ID. NO. 4) : 5' ACTTCAGTCCTCACAACTCCCT 3'
[0017] (2)對PCR擴增產(chǎn)物進行SSCP檢測：PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)變性劑變性處理后進行聚丙 烯酰胺凝膠電泳，然后根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果判定多態(tài)性位點的基因型，所述多態(tài) 性位點為：
[0018] 在山羊的LMCD1基因第681位為A或G的堿基多態(tài)性位點，表現(xiàn)為AA以及AG兩 種基因型；
[0019] 在山羊的LMCD1基因第2825位為C或T的堿基多態(tài)性位點，表現(xiàn)為CC以及CT兩 種基因型。
[0020] 所述的PCR擴增的反應程序為：94°C預變性5min ;94°C變性30s，58°C退火40s， 72°C延伸40-60s，35個循環(huán)；最后72°C延伸10min，4°C保存。
[0021] 所述聚丙烯酰胺凝膠電泳采用10%的聚丙烯酰胺凝膠。
[0022] 山羊LMCD1基因單核苷酸多態(tài)性位點的試劑盒，包括引物對P1或引物對P2,所述 的引物對P1為：
[0023] 上游引物 Pla(SEQ. ID. NO. 1) : 5' CCTTCAGGAGCGTTTGGACT 3'
[0024] 下游引物 Plb (SEQ. ID. NO. 2) : 5' GCACAACTGGGCITTGGAIT 3'
[0025] 所述的引物對P2為：
[0026] 上游引物 P2a (SEQ. ID. NO. 3) : 5，GGTCCTCACCTCATCACAGC 3 '
[0027] 下游引物 P2b (SEQ. ID. NO. 4) : 5' ACTTCAGTCCTCACAACTCCCT 3'
[0028]
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種簡單、快速、低成本、精確度高的山羊LMCD1 基因多態(tài)性位點檢測方法，便于推廣應用的在DNA水平上篩查和檢測與山羊生長性狀密切 相關(guān)的遺傳標記，可用于山羊的輔助選擇和分子育種，以加快良種選育速度和提高種群品 質(zhì)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1是引物P1擴增不同山羊個體（山羊LMCD1基因第681位多態(tài)位點）PCR產(chǎn)物 瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0031] 圖2是引物P2擴增不同山羊個體（山羊LMCD1基因第2825位多態(tài)位點）PCR產(chǎn) 物瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0032] 圖3是本發(fā)明中PCR產(chǎn)物混合測序篩查到的山羊LMCD1基因序列第681位A-G突 變測序結(jié)果圖；
[0033] 圖4是本發(fā)明中PCR產(chǎn)物混合測序篩查到的山羊LMCD1基因序列第2825位C-T 突變測序結(jié)果圖；
[0034] 圖5是本發(fā)明山羊LMCD1基因第681位多態(tài)位點聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；
[0035] 圖6是本發(fā)明山羊LMCD1基因第2825位多態(tài)位點聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。

【具體實施方式】
[0036] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0037] 本發(fā)明首先根據(jù)LMCD1基因的保守序列設計引物，分別以4個山羊群體的基因組 DNA為模板，進行PCR擴增，混合PCR產(chǎn)物并對其純化，測序。然后，進行測序圖分析和序列 比對篩查出SNP位點；其次，對待測群體進行多態(tài)位點的PCR-SSCP檢測；最后，根據(jù)在群體 中檢測到的基因型，進行群體遺傳統(tǒng)計分析和體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析，篩選出與山羊體尺性 狀密切相關(guān)的分子標記。下面對本發(fā)明做詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0038] (一）、山羊LMCD1基因部分DNA序列的擴增及其多態(tài)性的檢測
[0039] 1、山羊樣品的采集及處理
[0040] 本發(fā)明采用了 4種山羊品種共計315個個體，具體為：（1)波爾山羊血液樣品72 份，采自江蘇省徐州市豐縣合作種羊場；（2)徐淮白山羊血液樣品81份，采自江蘇省徐州市 銅山縣呂梁鄉(xiāng)；（3)海門山羊血液樣品116份，采自江蘇省南通海門；（4)波爾山羊X徐淮 白山羊耳組織樣品46份，采自江蘇省徐州市豐縣梁寨合作種羊場。取山羊血樣10mL，加入 0. 5mol/L的EDTA500 y L抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，-80°C保存?zhèn)溆?。取耳組織樣，在 70%乙醇保存，冰盒低溫帶回實驗室，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0041] 2、基因組DNA的提取
[0042] (1)將冷凍血樣室溫解凍，轉(zhuǎn)移500iiL至1. 5mL Eppendorf管，加入等體積PBS緩 沖液，充分混勻，12000r/min離心10min(4°C )，棄去上清液，重復上述步驟至上清液透明、 沉淀呈淡黃色。
[0043] (2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500iiL，搖動，使血細胞沉淀脫離離心管管 壁，37°C水浴lh。DNA抽提緩沖液的配制：0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS 加超純水500mL，滅菌、調(diào)pH至8. 0,4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0044] (3)加蛋白酶K 3iiL(20mg/mL)并混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補加 1 U L蛋白酶K混勻繼續(xù)消化至澄清。
[0045] (4)將反應液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500iiL，溫和搖動離心管20min，使其充 分混勻，4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中，重復一次。
[0046] (5)加氯仿500iiL，充分混勻20min，4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另 一 1. 5mL離心管中。
[0047] (6)加0. 1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動離心管 直至白色的絮狀沉淀析出，_20°C保存30?60min。
[0048] (7) 4°C，12000r/min離心lOmin，棄上清，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。
[0049] (8)4°C，12000r/min離心lOmin，棄上清，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。
[0050] (9)干燥后的DNA溶于80?100 y L的TE-緩沖液或超純水，4°C保存直至DNA完 全溶解，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，-80°C保存。
[0051] 耳組織DNA的提取參考文獻Sambrocketal(2002)方法。
[0052] 3、擴增引物設計
[0053] 由于GenBank中沒有山羊LMCD1基因序列，所以，本發(fā)明以牛（GenBank : NC_007320. 4)序列為參考，利用Primer 5. 0設計能夠擴增包含山羊LMCD1基因第5內(nèi)含子 和第5外顯子的PCR引物。
[0054] 擴增第5內(nèi)含子的引物為：
[0055] 上游引物：5 ' CCTTCAGGAGCGITTGGACT 3 '
[0056] 下游引物：5 ' GCACAACTGGGCITTGGAIT 3 '
[0057] 擴增第5外顯子的引物為：
[0058] 上游引物：5 ' GGTCCTCACCTCATCACAGC 3 '
[0059] 下游引物：5 ' ACTTCAGTCCTCACAACTCCCT 3 '
[0060] 以上述引物對擴增了山羊LMCD1基因第5內(nèi)含子，第5外顯子部分區(qū)域及一部分 內(nèi)含子區(qū)域。
[0061] 4、PCR 擴增
[0062] 分別以4個山羊品種的DNA為模版，用上述設計的引物對進行PCR擴增，PCR總反 應體系為15 U L，見表1 ;PCR總反應程序，見表2。
[0063] 表1本發(fā)明的PCR反應體系
[0064]

【權(quán)利要求】
1. 山羊LMCD1基因單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟： (1) 以待測山羊全基因組DNA為模板，以引物對P1或引物對P2為引物，PCR擴增山羊 LMCD1基因中對應包含第681位的部分序列或包含2825位的部分序列； 所述的引物對P1為： 上游引物 Pla: 5' CCTTCAGGAGCGITTGGACT 3' 下游引物 Plb: 5 ' GCACAACTGGGCITTGGAIT 3 ' 所述的引物對P2為： 上游引物 P2a: 5 ' GGTCCTCACCTCATCACAGC 3 ' 下游引物 P2b: 5 ' ACTTCAGTCCTCACAACTCCCT 3 ' (2) 對PCR擴增產(chǎn)物進行SSCP檢測：PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)變性劑變性處理后進行聚丙烯酰 胺凝膠電泳，然后根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果判定多態(tài)性位點的基因型，所述多態(tài)性位 點為： 在山羊的LMCD1基因第681位為A或G的堿基多態(tài)性位點，表現(xiàn)為AA以及AG兩種基 因型； 在山羊的LMCD1基因第2825位為C或T的堿基多態(tài)性位點，表現(xiàn)為CC以及CT兩種基 因型。
2. 如權(quán)利要求1所述山羊LMCD1基因單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方法，其特征在于：所述的PCR擴增的反應程序為：94 °C預變性5min ;94 °C變性30s，58 °C退火40s，72 °C延伸 40-60s，35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
3. 如權(quán)利要求1所述山羊LMCD1基因單核苷酸多態(tài)性位點的檢測方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝膠電泳采用10%的聚丙烯酰胺凝膠。
4. 山羊LMCD1基因單核苷酸多態(tài)性位點的試劑盒，其特征在于：包括引物對P1或引物 對P2,所述的引物對P1為： 上游引物 Pla: 5' CCTTCAGGAGCGITTGGACT 3' 下游引物 Plb: 5 ' GCACAACTGGGCITTGGAIT 3 ' 所述的引物對P2為： 上游引物 P2a: 5 ' GGTCCTCACCTCATCACAGC 3 ' 下游引物 P2b: 5 ' ACTTCAGTCCTCACAACTCCCT 3 '。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450934SQ201410812130
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月22日
【發(fā)明者】陳宏 , 房興堂, 劉宣宣, 張春雷, 金晶, 王艷紅 申請人:江蘇師范大學