一種在疫苗生產(chǎn)中滅活病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種在疫苗生產(chǎn)中滅活病毒的方法，屬于生物制品制備領(lǐng)域。本發(fā)明根據(jù)疫苗病毒液滅活過程中存在的影響抗原穩(wěn)定性、免疫原性、抗原回收率的因素，對疫苗生產(chǎn)滅活過程中溫度控制、攪拌速率、添加甲醛溶液的流速等條件參數(shù)加以改進(jìn)，獲取最優(yōu)的滅活條件，減少滅活過程中抗原損失，并能夠穩(wěn)定抗原結(jié)構(gòu)，提高免疫原性。本發(fā)明方法可保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性、均一性，降低了生產(chǎn)的成本；將滅活操作時間從2.5h左右降低為2h以內(nèi)，減少人員的疲勞，提高了生產(chǎn)效率，同時也避免了疫苗生產(chǎn)中間產(chǎn)品長時間的置于室溫中，間接提高了疫苗的品質(zhì)質(zhì)量。
【專利說明】一種在疫苗生產(chǎn)中滅活病毒的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制品制備領(lǐng)域，具體地說，屬于疫苗滅活方法；更具體地涉及一種 在疫苗生活中使用甲醛滅活病毒的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 甲醛是目前最常用的一種病毒滅活劑，通常運(yùn)用于生物制品中抗原（病毒、菌液 等）的滅活，其滅活作用機(jī)制是：一方面其與微生物蛋白質(zhì)的胺基結(jié)合形成羥甲基衍生物， 隨著作用時間的延長，羥甲基衍生物可再與酰胺發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使微生物喪失毒性和繁殖 能力，但仍能保持良好的免疫性；另一方面甲醛也可以使核酸滅活，其作用是通過與腺嘌 呤、鳥嘌呤、胞嘧啶等含有胺基的堿基結(jié)合而使核酸變性。目前，國內(nèi)外滅活疫苗大多使用 甲醛滅活制備而成：提純后的病毒液（或病毒收獲液）經(jīng)除菌過濾（或粗過濾）后，加入 一定濃度的甲醛溶液滅活，以獲得蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、免疫原性較高的抗原，用于制備疫苗終產(chǎn) 品。
[0003] 病毒液溫度控制在滅活前、滅活過程中十分重要，尤其是甲醛溶液與病毒表面抗 原蛋白混勻的過程中，溫度必須控制在合格的范圍內(nèi)。溫度的上下波動會對抗原的活性造 成重要影響：溫度過高時，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)改變，失去天然活性，抗原損失增加；溫度過 低時，在單位時間內(nèi)不能為蛋白質(zhì)末端基團(tuán)之間形成交聯(lián)鍵提供穩(wěn)定的能量，從而不能很 好地達(dá)到穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的目的。在滅活過程中溫度的差異越小，對蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越 有利，抗原損失率越低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種在疫苗生產(chǎn)中滅活病毒的方法。
[0005] 本發(fā)明的方法包括如下步驟：
[0006] (1)將提純后的病毒液靜置于18-26°c下，甲醛溶液靜置條件同病毒液；
[0007] (2)靜置后的病毒液除菌過濾后，攪拌病毒液；
[0008] (3)甲醛溶液加入病毒液中，邊加入邊攪拌；
[0009] (4)將步驟⑶的病毒液靜置滅活。
[0010] 其中，步驟（1)中病毒液靜置時間不小于5h。
[0011] 本發(fā)明方法中，步驟（2)攪拌病毒液的速度為350-450rpm。
[0012] 優(yōu)選地，步驟（2)攪拌病毒液的速度為350rpm。
[0013] 本發(fā)明方法中，步驟（3)的甲醛溶液是使用pH7. 2的0. Olmol/LPBS溶液與甲醛配 制而成，甲醛的濃度范圍為0. 018?0. 021g/ml。
[0014] 步驟（3)中甲醛溶液加入病毒液的流速控制在60-100ml/min。
[0015] 優(yōu)選地，步驟（3)中甲醛溶液加入病毒液的流速為80ml/min。
[0016] 其中，步驟（3)中加入甲醛溶液，使滅活液中甲醛終濃度范圍為0. 009?0. 0125g/ ml 〇
[0017] 本發(fā)明方法中步驟（3)攪拌速度為350-450rpm。
[0018] 優(yōu)選地，攪拌速度為350rpm。
[0019] 本發(fā)明方法中的步驟（4)靜置滅活條件為36-38°C，3-12天。優(yōu)選37°C，3. 7天。
[0020] 在抗原結(jié)構(gòu)固定過程中，甲醛溶液的濃度要控制在一定的范圍內(nèi)，表面抗原的固 定效果才能達(dá)到最佳。表面抗原的固定過程中，攪拌速度的變化影響病毒純化液中甲醛溶 液的濃度變化，對抗原的活性造成重要影響：攪拌速度過大，會使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化從 而失去活性，抗原損失增加；攪拌速度過慢，液體混合不佳，會阻礙局部能量的傳遞，蛋白質(zhì) 末端基團(tuán)不能形成穩(wěn)定的交聯(lián)鍵，進(jìn)而影響蛋白結(jié)構(gòu)的固定，最終導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，滅 活效果不佳。因此，本發(fā)明針對病毒液和甲醛的平衡溫度、攪拌速度、甲醛溶液流速等方面 進(jìn)行摸索和條件優(yōu)化，獲得了本發(fā)明的滅活病毒的方法。使用的磁力攪拌器攪拌速度達(dá)到 350rpm時，剛好使病毒液在滅活桶中形成漩渦狀，而450rpm為滅活液攪拌時可使用的最大 速度，再增加速度則可導(dǎo)致病毒液液面上升，超出滅活桶盛裝高度。對于甲醛的流速，發(fā)明 人發(fā)現(xiàn)流速過快可導(dǎo)致局部甲醛溶液濃度過高，抗原發(fā)生聚集，使得檢測到的抗原含量降 低，而甲醛加入流速過緩，會增加滅活工藝的時限，并帶來污染風(fēng)險。本發(fā)明方法能夠減少 滅活過程中抗原損失，并能夠穩(wěn)定抗原結(jié)構(gòu)，提高免疫原性。本發(fā)明方法可保證產(chǎn)品質(zhì)量的 穩(wěn)定性、均一性，降低了生產(chǎn)的成本；將滅活操作時間從2. 5h左右降低為2h以內(nèi)，減少人員 的疲勞，提高了生產(chǎn)效率，同時也避免了疫苗生產(chǎn)中間產(chǎn)品長時間的置于室溫中，間接提高 了疫苗的品質(zhì)質(zhì)量。

【具體實施方式】
[0021] 以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0022] 若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0023] 實施例1
[0024] 1、經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)2BS (人二倍體）細(xì)胞獲取甲肝病毒收獲液。
[0025] 2、甲肝病毒收獲液經(jīng)過初提純、精提純后獲得較為純凈的甲肝病毒液。
[0026] 3、滅活甲肝病毒液：
[0027] 1)房間清潔消毒，純化后甲肝病毒液、甲醛溶液置于室溫（18-26°C )下過夜（大 于5小時）平衡。
[0028] 2)甲肝病毒液除菌過濾：將甲肝病毒液接入甲肝病毒液除菌過濾系統(tǒng)，過濾完成 后以350-450rpm轉(zhuǎn)速攪拌混勾過濾后甲肝病毒液。
[0029] 3)滅活：將除菌過濾后濃度范圍為0. 018?0. 021g/ml的甲醛溶液經(jīng)滅活系統(tǒng)加 入病毒液中，使甲醛溶液在滅活液中的終濃度范圍為〇. 009?0. 0125g/ml的并保持上一步 驟中350-450rpm的轉(zhuǎn)速以實現(xiàn)滅活操作。添加甲醛溶液的流速控制在60-100ml/min范圍。
[0030] 4)、滅活操作結(jié)束，甲肝滅活病毒液置于37±1°C環(huán)境中滅活12天。
[0031] 4、取樣：滅活開始后，每天取樣10ml，檢驗滅活效果；滅活12天各取樣5ml，檢測 抗原含量。
[0032] 5、數(shù)據(jù)及分析：
[0033] 表1甲醛溶液滅活甲肝病毒試驗數(shù)據(jù)
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種在疫苗生產(chǎn)中滅活病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將提純后的病毒液靜置于18-26°C下，甲醛溶液靜置條件同病毒液； (2) 靜置后的病毒液除菌過濾后，攪拌病毒液； (3) 甲醛溶液加入病毒液中，邊加入邊攪拌； (4) 將步驟（3)的病毒液靜置滅活。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中病毒液靜置時間不小于5h。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)攪拌病毒液的速度為350-450rpm。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)攪拌病毒液的速度為350rpm。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3)的甲醛溶液是使用pH7. 2的 0. Olmol/L PBS溶液配制，其濃度范圍為0. 018?0. 021g/ml。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟⑶中甲醛溶液加入病毒液的流速控制 在 60-100ml/min〇
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3)中甲醛溶液加入病毒液的流速為 80ml/min〇
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3)中加入甲醛溶液，使滅活液中甲醛 終濃度范圍為0. 009?0. 0125g/ml。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3)攪拌速度為350-450rpm。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中的步驟（4)靜置滅活條件為36-38°C， 3-12 天。
【文檔編號】C12R1/93GK104498446SQ201410776235
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月15日
【發(fā)明者】馬敏華, 張健, 張穎, 董興華, 張星星, 李靜, 尹衛(wèi)東 申請人:北京科興生物制品有限公司