禽流感病毒ha基因重組腺病毒的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法，該方法創(chuàng)新性的利用質(zhì)粒pCAGGS、腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle、腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1等，經(jīng)一系列中間過(guò)程，得到基因表達(dá)質(zhì)粒等中間產(chǎn)物，將最后得到的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞；根據(jù)腺病毒感染形成的細(xì)胞病變及特異細(xì)胞免疫組化篩選重組病毒。該方法以CAG為啟動(dòng)子表達(dá)目的基因，顯著提升了目的基因的表達(dá)水平，同時(shí)利用該方法構(gòu)建的分別表達(dá)H5N1與H9N2亞型禽流感病毒血凝素蛋白重組腺病毒，為H5、H9亞型禽流感病毒雙價(jià)核酸疫苗的研制提供病毒模型，也為AIV腺病毒活載體疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及疫苗【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感（Avian influenza)于1878年首發(fā)于意大利，后證實(shí)是由A型流感病毒引 起。之后，禽流感不僅給畜牧業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅到人類的健康和生命。 目前已有多個(gè)國(guó)家出現(xiàn)H5N1亞型禽流感病毒感染人的情況。在2005年10月，我國(guó)安徽省 發(fā)生首例確證的人感染H5N1亞型禽流感病毒病例，并分離到我國(guó)首株人H5N1亞型禽流感 病毒A/Anhui/1/2005。2011年12月31日，我國(guó)深圳一人感染高致病性禽流感病毒并死亡。 雖然深圳市疾控中心宣布此毒株不會(huì)人傳染人，但是世界衛(wèi)生組織證實(shí)了禽流感病毒在某 些條件下可以以人傳染人方式傳播。所以，研制新型高效、安全的禽流感疫苗已成為病毒學(xué) 工作者的重要任務(wù)。
[0003] 目前，主要是通過(guò)接種疫苗來(lái)預(yù)防該病的發(fā)生。常規(guī)滅活疫苗對(duì)該病的免疫效果 不佳，而弱毒疫苗則存在潛在的生物安全問(wèn)題。因此，開發(fā)新型、高效、廉價(jià)、安全的疫苗勢(shì) 在必行。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，學(xué)者們不斷進(jìn)行著新型基因工程流感疫苗的研 究。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中，無(wú)論制備核酸疫苗還是制備其他基因工程疫苗，相關(guān)抗原的制備都 是必要技術(shù)條件。HA蛋白為AIV的表面糖蛋白，病毒感染后能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗HA 蛋白的抗體，該抗體具有病毒中和作用，因此，HA基因在流感病毒基因工程疫苗中被作為重 要的靶抗原。
[0005] 然而僅僅確定HA蛋白或HA蛋白表達(dá)基因作為抗原只是從基礎(chǔ)角度確定可用的抗 原類別。在此基礎(chǔ)上如何開發(fā)一種表達(dá)穩(wěn)定、安全性高的HA蛋白（或HA基因）表達(dá)系統(tǒng) 成為了成功開發(fā)相關(guān)疫苗的技術(shù)關(guān)鍵。此外，如果該表達(dá)系統(tǒng)能夠共表達(dá)多種AIV病毒亞 型抗原將為制備禽流感病毒多價(jià)疫苗奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種禽流感病毒HA基因重組腺病毒 的制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中HA基因表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)效率較低的技術(shù)問(wèn)題。
[0007] 本發(fā)明解決的另一技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)中無(wú)法以一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá)多種病毒 亞型抗原的技術(shù)問(wèn)題。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] 一種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0010] 1)將具有禽流感病毒HA基因的片段連接到腺病毒穿梭質(zhì)粒上，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入 大腸桿菌中擴(kuò)增，而后提取重組腺病毒穿梭質(zhì)粒；
[0011] 2)將步驟1)提取得到的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒經(jīng)單酶切后導(dǎo)入含有腺病毒骨架質(zhì) 粒的大腸桿菌中進(jìn)行同源重組，而后提取重組腺病毒質(zhì)粒；
[0012] 3)將步驟2)提取得到的重組腺病毒質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝，即得到禽 流感病毒HA基因重組腺病毒；
[0013] 在此基礎(chǔ)上，所述具有禽流感病毒HA基因的片段是連接有CAG啟動(dòng)子的禽流感病 毒HA基因片段。
[0014] 優(yōu)選的，所述連接有CAG啟動(dòng)子的禽流感病毒HA基因片段是通過(guò)以下方法制備 的：將禽流感病毒HA基因片段與pCAGGS載體連接，而后將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌擴(kuò)增，而 后提取重組質(zhì)粒，而后酶切得到CAG-HA基因片段。
[0015] 優(yōu)選的，所述禽流感病毒HA基因有兩種，分別是H5N1型禽流感病毒HA基因和 H9N2型禽流感病毒HA基因，先完成其中一種禽流感病毒HA基因片段與pCAGGS載體的連 接，而后再與另一種禽流感病毒HA基因片段連接。在該優(yōu)選方案中連接得到的產(chǎn)物結(jié)構(gòu) 為-CAG-HA(H5N1)-CAG-HA(H9N2)_。
[0016] 在以上任一技術(shù)方案基礎(chǔ)上可以執(zhí)行以下優(yōu)選：
[0017] 步驟1)所述腺病毒穿梭質(zhì)粒是pShuttle質(zhì)粒；
[0018] 步驟1)所述的大腸桿菌為DH5 α大腸桿菌。
[0019] 步驟2)所述大腸桿菌為BJ5183大腸桿菌。
[0020] 步驟2)所述的腺病毒骨架質(zhì)粒是腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-Ι。
[0021] 步驟2)所述的單酶切是利用Pme I酶實(shí)現(xiàn)的。
[0022] 步驟3)所述的293細(xì)胞為AD293細(xì)胞。
[0023] 步驟3)所述的線性化是利用Pac I酶實(shí)現(xiàn)的。
[0024] CAG啟動(dòng)子是人工構(gòu)建的組合啟動(dòng)子，由巨細(xì)胞病毒早期增強(qiáng)子（early enhancer element)和雞β-肌動(dòng)蛋白（chicken beta-actin)啟動(dòng)子組成，本發(fā)明以CAG為啟動(dòng)子表 達(dá)目的基因，顯著提升了目的基因的表達(dá)水平。
[0025] 與此同時(shí)本發(fā)明構(gòu)建一株分別表達(dá)H5N1與H9N2亞型禽流感病毒血凝素蛋白重組 腺病毒，為H5、H1亞型禽流感病毒雙價(jià)核酸疫苗的研制提供病毒模型，也為AIV腺病毒活載 體疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明方法采用第三代腺病毒載體，由于該載體缺失全部的腺病 毒蛋白編碼序列，因此感染后沒(méi)有病毒蛋白表達(dá)，降低了機(jī)體的免疫反應(yīng)和細(xì)胞毒性，提高 了安全性。
[0026] 本發(fā)明創(chuàng)新性的利用質(zhì)粒pCAGGS、腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle、腺病毒骨架質(zhì)粒 pAdEasy-Ι等，經(jīng)一系列中間過(guò)程，得到基因表達(dá)質(zhì)粒等中間產(chǎn)物，將最后得到的重組腺病 毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞；根據(jù)腺病毒感染形成的細(xì)胞病變及特異細(xì)胞免疫組化篩選重組病 毒，用PCR鑒定該重組腺病毒。該重組腺病毒為H5、H9亞型禽流感病毒雙價(jià)核酸疫苗的研 制提供病毒模型，也為進(jìn)一步研究開發(fā)基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1是本發(fā)明重組腺病毒穿梭載體PCR鑒定結(jié)果，M:DL8000 ;
[0028] 圖2是本發(fā)明重組腺病毒質(zhì)粒酶切（Pac I)鑒定結(jié)果，M:DL15000,其中PacI酶切 除特異4. 5kb片段，證明重組成功；
[0029] 圖3是本發(fā)明重組腺病毒PCR鑒定結(jié)果，M:DL2000 ;其中1號(hào)代表HA(H5N1)，2號(hào) 代表HA (H9N2)，3號(hào)為對(duì)照試驗(yàn)；
[0030] 圖4是本發(fā)明重組腺病毒二次接種AD293細(xì)胞結(jié)果，其中A是陰性對(duì)照B細(xì)胞病 變；
[0031] 圖5是本發(fā)明重組腺病毒電鏡觀察結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 以下將對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過(guò)多不必要的細(xì)節(jié)，在 以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0033] 以下實(shí)施例中所使用的近似性語(yǔ)言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情 況下可允許數(shù)量有一定的變動(dòng)。因此，用"大約"、"左右"等語(yǔ)言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn) 確數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，"大約"表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十（10%)的 范圍內(nèi)變化，比如，"大約1〇〇"表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在"大約第 一數(shù)值到第二數(shù)值"的表述中，大約同時(shí)修正第一和第二數(shù)值兩個(gè)數(shù)值。在某些情況下，近 似性語(yǔ)言可能與測(cè)量?jī)x器的精度有關(guān)。
[0034] 除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員普遍理解的相同含義。
[0035] 以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果 取平均值；以下實(shí)施例中的％，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
[0036] 實(shí)施例1
[0037]目的基因引物設(shè)計(jì)及重組穿梭載體構(gòu)建根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的H5N1和H9N2 亞型AIV HAl核酸序列設(shè)計(jì)引物，并在HA基因上、下游分別引入限制性酶切位點(diǎn)。將HA與經(jīng) 內(nèi)切酶Sal I和Xho I雙酶切后線性化的pShuttle載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a， 挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定（上海生工公司進(jìn)行測(cè)序分析）。鑒定陽(yáng)性克隆的引物 序列：
[0038] F:5'-ACGCGTCGACAAAATGAAGGCAATACTAGTGTT-3'
[0039] R:5,-CGCTCGAGGGGCCCTGGGTTGGACTCGACGTCGCCGGCCAACTTGAG-3'
[0040] PCR反應(yīng)循環(huán)條件：95°C預(yù)變性Imin ;95°C變性30s，60°C退火40s，72°C延伸 5〇8(30個(gè)。5^168);最后72°〇延伸1〇111；[11。
[0041] 將鑒定正確的重組載體經(jīng)Xho I和Xba I線性化后與H9連接，轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)， 挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定（上海生工公司進(jìn)行測(cè)序分析）。鑒定陽(yáng)性克隆的引物 序列：
[0042] F :5'-ACGCGTCGACAAAATGAAGGCAATACTAGTGTT-3'，
[0043] R:5'-GCTCTAGAGCTCAGCCTCTAGTTTGTTTCT-3'
[0044] ?〇?反應(yīng)循環(huán)條件：951：預(yù)變性11^11;951：變性308,591：退火408,721：延伸 9〇8(30個(gè)。5^168);最后72°〇延伸1〇111；[11。
[0045] 實(shí)施例2
[0046] 重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及重組腺病毒的獲得，將重組腺病毒穿梭質(zhì)粒用限制性內(nèi) 切酶Pme I線性化、純化回收后，轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-Ι的BJ5183感受態(tài) 細(xì)胞進(jìn)行同源重組。Kan抗性篩選后提取質(zhì)粒，對(duì)提取后的質(zhì)粒用Pac I進(jìn)行酶切鑒定和 PCR鑒定。為了獲得大量高質(zhì)量的重組質(zhì)粒，將篩選的陽(yáng)性重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于宿主菌 DH5a擴(kuò)增。
[0047] 實(shí)施例3
[0048] -種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0049] 1)將具有禽流感病毒HA基因的片段連接到腺病毒穿梭質(zhì)粒上，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入 大腸桿菌中擴(kuò)增，而后提取重組腺病毒穿梭質(zhì)粒；
[0050] 2)將步驟1)提取得到的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒經(jīng)單酶切后導(dǎo)入含有腺病毒骨架質(zhì) 粒的大腸桿菌中進(jìn)行同源重組，而后提取重組腺病毒質(zhì)粒；
[0051] 3)將步驟2)提取得到的重組腺病毒質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝，即得到禽 流感病毒HA基因重組腺病毒；
[0052] 同時(shí)：所述具有禽流感病毒HA基因的片段是連接有CAG啟動(dòng)子的禽流感病毒HA 基因片段。
[0053] 在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述連接有CAG啟動(dòng)子的禽流感病毒HA基因片段是通 過(guò)以下方法制備的：將禽流感病毒HA基因片段與pCAGGS載體連接，而后將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大 腸桿菌擴(kuò)增，而后提取重組質(zhì)粒，而后酶切得到CAG-HA基因片段；其中所述禽流感病毒HA 基因有兩種，分別是H5N1型禽流感病毒HA基因和H9N2型禽流感病毒HA基因，先完成其中 一種禽流感病毒HA基因片段與pCAGGS載體的連接，而后再與另一種禽流感病毒HA基因片 段連接。
[0054] 在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上：步驟1)所述腺病毒穿梭質(zhì)粒是pShuttle質(zhì)粒；步驟 1)所述的大腸桿菌為DH5 a大腸桿菌；步驟2)所述大腸桿菌為BJ5183大腸桿菌；步驟2) 所述的腺病毒骨架質(zhì)粒是腺病毒骨架質(zhì)粒PAdEasy-I ;步驟2)所述的單酶切是利用Pme I 酶實(shí)現(xiàn)的；步驟3)所述的293細(xì)胞為AD293細(xì)胞；步驟3)所述的線性化是利用Pac I酶實(shí) 現(xiàn)的。
[0055] 實(shí)施例4
[0056] -種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0057] 1)將具有禽流感病毒HA基因的片段連接到腺病毒穿梭質(zhì)粒上，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入 大腸桿菌中擴(kuò)增，而后提取重組腺病毒穿梭質(zhì)粒；
[0058] 2)將步驟1)提取得到的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒經(jīng)單酶切后導(dǎo)入含有腺病毒骨架質(zhì) 粒的大腸桿菌中進(jìn)行同源重組，而后提取重組腺病毒質(zhì)粒；
[0059] 3)將步驟2)提取得到的重組腺病毒質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝，即得到禽 流感病毒HA基因重組腺病毒；
[0060] 同時(shí)：所述具有禽流感病毒HA基因的片段是連接有CAG啟動(dòng)子的禽流感病毒HA 基因片段。
[0061] 在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述連接有CAG啟動(dòng)子的禽流感病毒HA基因片段是通 過(guò)以下方法制備的：將禽流感病毒HA基因片段與pCAGGS載體連接，而后將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大 腸桿菌擴(kuò)增，而后提取重組質(zhì)粒，而后酶切得到CAG-HA基因片段；其中所述禽流感病毒HA 基因有兩種，分別是H5N1型禽流感病毒HA基因和H9N2型禽流感病毒HA基因，先完成其中 一種禽流感病毒HA基因片段與pCAGGS載體的連接，而后再與另一種禽流感病毒HA基因片 段連接。
[0062] 在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上：步驟1)所述腺病毒穿梭質(zhì)粒是pShuttle質(zhì)粒；步驟 2)所述的腺病毒骨架質(zhì)粒是腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-Ι ;步驟3)所述的293細(xì)胞為AD293 細(xì)胞。步驟3)所述的線性化是利用Pac I酶實(shí)現(xiàn)的。
[0063] 實(shí)施例5
[0064] 一種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0065] 1)將具有禽流感病毒HA基因的片段連接到腺病毒穿梭質(zhì)粒上，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入 大腸桿菌中擴(kuò)增，而后提取重組腺病毒穿梭質(zhì)粒；
[0066] 2)將步驟1)提取得到的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒經(jīng)單酶切后導(dǎo)入含有腺病毒骨架質(zhì) 粒的大腸桿菌中進(jìn)行同源重組，而后提取重組腺病毒質(zhì)粒；
[0067] 3)將步驟2)提取得到的重組腺病毒質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝，即得到禽 流感病毒HA基因重組腺病毒；
[0068] 同時(shí)：所述具有禽流感病毒HA基因的片段是連接有CAG啟動(dòng)子的禽流感病毒HA 基因片段。
[0069] 在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述連接有CAG啟動(dòng)子的禽流感病毒HA基因片段是通 過(guò)以下方法制備的：將禽流感病毒HA基因片段與pCAGGS載體連接，而后將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大 腸桿菌擴(kuò)增，而后提取重組質(zhì)粒，而后酶切得到CAG-HA基因片段。
[0070] 在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上：步驟1)所述腺病毒穿梭質(zhì)粒是pShuttle質(zhì)粒；步驟 1)所述的大腸桿菌為DH5 α大腸桿菌；步驟2)所述大腸桿菌為BJ5183大腸桿菌；步驟3) 所述的293細(xì)胞為AD293細(xì)胞。
[0071] 實(shí)施例6
[0072] -種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0073] 1)將具有禽流感病毒HA基因的片段連接到腺病毒穿梭質(zhì)粒上，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入 大腸桿菌中擴(kuò)增，而后提取重組腺病毒穿梭質(zhì)粒；
[0074] 2)將步驟1)提取得到的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒經(jīng)單酶切后導(dǎo)入含有腺病毒骨架質(zhì) 粒的大腸桿菌中進(jìn)行同源重組，而后提取重組腺病毒質(zhì)粒；
[0075] 3)將步驟2)提取得到的重組腺病毒質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝，即得到禽 流感病毒HA基因重組腺病毒；
[0076] 同時(shí)：所述具有禽流感病毒HA基因的片段是連接有CAG啟動(dòng)子的禽流感病毒HA 基因片段。
[0077] 在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上：步驟1)所述的大腸桿菌為DH5ci大腸桿菌；步驟2)所 述大腸桿菌為BJ5183大腸桿菌；步驟2)所述的單酶切是利用Pme I酶實(shí)現(xiàn)的；步驟3)所 述的293細(xì)胞為AD293細(xì)胞；步驟3)所述的線性化是利用Pac I酶實(shí)現(xiàn)的。
[0078] 實(shí)施例7
[0079] -種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0080] 1)將具有禽流感病毒HA基因的片段連接到腺病毒穿梭質(zhì)粒上，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入 大腸桿菌中擴(kuò)增，而后提取重組腺病毒穿梭質(zhì)粒；
[0081] 2)將步驟1)提取得到的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒經(jīng)單酶切后導(dǎo)入含有腺病毒骨架質(zhì) 粒的大腸桿菌中進(jìn)行同源重組，而后提取重組腺病毒質(zhì)粒；
[0082] 3)將步驟2)提取得到的重組腺病毒質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝，即得到禽 流感病毒HA基因重組腺病毒；
[0083] 同時(shí)：所述具有禽流感病毒HA基因的片段是連接有CAG啟動(dòng)子的禽流感病毒HA 基因片段。
[0084] 以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例， 并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng) 包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法，該方法包括以下步驟： 1) 將具有禽流感病毒HA基因的片段連接到腺病毒穿梭質(zhì)粒上，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸 桿菌中擴(kuò)增，而后提取重組腺病毒穿梭質(zhì)粒； 2) 將步驟1)提取得到的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒經(jīng)單酶切后導(dǎo)入含有腺病毒骨架質(zhì)粒的 大腸桿菌中進(jìn)行同源重組，而后提取重組腺病毒質(zhì)粒； 3) 將步驟2)提取得到的重組腺病毒質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝，即得到禽流感 病毒HA基因重組腺病毒； 其特征在于：所述具有禽流感病毒HA基因的片段是連接有CAG啟動(dòng)子的禽流感病毒 HA基因片段。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法，其特征在 于所述連接有CAG啟動(dòng)子的禽流感病毒HA基因片段是通過(guò)以下方法制備的：將禽流感病毒 HA基因片段與pCAGGS載體連接，而后將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌擴(kuò)增，而后提取重組質(zhì)粒， 而后酶切得到CAG-HA基因片段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法，其特征在 于所述禽流感病毒HA基因有兩種，分別是H5N1型禽流感病毒HA基因和H9N2型禽流感病 毒HA基因，先完成其中一種禽流感病毒HA基因片段與pCAGGS載體的連接，而后再與另一 種禽流感病毒HA基因片段連接。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述的一種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法， 其特征在于步驟1)所述腺病毒穿梭質(zhì)粒是pShuttle質(zhì)粒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述的一種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法， 其特征在于步驟1)所述的大腸桿菌為DH5 a大腸桿菌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述的一種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法， 其特征在于步驟2)所述大腸桿菌為BJ5183大腸桿菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述的一種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法， 其特征在于步驟2)所述的腺病毒骨架質(zhì)粒是腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述的一種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法， 其特征在于步驟2)所述的單酶切是利用Pme I酶實(shí)現(xiàn)的。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述的一種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方法， 其特征在于步驟3)所述的293細(xì)胞為AD293細(xì)胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述的一種禽流感病毒HA基因重組腺病毒的制備方 法，其特征在于步驟3)所述的線性化是利用Pac I酶實(shí)現(xiàn)的。
【文檔編號(hào)】C12N15/861GK104404005SQ201410811399
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月22日
【發(fā)明者】王壽山, 李亞杰, 郁宏偉, 楊保收, 梁武 申請(qǐng)人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司