一種鴨瘟病毒基因缺失轉(zhuǎn)移載體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明目的在于提供一種鴨瘟病毒基因缺失轉(zhuǎn)移載體及其應(yīng)用，該轉(zhuǎn)移載體通過與鴨瘟病毒發(fā)生同源重組，從而獲得鴨瘟病毒基因缺失工程毒株，利用該毒株可制備一種安全性高、防制效果好的鴨瘟病毒基因缺失疫苗。本發(fā)明制備的鴨瘟病毒基因缺失疫苗在降低病毒致病性的情況下，不會影響病毒的免疫原性，因而制備的鴨瘟病毒基因缺失疫苗具有更好的安全性，能夠保持原有病毒的免疫原性，適合我國當(dāng)前鴨瘟疾病的預(yù)防控制，有利于鴨場鴨瘟的凈化處理。而且本發(fā)明的重組鴨瘟病毒株不含任何外源基因，與現(xiàn)有技術(shù)報道的同類鴨瘟病毒基因疫苗相比，不含有EGFP、lacZ等標(biāo)記基因，具有更高的生物安全性。
【專利說明】一種鴨瘟病毒基因缺失轉(zhuǎn)移載體及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和動物病毒學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鴨瘟病毒基因缺失轉(zhuǎn) 移載體及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 鴨癌病毒（Duck plague virus，DPV)是目前嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)鴨業(yè)的主要病 毒之 一。2013 年國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)對鴨癌病毒重新進(jìn)行了分類，歸屬為皰疫病毒目（Herpesvirales)皰 疫病毒科（Herpesvirales) α -痛疫病毒亞科（Alphaherpesvirinae)馬立克病毒屬 (Mardivirus) (http://ictvonline. org/virusTaxonomy. asp)分類學(xué)名稱為''Anatid herpesviurs l(AnHV-l，鴨皰疹病毒1型）。鴨瘟病毒是一種泛嗜性全身性感染病毒，主要 引起鴨、鵝、天鵝等雁形目水禽的急性接觸性傳染病。在自然條件下引起鴨只大批發(fā)病和死 亡。不同年齡、性別的鴨均易感，自然感染主要見于成年鴨，尤其是母鴨，但不同品種的鴨易 感性不同。鴨瘟感染后典型病理變化以血管損傷、組織出血、消化道粘膜糜爛、淋巴器官病 變、實質(zhì)器官退行性病變?yōu)樘卣?，是影響我國水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病。（Saif Y M.禽病學(xué) (第11版）.高福，蘇敬良譯.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005 :389-398)。由于鴨瘟引起鴨 腸炎的典型特征，該病又被稱為鴨病毒性腸炎（Duck virus enteritis，DVE),鴨癌病毒又 稱為鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus, DEV)
[0003] 目前對鴨瘟疾病的預(yù)防主要依靠接種滅活疫苗和雞胚化弱毒疫苗來預(yù)防鴨瘟的 發(fā)生。滅活疫苗雖然安全性好，但免疫維持期短、劑量較大、成本較高；雞胚化弱毒疫苗雖然 免疫效果較好，但存在毒力返強(qiáng)和隱性帶毒等安全隱患，而且現(xiàn)有的診斷方法無法區(qū)別自 然感染野毒和弱毒疫苗免疫的動物。因此，研制更為安全有效的新型基因工程疫苗，尤其是 標(biāo)記疫苗具有重要的理論和應(yīng)用價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于提供一種鴨瘟病毒基因缺失轉(zhuǎn)移載體及其應(yīng)用，該轉(zhuǎn)移載體通過 與鴨瘟病毒發(fā)生同源重組，從而獲得鴨瘟病毒基因缺失工程毒株，利用該毒株可制備一種 安全性高、防制效果好的鴨瘟病毒基因缺失疫苗。
[0005] 本發(fā)明首先提供一種鴨瘟病毒基因缺失轉(zhuǎn)移載體，為pglE-lacZ，該重組轉(zhuǎn)移載體 由如下步驟構(gòu)建的：
[0006] 1)以鴨瘟病毒為模板，利用序列為SEQ ID NO: 1 (上游引物：5 '-GAAGATCTGCCGGACCCGACCACCAG-3，）和序列為 SEQ ID N0:2
[0007] (下游引物：5，-CGGGATCCAATTCCAAGACGAGGGCAATCATCAT-3 ')的引物對進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增片段，并連接入載體構(gòu)建質(zhì)粒pMD-gl-L ;
[0008] 用序列為 SEQ ID N0:3(上游引物：5' -CCGCTCGAGACCGTGTTTATTTCATCCGTCTG-3 !
[0009] )和序列為 SEQ ID N0:4(5' -CCCTGCAGAGCGCGTATTAACCTTTTGTAGC-3'）的引物 對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增片段，并連接入載體構(gòu)建質(zhì)粒pMD-gE-R ;
[0010] 2)將pMD-gl-L用Bgl II與BamH I進(jìn)行雙酶切，回收純化片段克隆至已用Bgl II 限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切并回收的PLS-IacZ載體上，構(gòu)建成pgl-lacZ質(zhì)粒；應(yīng)用限制性內(nèi)切 酶Xho I與Pst I分別對質(zhì)粒pgl-lacZ和pMD-gE-R進(jìn)行雙酶切，回收純化片段進(jìn)行連接， 制成鴨瘟病毒基因缺失重組轉(zhuǎn)移載體pglE-lacZ。
[0011] 上述的pLS-lacZ載體的構(gòu)建方法如下：
[0012] DLoxp序列設(shè)計與合成：
[0013] 將兩端分別帶有Nde I與Hind III酶切位點，含兩個同向的34bp的Loxp序列的 核苷酸片段（SEQ ID N0:5 :
[0014] CATATGAGATCTGAATTCTCGCGAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGATCCGA GCTCGCTAGCGGTACCTCTAGATATCGTCGACATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTCGAGCT GCAGAAGCTT)和質(zhì)粒pUC57用Nde I與Hind III分別進(jìn)行酶切，酶切片段連接獲得質(zhì)粒 pUC-LS ；
[0015] 2) SV40啟動子及IacZ基因獲得
[0016] 以pCDNA3. 1(+)為模板，序列為SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7的引物對擴(kuò)增得到片 段，應(yīng)用Bgl II及Xho I雙酶切回收后連接到pUC-LS相應(yīng)的BamH I與Sal I位點內(nèi)，構(gòu) 建質(zhì)粒pLS-neo;以序列為SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9的引物對擴(kuò)增IacZ基因，應(yīng)用Sma I 及BstX I進(jìn)行雙酶切后連接到pLS-neo對應(yīng)的酶切位點，構(gòu)建得到pLS-lacZ質(zhì)粒。
[0017] 其中擴(kuò)增SV40啟動子引物的序列信息如下：
[0018] SV40-F:GAAGATCTAAGAACCAGCTGGGGCTCTA(SEQ ID NO:6)
[0019] SV40-R:CCGCTCGAGCGACGGTATACAGACATGAT(SEQ ID NO:7)
[0020] 擴(kuò)增IacZ基因引物引物的序列信息如下：
[0021] IacZ-F:5，~GCCCGGGATGATAGATCCCGTCGTTT~3' (SEQ ID NO:8)
[0022] IacZ-R:5， ~GCTTCGAATTATTTCTGACACCAGACC~3' (SEQ ID N0:9)〇
[0023] 本發(fā)明的鴨瘟病毒基因缺失轉(zhuǎn)移載體用于制備重組鴨瘟病毒基因缺失疫苗株，其 一種制備方法如下：
[0024] 1)用鴨瘟病毒感染雞胚成纖維（CEF)細(xì)胞；
[0025] 2)用構(gòu)建的鴨瘟病毒基因缺失轉(zhuǎn)移載體pglE-lacZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已感染鴨瘟病毒的 CEF細(xì)胞；
[0026] 3)待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后收獲轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，凍融后將經(jīng)轉(zhuǎn)染的病毒按一定的稀釋 倍數(shù)接種CEF細(xì)胞；
[0027] 4)在X-gal存在條件下進(jìn)行藍(lán)斑篩選，在出現(xiàn)藍(lán)斑的細(xì)胞中覆蓋低溶點營養(yǎng)瓊 脂；
[0028] 5)挑取出含藍(lán)斑的細(xì)胞毒進(jìn)行凍融；
[0029] 6)將凍融的篩選的藍(lán)斑細(xì)胞毒接種CEF細(xì)胞，并覆蓋低溶點營養(yǎng)瓊脂；
[0030] 7)重復(fù)上述步驟5)和6)直至獲得純化的含IacZ基因的重組鴨瘟病毒rDPV/gI_/ gE /lacZ+〇
[0031] 上述的重組鴨瘟病毒rDPV/gl7gE7lacZ+還用于制備去除IacZ基因的重組鴨瘟 病毒，其制備方法如下：
[0032] 1)鴨瘟病毒 rDPV/gl7gE_/lacZ+株感染 CEF 細(xì)胞；
[0033] 2)表達(dá)Cre蛋白酶的質(zhì)粒pBS185轉(zhuǎn)染已感染鴨瘟病毒rDPV/gI_/gE7lacZ+的CEF 細(xì)胞；
[0034] 3)待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后，收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞，反復(fù)凍融后按一定稀釋倍數(shù)接種CEF 細(xì)胞；
[0035] 4)在X-gal條件下進(jìn)行藍(lán)斑篩選，在出現(xiàn)藍(lán)斑的細(xì)胞中覆蓋低溶點營養(yǎng)瓊脂，注 意觀察挑取未呈現(xiàn)藍(lán)色的病毒感染蝕斑細(xì)胞；
[0036] 5)反復(fù)凍融挑取的非藍(lán)色的病毒感染蝕斑細(xì)胞；
[0037] 6)將反復(fù)凍融的篩選的蝕斑細(xì)胞接種CEF細(xì)胞，在X-gal條件下后覆蓋低溶點營 養(yǎng)瓊脂；
[0038] 7)重復(fù)上述步驟5)和6)直至獲得純化的去除IacZ基因的重組鴨瘟病毒rDPV/ gr/gE'
[0039] 構(gòu)建得到的重組鴨瘟病毒株用于制備疫苗。
[0040] 本發(fā)明制備的鴨瘟病毒基因缺失工程毒株在降低病毒致病性的情況下，不會影響 病毒的免疫原性，因而由其制備的鴨瘟病毒基因缺失疫苗具有更好的安全性，能夠保持原 有病毒的免疫原性，適合我國當(dāng)前鴨瘟疾病的預(yù)防控制，有利于鴨場鴨瘟的凈化處理。而且 本發(fā)明的重組鴨瘟病毒株不含任何外源基因，與現(xiàn)有技術(shù)報道的同類鴨瘟病毒基因疫苗 相比，不含EGFP、IacZ等標(biāo)記基因，具有更高的生物安全性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041] 圖1 :鴨瘟病毒雙基因缺失轉(zhuǎn)移載體PgIE-IacZ鑒定的電泳圖譜；其中1 : pLS-lacZ ;2 :pgIE-lacZ ;3 :Bgl II 與 EcoR I 雙酶切構(gòu)建的質(zhì)粒。經(jīng) Bgl II 與 EcoR I 雙 酶切，產(chǎn)生1.2k、3. Ik與約6k大小目的條帶；4 :Bgl II與Hind III雙酶切構(gòu)建的質(zhì)粒。 經(jīng) Bgl II 與 Hind III 雙酶切后產(chǎn)生 479bp、1.0k、2.2k 目的條帶；Ml:DL2000marker;M2: DL15000marker〇
[0042] 圖2 :重組rDPV/gI_/gE7lacZ+PCR鑒定的電泳圖譜，圖A為IacZ基因的PCR鑒定， M :DL2000marker ;1 :rDPV/gl7gE7lacZ+重組鴨瘟病毒；2 :鴨瘟病毒株；3 :轉(zhuǎn)染 pglE-lacZ 質(zhì)粒的CEF細(xì)胞；4 :CEF細(xì)胞。對上述病毒與CEF細(xì)胞提取核酸后擴(kuò)增IacZ基因，目的條 帶為490bp。圖B為病毒的gl/gE基因鑒定，M :DL2000marker ;1 :鴨瘟病毒株；2 :重組鴨瘟 病毒 rDPV/gl /gE/lacZ+。
[0043] 圖3,重組鴨瘟病毒rDPV/gI_/gE_PCR鑒定的電泳圖譜，圖A為gl/gE基因的PCR鑒 定。M :DL2000Marker ;1 :鴨瘟病毒株；2 :重組鴨瘟病毒rDPV/gl7gE7lacZ+;3 :1號重組鴨 瘟病毒rDPV/gI_/gE_;4 :2號重組鴨瘟病毒rDPV/gl _/gE_。圖B為以IacZ基因引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的結(jié)果。M :M :DL2000Marker ;1 :鴨瘟病毒株；2 :重組鴨瘟病毒rDPV/gl7gE7lacZ+;3 : 1號重組鴨瘟病毒rDPV/gI_/gE_;4 :2號重組鴨瘟病毒rDPV/gl _/gE_。

【具體實施方式】
[0044] 以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，首先，對本發(fā)明所用到的用品描述如 下：
[0045] I、病毒毒株與細(xì)胞
[0046] 鴨瘟病毒株；雞胚成纖維（CEF)細(xì)胞用含8%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37°C，5% C02培養(yǎng)。
[0047] 2、質(zhì)粒和菌株
[0048] 大腸桿菌DH5a、質(zhì)粒PMD18-T等購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒 pLS-lacZ由本室構(gòu)建保存，表達(dá)Cre蛋白的質(zhì)粒pBS185購自Addgene公司。
[0049] 3、分子生物學(xué)試劑
[0050] Lipofectamine2000 購自 Invitrogen 公司；DMEM 購自 Gibco 公司；小牛血清購 自浙江天杭生物科技有限公司；Hind III、Xho I、Bgl II、EcoR I、Pst I、Taq、LA Taq、 DL2000Marker、DL15000Marker及DNA Ligation Kit等購自寶生物工程（大連）有限公 司；低溶點瓊脂糖購自 Amresco 公司；Agarose Gel DNA Purification Kit、TIANamp Virus DNA/RNA Kit及小量質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生物科技（北京）有限公司；Wizard Plus Midipreps DNA Purification System 中提質(zhì)粒試劑盒購自 Promega 公司。
[0051] 4、所用試劑及配制
[0052] LB 液體培養(yǎng)基：Tryptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，800mL 純水溶解，用 lmol/L NaOH調(diào)pH至7. 0,定容至IOOOmL,高溫高壓滅菌，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0053] LB固體培養(yǎng)基：按I. 5g/100mL加入瓊脂粉于液體培養(yǎng)基中，高溫高壓滅菌，待冷 卻至60°C左右，加入0. ImL氨節(jié)青霉素（100mg/mL)平鋪于滅菌平皿中，無菌檢測后，4°C避 光保存?zhèn)溆谩?br> [0054] 氨芐青霉素（Amp)溶液：取Amp粉劑lg，溶于滅菌超純水中，使其終濃度為IOOmg/ mL，過濾除菌后分裝，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0055] 雙抗：將100萬IU青霉素和100萬IU鏈霉素加入IOOmL去離子水中，過濾除 菌，-20°C保存。
[0056] DMEM :將13. 4g DMEM干粉和3. 7g碳酸氫鈉溶于800mL去離子水，充分?jǐn)嚢?，調(diào)節(jié) pH值至7. 4,定容至1L，過濾除菌，4°C保存。
[0057] 2 XDMEM :稱取13. 4g DMEM干粉和3. 7g碳酸氫鈉溶于400mL去離子水，充分?jǐn)嚢瑁?調(diào)節(jié)pH值至7. 4,定容至500mL，過濾除菌，4°C保存。
[0058] 1. 2%低熔點瓊脂糖：稱取I. 2g低熔點瓊脂糖溶于IOOmL去離子水中，高溫高壓滅 菌，室溫保存。
[0059] 實施例1鴨瘟病毒基因缺失轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
[0060] 1、質(zhì)粒 pLS-lacZ 的構(gòu)建
[0061] I. ILoxp序列設(shè)計與合成：
[0062] 兩端分別設(shè)計Nde I與Hind III酶切位點，含兩個同向的34bp的Loxp序列（斜 線部分）：
[0063] CATATGAGATCTGAATTCTCGCGAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGATCCGA GCTCGCTAGCGGTACCTCTAGATATCGTCGACATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTCGAGCT GCAGAAGCTT。將上述序列連接到pUC57的Nde I與Hind III位點構(gòu)建質(zhì)粒pUC_LS。
[0064] I. 2SV40啟動子及IacZ基因獲得
[0065] 擴(kuò)增SV40啟動子引物：
[0066] SV40-F:GAAGATCTAAGAACCAGCTGGGGCTCTA
[0067] SV40-R:CCGCTCGAGCGACGGTATACAGACATGAT
[0068] 擴(kuò)增IacZ基因引物：
[0069] IacZ-F:5; -GCCCGGGATGATAGATCCCGTCGTTT-3'
[0070] IacZ-R:5， -GCTTCGAATTATTTCTGACACCAGACC-3'
[0071] 1.3構(gòu)建過程
[0072] 以 pCDNA3. 1 (+)為模板，SV40-F/SV40-R 引物擴(kuò)增 1979bp 片段，應(yīng)用 Bgl II 及 Xho I雙酶切回收后連接到pUC-LS相應(yīng)的BamH I與Sal I位點內(nèi)，構(gòu)建質(zhì)粒pLS-neo。以 lacZ-F/lacZ-R擴(kuò)增IacZ基因，應(yīng)用Sma I及BstX I進(jìn)行雙酶切后連接到pLS-neo對應(yīng)的 酶切位點，并替換原neo基因。經(jīng)過酶切鑒定及測序結(jié)果分析，成功構(gòu)建pLS-lacZ質(zhì)粒。
[0073] 2、鴨瘟病毒轉(zhuǎn)移載體同源臂引物設(shè)計
[0074] 根據(jù)鴨瘟病毒VAC株基因組（GenBank:EU082088. 2)序列，分別設(shè)計引物。在設(shè)計 引物時，考慮將主要生物學(xué)功能區(qū)去掉，分別應(yīng)用于擴(kuò)增鴨瘟病毒轉(zhuǎn)移載體的左右臂。
[0075] 用于擴(kuò)增左臂的引物如下：
[0076] gl-F ：5' -GAAGATCTGCCGGACCCGACCACCAG-3'
[0077] gl-R :5，-CGGGATCCAATTCCAAGACGAGGGCAATCATCAT-3'
[0078] 用于擴(kuò)增右臂的引物如下：
[0079] gE-F ：5' ~CCGCTCGAGACCGTGTTTATTTCATCCGTCTG~3,
[0080] gE-R ：5' -CCCTGCAGAGCGCGTATTAACCTTTTGTAGC-3'
[0081] 其中引物gl-F與gl-R用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)移載體的左臂，擴(kuò)增長度為1050bp，包括部 分gl基因及其左側(cè)序列；其中引物gE-F與gE-R用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)移載體的右臂，擴(kuò)增長度為 1554bp，包括部分gE基因及其右側(cè)序列。
[0082] 3、鴨瘟病毒核酸的制備
[0083] 3. 1鴨瘟病毒培養(yǎng)
[0084] 1)雞胚成纖維細(xì)胞的制備：取9-10日齡雞胚，置于蛋槽中，氣室向上，用碘酒和酒 精棉球由中央向四周涂抹蛋殼除菌消毒；用鑷子敲開氣室并輕輕去除蛋殼，用彎頭鑷子從 雞胚脖子處輕輕挑出雞胚并放入已經(jīng)滅菌的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。依次將頭、四肢及內(nèi)臟全部取 出，用滅菌的PBS沖洗三次，直至胚體發(fā)白，然后用眼科剪均勻剪成大約Imm 3的組織塊。加 入0. 25%胰酶約5mL置于37°C消化10_20min，期間每5min搖動一次，當(dāng)組織塊變得疏松 時，中止消化，IOOOrpm離心lOmin，取上清，用滅菌的紗布過濾。在過濾液加入細(xì)胞培養(yǎng)基 DMEM后混勻，分裝到細(xì)胞瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24-48h。
[0085] 2)鴨瘟病毒接種：在長成致密單層的CEF細(xì)胞中，按常規(guī)方法接種鴨瘟病毒株， 注意觀察，待細(xì)胞出現(xiàn)80-90 %病變時，收獲細(xì)胞，并反復(fù)凍融三次，將細(xì)胞混懸液分裝到 I. 5mL Eppendorf 管中，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0086] 3. 2鴨瘟病毒核酸制備：
[0087] 采用天根生物的TIANamp Virus DNA/RNA Kit,根據(jù)說明書進(jìn)行具體操作。
[0088] 4、鴨瘟病毒轉(zhuǎn)移載體左右臂的PCR擴(kuò)增
[0089] 1)轉(zhuǎn)移載體左臂的PCR擴(kuò)增
[0090] 以上述2所制備的鴨瘟病毒基因組核酸為模板，經(jīng)條件優(yōu)化，擴(kuò)增左臂的PCR反應(yīng) 體系與反應(yīng)條件如下：
[0091] PCR 反應(yīng)體系：DPV DNA 2uL，gI-F(10pmol/L)2uL，gI-R(10pmol/L)2uL，LA Taq 0.25uL, 10XLA Taq Buffer 2uL, dNTP Mixture 2uL, ddH20 9. 75uL〇
[0092] PCR 反應(yīng)條件：94°C 5min ;94°C 30s，56°C 30s，72°C Imin 30 個循環(huán)；72°C lOmin。
[0093] 擴(kuò)增完畢后，取3uL產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0094] 2)轉(zhuǎn)移載體右臂的PCR擴(kuò)增
[0095] 以上述2所制備的鴨瘟病毒基因組核酸為模板，經(jīng)條件優(yōu)化后，擴(kuò)增右臂的PCR反 應(yīng)體系與反應(yīng)條件如下：
[0096] PCR 反應(yīng)體系：DPV DNA 2uL，gI-F(10pmol/L)2uL，gI-R(10pmol/L)2uL，LA Taq 0.25uL, IOXLA Taq Buffer 2uL, dNTP Mixture 2uL, ddH20 9. 75uL〇
[0097] PCR 反應(yīng)條件：94°C 5min ;94°C 30s，54°C 30s，72°C 90s 30 個循環(huán)；72°C lOmin。
[0098] 擴(kuò)增完畢后，取3uL產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0099] 3)左右同源臂的克隆與鑒定
[0100] 將擴(kuò)增的經(jīng)過鑒定大小正確的PCR產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳加收后按說明書連 接到PMD18-T載體中，分別命名為pMD-gl-L和pMD-gE-R，并將連接的兩個質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒 定。
[0101] 4鴨瘟病毒轉(zhuǎn)移載體pglE-lacZ的構(gòu)建
[0102] 按常規(guī)方法將質(zhì)粒pLS-lacZ、pMD-gl-L和pMD-gE-R分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì) 胞，挑取單克隆菌落進(jìn)行增殖，應(yīng)用堿裂解法小提質(zhì)粒試劑盒分別提取上述質(zhì)粒。應(yīng)用限制 性內(nèi)切酶Bgl II對質(zhì)粒pLS-lacZ進(jìn)行酶切；以Bgl II與BamH I對pMD-gl-L進(jìn)行雙酶 切。酶切體系如下：
[0103] 質(zhì)粒 5uL，IOXBuffer H 5uL，Bgl II luL，BamH I luL，ddH20 38uL。
[0104] 37°C水浴作用3h，電泳回收目的條帶，用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收；T4DNA連接酶 進(jìn)行片段與載體連接，16°C連接過夜，反應(yīng)體系如下：
[0105] T4DNA Ligase IuL, 10XT4DNA Ligase Buffer IuL, pLS-lacZ vector IuL, gl fragment 7uL〇
[0106] 將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布平板，37°C過夜培養(yǎng)， 挑取的克隆應(yīng)用PCR及酶切進(jìn)行鑒定，陽性克隆命名為pgl-lacZ。
[0107] 應(yīng)用限制性內(nèi)切酶Xho I與Pst I分別對質(zhì)粒pgl-lacZ和pMD-gE-R進(jìn)行雙酶切。 酶切體系如下：
[0108] 質(zhì)粒 5uL，IOXBuffer M 5uL，Xho I luL，Pst I luL，ddH20 38uL。
[0109] 37°C水浴作用3h，電泳回收目的條帶，并用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收；T4DNA連接 酶進(jìn)行片段與載體連接，16°C連接過夜，反應(yīng)體系如下：
[0110] T4DNA Ligase luL,10XT4DNA Ligase Buffer IuL, pgl-lacZ vector IuL, gE fragment 7uL〇
[0111] 將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布平板，37°C過夜培養(yǎng)， 挑取的克隆應(yīng)用PCR及酶切進(jìn)行鑒定，陽性克隆命名為pglE-lacZ。對該質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測 序鑒定（圖1)。測序結(jié)果如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種鴨瘟病毒基因缺失轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)移載體是由如下步驟構(gòu) 建： 1) 以鴨瘟病毒為模板，利用序列為SEQ ID NO: 1和序列為SEQ ID NO:2的引物對進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增片段，并連接入載體構(gòu)成質(zhì)粒pMD-gl-L ; 用序列為SEQ ID N0:3和序列為SEQ ID N0:4的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增片段， 并連接入載體構(gòu)成質(zhì)粒pMD-gE-R ; 2) 將pMD-gl-L用Bgl II與BamH I進(jìn)行雙酶切，回收純化片段克隆至已用Bgl II限 制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切并回收的pLS-lacZ載體上，正向連接構(gòu)建成pgl-lacZ質(zhì)粒；應(yīng)用限制 性內(nèi)切酶Xho I與Pst I分別對質(zhì)粒pgl-lacZ和pMD-gE-R進(jìn)行雙酶切，回收純化片段進(jìn) 行連接，制成鴨瘟病毒基因缺失轉(zhuǎn)移載體pglE-lacZ。
2. 如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，所述的pLS-lacZ載體的構(gòu)建方法如 下： 1. Loxp序列設(shè)計與合成： 將兩端分別帶有Nde I與Hind III酶切位點，含兩個同向的34bp的Loxp序列的核苷 酸片段和質(zhì)粒PUC57用Nde I與Hind III分別進(jìn)行酶切，酶切片段連接獲得質(zhì)粒pUC-LS ; 所述的核苷酸片段的序列為SEQ ID NO:5 ; 2. SV40啟動子及l(fā)acZ基因獲得 以PCDNA3. 1(+)為模板，序列為SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7的引物對擴(kuò)增得到片段， 應(yīng)用Bgl II及Xho I雙酶切回收后連接到pUC-LS相應(yīng)的BamH I與Sal I位點內(nèi)，構(gòu)建質(zhì) 粒pLS-neo ;以序列為SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9的引物對擴(kuò)增lacZ基因，應(yīng)用Sma I及 BstX I進(jìn)行雙酶切后連接到pLS-neo對應(yīng)的酶切位點，構(gòu)建得到pLS-lacZ質(zhì)粒。
3. 權(quán)利要求1所述的鴨瘟病毒基因缺失轉(zhuǎn)移載體在制備重組鴨瘟病毒株中的應(yīng)用。
4. 一種重組鴨瘟病毒株，其特征在于，所述的重組鴨瘟病毒株的制備方法如下： 1) 用鴨瘟病毒感染雞胚成纖維（CEF)細(xì)胞； 2) 用權(quán)利要求1所述的重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已感染鴨瘟病毒的CEF細(xì)胞； 3) 待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后收獲轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，反復(fù)凍融后將經(jīng)轉(zhuǎn)染的病毒按一定的稀釋 倍數(shù)接種CEF細(xì)胞； 4) 在X-gal存在條件下進(jìn)行藍(lán)斑篩選，在出現(xiàn)藍(lán)斑的細(xì)胞中覆蓋低溶點營養(yǎng)瓊脂； 5) 挑取出含藍(lán)斑的細(xì)胞毒進(jìn)行凍融； 6) 將凍融的篩選的藍(lán)斑細(xì)胞毒接種CEF細(xì)胞，并覆蓋低溶點營養(yǎng)瓊脂； 7) 重復(fù)上述步驟5)和6)直至獲得純化的含lacZ基因的重組鴨瘟病毒。
5. 權(quán)利要求4所述的重組鴨瘟病毒株在制備去除lacZ基因的重組鴨瘟病毒株中的應(yīng) 用。
6. -種去除lacZ基因的重組鴨瘟病毒，其特征在于，所述的重組鴨瘟病毒株的制備方 法如下： 1) 權(quán)利要求4所述的重組鴨瘟病毒株感染CEF細(xì)胞； 2) 表達(dá)Cre蛋白酶的質(zhì)粒pBS185轉(zhuǎn)染已感染權(quán)利要求4所述的重組鴨瘟病毒株的CEF 細(xì)胞； 3) 待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后，收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞，反復(fù)凍融后按一定稀釋倍數(shù)接種CEF細(xì)胞； 4) 在X-gal條件下進(jìn)行藍(lán)斑篩選，在出現(xiàn)藍(lán)斑的細(xì)胞中覆蓋低溶點營養(yǎng)瓊脂，注意觀 察挑取未呈現(xiàn)藍(lán)色的病毒感染蝕斑細(xì)胞； 5) 反復(fù)凍融挑取的非藍(lán)色的病毒感染蝕斑細(xì)胞； 6) 將反復(fù)凍融的篩選的蝕斑細(xì)胞接種CEF細(xì)胞，在X-gal條件下后覆蓋低溶點營養(yǎng)瓊 脂； 7) 重復(fù)上述步驟5)和6)直至獲得純化的去除lacZ基因的重組鴨瘟病毒rDPV/gl7 gE'
7. 權(quán)利要求4所述的重組鴨瘟病毒株在制備疫苗中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求6所述的重組鴨瘟病毒株在制備疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N7/00GK104480142SQ201410782341
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月16日
【發(fā)明者】趙懷龍, 凌紅麗, 韓成昊, 張園園 申請人:青島蔚藍(lán)生物股份有限公司