一種石油降解菌固體菌劑的制備方法及由其制備的固體菌劑修復(fù)石油污染的土壤的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種石油降解菌固體菌劑的制備方法，具體步驟如下：A、石油降解菌的篩選、馴化、B、制備種子培養(yǎng)液、C、固體菌劑的發(fā)酵、D、堆制產(chǎn)品干燥、粉化、計(jì)量、包裝。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明以非離子表面活性劑聚山梨酯-80(土溫80)作為增溶劑，能夠提高石油的溶解效果。本發(fā)明專利所用固體發(fā)酵原料易得、工藝較簡(jiǎn)單，固體菌劑含有大量碳素及營(yíng)養(yǎng)元素，為細(xì)菌生長(zhǎng)提供更合適的基質(zhì)，對(duì)微生物親和力強(qiáng)，固定化效率高。提高所投加微生物與土著微生物的競(jìng)爭(zhēng)力和降解效率。固體菌劑便于運(yùn)輸和農(nóng)業(yè)操作，適用于石油污染土壤的大規(guī)模原位生物修復(fù)。
【專利說(shuō)明】一種石油降解菌固體菌劑的制備方法及由其制備的固體菌 劑修復(fù)石油污染的土壤的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及石油污染土壤微生物修復(fù)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種石油降解菌固體菌 劑的制備方法及由其制備的固體菌劑修復(fù)石油污染的土壤的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，人類引發(fā)的土壤環(huán)境問(wèn)題日益嚴(yán)重。土壤作為人類不可再 生的資源，是人類賴以生存的基礎(chǔ)。工農(nóng)業(yè)排放的有毒有害物質(zhì)與日俱增，對(duì)土壤所造成的 有機(jī)污染呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。其中，在石油的開(kāi)發(fā)、運(yùn)輸、加工及儲(chǔ)運(yùn)等過(guò)程中排放的石油對(duì)土壤 環(huán)境的危害尤為嚴(yán)重。石油是由多種化學(xué)物質(zhì)組成的混合物，這些物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)不同，主要 包括芳香烴、飽和烴、樹(shù)脂類、瀝青等。土壤中過(guò)量的石油烴可能會(huì)在植物體內(nèi)過(guò)量殘留與 積累，通過(guò)食物鏈的富集作用使人類的身心健康受到損害。另外，石油中某些污染物成分會(huì) 隨降水滲透到土壤淺層地下水，污染地下水水質(zhì)，最終危害人體健康。其中對(duì)人體危害較大 的是多環(huán)芳烴（PAHS)類物質(zhì)，多環(huán)芳烴具有致畸性、致癌性和致突變性等作用，而低沸點(diǎn) 的潤(rùn)滑油類及燃料油能引起人體的化學(xué)性肺炎、皮炎、麻醉和窒息等危害。
[0003] 目前，我國(guó)石油污染土壤修復(fù)法包括三種：物理修復(fù)法、化學(xué)修復(fù)法和生物修復(fù) 法。與物理、化學(xué)修復(fù)法相比，生物修復(fù)方法具有低成本、無(wú)二次污染和處理功效較好等 優(yōu)點(diǎn)。生物法主要包括微生物修復(fù)、植物修復(fù)及植物-微生物聯(lián)合修復(fù)三種。微生物修 復(fù)技術(shù)是利用土壤中的土著微生物或向污染環(huán)境補(bǔ)充經(jīng)馴化的高效微生物，在優(yōu)化的環(huán) 境條件下，加速分解污染物，修復(fù)被污染的土壤。植物修復(fù)是以太陽(yáng)能為動(dòng)力，利用植物 修復(fù)土壤中石油等有機(jī)污染物的一項(xiàng)綠色技術(shù)（易筱筠，黨志，石林，等.有機(jī)污染 物污染土壤的植物修復(fù)[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)，2002, 21 (5) :477-479)，具有處理成本低、生 物量大、美化環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，成為人們?nèi)コ廴疚锏氖走x技術(shù)（宋玉芳，許華夏，任麗萍， 等.兩種植物條件下土壤中礦物油和多環(huán)芳烴（PAHs)的生物修復(fù)研宄[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué) 報(bào)，2001，12 (1) : 108-112.)。植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)作為一項(xiàng)新興技術(shù)，發(fā)揮了植物 修復(fù)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)彌補(bǔ)了單純微生物修復(fù)具有生物量小、去污能力弱、處理費(fèi)用高的不 足。植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)是迄今為止處理石油污染土壤比較好的一種方法，其具有 廣闊市場(chǎng)和發(fā)展前景。
[0004] 微生物修復(fù)技術(shù)在早期便有研宄，已衍生出就地處理、原位處理和生物反應(yīng) 器三種微生物修復(fù)方式，該類技術(shù)已廣泛應(yīng)用于石油污染土壤的修復(fù)（沈鐵孟，黃國(guó) 強(qiáng)，李凌，等.石油污染土壤生物通風(fēng)修復(fù)及其強(qiáng)化技術(shù)[J].環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè) 備，2002, 3(7) :67-69)。李培軍利用生物堆制法對(duì)不同類型石油污染土壤進(jìn)行修復(fù)，60d后 石油總烴去除率為38. 37%?56. 74%，處理費(fèi)用相對(duì)較低（李培軍，郭書(shū)海，孫鐵布.不 同類型原油污染土壤生物修復(fù)技術(shù)研宄[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，13(11):1455-1458.)。 國(guó)內(nèi)在植物修復(fù)方面的研宄尚處在起步階段，在植物與微生物聯(lián)合修復(fù)方面的研宄更是少 有報(bào)道，而我國(guó)豐富的植物資源為研宄工作提供充足的素材，因此，應(yīng)充分利用這方面的優(yōu) 勢(shì)，探宄植物和微生物對(duì)石油污染土壤的聯(lián)合修復(fù)作用。
[0005] 植物一微生物聯(lián)合修復(fù)效果主要取決于植物一微生物系統(tǒng)對(duì)有機(jī)污染物的吸收 和代謝能力，土壤中有機(jī)污染物通過(guò)植物及其根際微生物共存體系得到凈化。植物一微生 物聯(lián)合體系對(duì)有機(jī)污染物具有良好的降解作用。其基本原理為：1)植物根區(qū)分泌物對(duì)細(xì) 菌的轉(zhuǎn)化具有刺激作用；2)植物為微生物提供生存場(chǎng)所并可轉(zhuǎn)移氧氣使根區(qū)的好氧轉(zhuǎn)化 作用能夠正常進(jìn)行，這也是植物促進(jìn)根區(qū)微生物礦化作用的機(jī)制（Anderson T. A.，Guthrie E. A. , Walton B. T. . Bioremediation in the rhizophere, plant roots and associated microbes clean contaminated soil[J]?Environ. Sci. Technol.，1993(27):2630-2636.)〇
[0006] 19世紀(jì)已經(jīng)出現(xiàn)生產(chǎn)酵母菌體的工業(yè)發(fā)酵過(guò)程，并采用了通氣和補(bǔ)料的技術(shù)；20 世紀(jì)70年代出現(xiàn)了微生物單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)。發(fā)酵是微生物在人工培養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)并形 成代謝產(chǎn)物的過(guò)程，也是微生物菌劑生產(chǎn)的常用方法。目前微生物活菌制劑類產(chǎn)品主要有 固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩種方式。固態(tài)發(fā)酵是微生物在沒(méi)有或基本沒(méi)有游離水的固態(tài)基質(zhì)上 的發(fā)酵方式，固態(tài)基質(zhì)中氣、液、固三相并存，即多孔性的固態(tài)基質(zhì)中含有水和水不溶性物 質(zhì)。微生物修復(fù)石油污染土壤技術(shù)的大面積推廣就需要大量的微生物菌劑，國(guó)內(nèi)對(duì)石油降 解菌劑的研宄只開(kāi)展了實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模培養(yǎng)，沒(méi)有實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007] 現(xiàn)已有報(bào)道關(guān)于以石油烴為唯一碳源篩選石油降解菌的方法，但大多是以單一石 油烴或幾種石油烴及其中間產(chǎn)物為碳源進(jìn)行篩選，其培養(yǎng)環(huán)境與石油污染土壤中石油烴種 類繁多的實(shí)際情況相差甚遠(yuǎn)，因此該條件下篩選的菌種在實(shí)際石油污染土壤中的生存能 力、降解效率不夠理想，將其用于石油污染土壤的治理工程中的實(shí)際效果得不到保障。
[0008] 現(xiàn)有石油降解菌的篩選技術(shù)大部分以實(shí)驗(yàn)室研宄為主，以某種單組份石油烴為底 物進(jìn)行菌種篩選，再以該石油烴為底物評(píng)價(jià)所篩選菌種的降解效果，也僅僅是實(shí)驗(yàn)室小試 規(guī)模的菌種培養(yǎng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種石油降解菌固體菌劑的制 備方法及由其制備的固體菌劑修復(fù)石油污染的土壤的方法。
[0010] 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0011] 一種石油降解菌固體菌劑的制備方法，具體步驟如下：
[0012] A、石油降解菌的篩選、馴化
[0013] 1)菌源的采集
[0014] 取煉油廠常年被石油污染的土壤作為石油降解土著菌菌源。
[0015] 2)石油降解土著菌的初篩
[0016] (1)取作為石油降解土著菌菌源的土壤樣品，加入盛有無(wú)菌水的錐形瓶中，置于振 蕩培養(yǎng)箱中室溫振蕩〇. 5?2h，振蕩頻率為200rpm ;
[0017] (2)從步驟（1)的錐形瓶中取上清液，接入富集培養(yǎng)基，在溫度30°C、轉(zhuǎn)速175rpm 搖床上振蕩培養(yǎng)48h。取培養(yǎng)后的富集液涂布到篩選培養(yǎng)基平板上，30°C恒溫培養(yǎng)48h。
[0018] 3)馴化
[0019] 用接種環(huán)挑取上述初篩得到的多株單一菌株在馴化培養(yǎng)基中進(jìn)行接種馴化，具體 步驟為：先用接種環(huán)挑取初篩得到的多株單一菌株分別接種到l〇〇mL馴化培養(yǎng)基A中，培 養(yǎng)一個(gè)周期（在溫度30°C、轉(zhuǎn)速175rpm恒溫振蕩下培養(yǎng)7d為一個(gè)周期），然后從馴化培養(yǎng) 基A中取出10mL培養(yǎng)液加入到90mL的馴化培養(yǎng)基B中，培養(yǎng)一個(gè)周期。再?gòu)鸟Z化培養(yǎng)基B 中取出10mL培養(yǎng)液加入到90mL馴化培養(yǎng)基C中，培養(yǎng)一個(gè)周期。從馴化培養(yǎng)基C中取出 10mL培養(yǎng)液加入到90mL馴化培養(yǎng)基D中，培養(yǎng)一個(gè)周期。從馴化培養(yǎng)基D中取出10mL培 養(yǎng)液加入到90mL的馴化培養(yǎng)基E中，培養(yǎng)一個(gè)周期，從馴化培養(yǎng)基A到馴化培養(yǎng)基E，石油 濃度梯度逐級(jí)升高。
[0020] 4)菌種的純化
[0021] (1)取馴化后的培養(yǎng)液，在含油平板上劃線，30°C培養(yǎng)7d ;
[0022] (2)從含油平板上挑取單菌落轉(zhuǎn)接LB斜面，30°C培養(yǎng)24h ;
[0023] (3)由LB斜面再次接種含油平板；
[0024] (4)重復(fù)上述步驟，直至得到形態(tài)單一的純化菌落；
[0025] (5)純化后的菌落接種于菌種保藏培養(yǎng)基斜面上，30°C培養(yǎng)24h后，保存于4°C冰 箱中，備用。
[0026] B、制備種子培養(yǎng)液
[0027] 將純化得到的石油降解菌株分別單獨(dú)接種在種子培養(yǎng)基中，經(jīng)一級(jí)種子、二級(jí)種 子、種子罐逐步擴(kuò)大培養(yǎng)后，作為液體種子；液體種子的菌體密度達(dá)到l*10 7cfu ;其中：一 級(jí)種子米用固態(tài)培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C，培養(yǎng)24小時(shí)；二級(jí)種子為液態(tài)培養(yǎng)基 搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C，轉(zhuǎn)速175rpm，培養(yǎng)10-12小時(shí)；種子罐培養(yǎng)條件為液體培養(yǎng)基 攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C恒溫，轉(zhuǎn)速80rpm，通氣量1:1。
[0028] C、固體菌劑的發(fā)酵
[0029] 將經(jīng)空氣干燥后的廢棄物生物質(zhì)原料，粉碎或輾碎成1-5_的顆粒狀；將生物質(zhì) 顆粒及其他配料裝在耐高溫的塑料袋中，110°c滅菌1小時(shí)待用；
[0030] 將種子罐中的種子培養(yǎng)液按照重量比10:1的固液比噴灑到堆料表面，將發(fā)酵種 子培養(yǎng)液與固體發(fā)酵培養(yǎng)基均勻混合；將接種后的物料放到固體發(fā)酵床上在28-30°C條件 下進(jìn)行增殖培養(yǎng)3-5天，則制得微生物固定化材料；
[0031] 將步驟B中的一級(jí)種子液按比例l:10(v/w)接入處理好的固定化載體中，保持水 分50-55%，在28-30°C條件下吸附、固定、增值3-5天；按上述方法增值3次，即得固定化菌 劑。
[0032] D、堆制產(chǎn)品干燥、粉化、計(jì)量、包裝
[0033] 將固定化菌劑在溫度為40?60°C條件下干燥，至含水量為6?10%，將菌劑粉 碎，過(guò)5mm篩。
[0034] 在上述方案的基礎(chǔ)上，步驟A和B中所使用的培養(yǎng)基中均含有石油和聚山梨酯-80 的增溶液。
[0035] 在上述方案的基礎(chǔ)上，所述石油和聚山梨酯-80的增溶液中石油質(zhì)量濃度為2%， 聚山梨酯-80質(zhì)量濃度為4%，剩余為水。
[0036] 在上述方案的基礎(chǔ)上，所述富集培養(yǎng)基為：
[0037] 含石油0.025g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 0.5g，（NH4)2S040.1g， MgS04 ? 7H20 0? 025g，KN030 . 24g，KH2P040. 57g，pH 值 7. 2,蒸餾水 1000mL，0. IMPa，121°C，高 壓蒸汽滅菌20min。
[0038] 所述篩選培養(yǎng)基為：
[0039] 含石油0. 025g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，瓊脂20g，NaCl 0. 5g， (NH4)2S040. lg，MgS04 ? 7H20 0? 025g，KN030 . 24g，KH2P040. 57g，pH 值 7. 2,蒸餾水 1000mL， 0. IMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。
[0040] 所述馴化培養(yǎng)基A為：
[0041] 含石油0? 025g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P040. 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl20. 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 1000mL，pH 值 7. 2,0. lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。
[0042] 所述馴化培養(yǎng)基B為：
[0043] 含石油0? 050g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P040. 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl20. 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 1000mL，pH 值 7. 2,0. lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。
[0044] 所述馴化培養(yǎng)基C為：
[0045] 含石油0? 075g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P040. 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl20. 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 1000mL，pH 值 7. 2,0. lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。
[0046] 所述馴化培養(yǎng)基D為：
[0047] 含石油0? 100g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P040. 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl20. 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 1000mL，pH 值 7. 2,0. lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。
[0048] 所述馴化培養(yǎng)基E為：
[0049] 含石油0? 125g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P040. 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl20. 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 1000mL，pH 值 7. 2,0. lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。
[0050] 所述含油平板用培養(yǎng)基為：
[0051] 含石油0? 125g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P040. 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl20. 2g，微量元素溶液 lmL，瓊脂 20g，蒸餾水 1000mL，pH 值 7. 2,0. IMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。
[0052] LB斜面用培養(yǎng)基為：
[0053] 蛋白胨 10g，酵母粉 5g，NaCl 5g，瓊脂 20g，蒸餾水 1000mL，pH 值 7. 0,0? IMPa， 121°C，高壓蒸汽滅菌20min。
[0054] 微量元素溶液：MnS0439 . 9mg，ZnS04 ? 7H20 42. 8mg，F(xiàn)eCl2 ? 4H20 15. 73mg， CuS0440mg，蒸饋水 1000mL。
[0055] 菌種保藏培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaC15g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH值 7. 2 ?7. 4,0. IMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。
[0056] 上述方法制備的石油降解菌固體菌劑用于修復(fù)石油污染的土壤。具體的方法為： 將所制備的石油降解菌固體菌劑按照10-100公斤/畝土地投加于石油污染土壤中，同時(shí)輔 助施加化肥和有機(jī)肥，翻耕0-30cm表土混勻，同時(shí)種植玉米、黃豆和苜蓿三種作物中的一 種。
[0057] 本發(fā)明的有益效果是：
[0058] (1)本發(fā)明以非離子表面活性劑聚山梨酯-80 ( 土溫80)作為增溶劑，先制備石油 聚山梨酯-80增溶液，再將一定量的石油聚山梨酯-80增溶液加入到培養(yǎng)基中，能夠提高石 油的溶解效果，解決石油在培養(yǎng)基中溶解難的問(wèn)題。
[0059] (2)真正做到以石油為唯一碳源，在石油降解菌的初篩、馴化、純化、種子液的制備 及固體菌劑的發(fā)酵等過(guò)程中培養(yǎng)基均以石油聚山梨酯-80增溶液為碳源。在菌株馴化過(guò)程 中馴化培養(yǎng)基中的石油濃度梯度逐漸升高，菌株逐漸馴化而適應(yīng)含油培養(yǎng)基，因此該條件 下篩選的菌種在實(shí)際土壤中的生存能力、降解效率得到提高，將其用于石油污染土壤治理 工程中的實(shí)際效果得到保障。
[0060] (3)本發(fā)明專利中石油降解菌的篩選包括初篩、馴化、復(fù)篩及純化等過(guò)程，菌株在 石油濃度梯度逐漸升高的馴化培養(yǎng)基中，逐漸被馴化，適應(yīng)以石油為單一碳源的生長(zhǎng)繁殖， 提高其對(duì)石油的耐受力及其降解效率。
[0061] (4)本發(fā)明專利所用固體發(fā)酵原料易得、工藝較簡(jiǎn)單，固體菌劑含有大量碳素及營(yíng) 養(yǎng)元素，為細(xì)菌生長(zhǎng)提供更合適的基質(zhì)，對(duì)微生物親和力強(qiáng)，固定化效率高。提高所投加微 生物與土著微生物的競(jìng)爭(zhēng)力和降解效率。固體菌劑便于運(yùn)輸和農(nóng)業(yè)操作，適用于石油污染 土壤的大規(guī)模原位生物修復(fù)。
[0062] (5)本發(fā)明通過(guò)紫花苜蓿和石油高效降解混合菌劑聯(lián)合作用來(lái)強(qiáng)化修復(fù)石油污染 土壤。該方法投資較少，工程量小，技術(shù)要求較低，作為一種綠色原位修復(fù)不造成二次污染， 同時(shí)不會(huì)破壞土壤生態(tài)環(huán)境，還有助于改善土壤退化和生產(chǎn)力下降等問(wèn)題。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】：
[0063] 圖1為馴化后各菌株的菌體生長(zhǎng)量和石油降解率；
[0064] 圖2為土壤中不同時(shí)期總菌群數(shù)；
[0065] 圖3為土壤中不同時(shí)期總石油烴的去除率。

【具體實(shí)施方式】
[0066] 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0067] 實(shí)施例1
[0068] 高效石油降解菌菌株的篩選
[0069] 1、石油降解土著菌菌源的采集
[0070] 取山東省勝利油田煉油廠儲(chǔ)油罐附近常年被石油污染的土壤作為石油降解土著 菌菌源。采樣方法：用小鐵鍬取厚度為l〇cm的土壤樣品，多點(diǎn)采樣后混合均勻，取土樣3kg 帶回實(shí)驗(yàn)室備用。
[0071] 2、石油聚山梨酯-80增溶液制備
[0072] 表面活性劑在水溶液中達(dá)到臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC)后，一些水不溶性或微溶性物質(zhì)在膠束溶液中的溶解度可顯著增加， 形成透明膠體溶液，這種作用稱為增溶（solubilization)。聚山梨酯-80(聚氧乙稀脫水山 梨醇脂肪酸脂）為水溶性非離子表面活性劑，由于非離子表面活性劑不受電解質(zhì)和pH值影 響，不具有殺菌性能，且其HLB值（親水親油平衡值，hydrophile-lipophile balance, HLB) 為15. 0適合做增溶劑，適合做水包油（0/W)型乳化液。聚山梨酯-80可提高石油在水體中 的溶解度，使其在石油聚山梨酯-80增溶液中分散更均勻，本發(fā)明以石油梨酯-80增溶液為 唯一碳源制備各種微生物培養(yǎng)基。原油濃度和聚山梨酯-80濃度對(duì)增溶液乳化效果的影響 如表1、表2所不。
[0073] 表1原油濃度對(duì)增溶劑乳化效果的影響
[0074]

【權(quán)利要求】
1. 一種石油降解菌固體菌劑的制備方法，其特征在于：具體步驟如下： A、 石油降解菌的篩選、馴化 1) 菌源的采集 取煉油廠常年被石油污染的土壤作為石油降解土著菌菌源。 2) 石油降解土著菌的初篩 (1) 取作為石油降解土著菌菌源的土壤樣品，加入盛有無(wú)菌水的錐形瓶中，置于振蕩培 養(yǎng)箱中室溫振蕩0. 5?2h，振蕩頻率為200rpm ; (2) 從步驟（1)的錐形瓶中取上清液，接入富集培養(yǎng)基，在溫度30°C、轉(zhuǎn)速175rpm搖床 上振蕩培養(yǎng)48h。取培養(yǎng)后的富集液涂布到篩選培養(yǎng)基平板上，30°C恒溫培養(yǎng)48h。 3) 馴化 用接種環(huán)挑取上述初篩得到的多株單一菌株在馴化培養(yǎng)基中進(jìn)行接種馴化，具體步驟 為：先用接種環(huán)挑取初篩得到的多株單一菌株分別接種到l〇〇mL馴化培養(yǎng)基A中，培養(yǎng)一個(gè) 周期（在溫度30°C、轉(zhuǎn)速175rpm恒溫振蕩下培養(yǎng)7d為一個(gè)周期），然后從馴化培養(yǎng)基A中 取出10mL培養(yǎng)液加入到90mL的馴化培養(yǎng)基B中，培養(yǎng)一個(gè)周期。再?gòu)鸟Z化培養(yǎng)基B中取 出10mL培養(yǎng)液加入到90mL馴化培養(yǎng)基C中，培養(yǎng)一個(gè)周期。從馴化培養(yǎng)基C中取出10mL 培養(yǎng)液加入到90mL馴化培養(yǎng)基D中，培養(yǎng)一個(gè)周期。從馴化培養(yǎng)基D中取出10mL培養(yǎng)液 加入到90mL的馴化培養(yǎng)基E中，培養(yǎng)一個(gè)周期，從馴化培養(yǎng)基A到馴化培養(yǎng)基E，石油濃度 梯度逐級(jí)升高。 4) 菌種的純化 (1) 取馴化后的培養(yǎng)液，在含油平板上劃線，30°C培養(yǎng)7d ; (2) 從含油平板上挑取單菌落轉(zhuǎn)接LB斜面，30°C培養(yǎng)24h ; (3) 由LB斜面再次接種含油平板； (4) 重復(fù)上述步驟，直至得到形態(tài)單一的純化菌落； (5) 純化后的菌落接種于菌種保藏培養(yǎng)基斜面上，30°C培養(yǎng)24h后，保存于4°C冰箱中， 備用。 B、 制備種子培養(yǎng)液 將純化得到的石油降解菌株分別單獨(dú)接種在種子培養(yǎng)基中，經(jīng)一級(jí)種子、二級(jí)種子、種 子罐逐步擴(kuò)大培養(yǎng)后，作為液體種子；液體種子的菌體密度達(dá)到l*107cfu ;其中：一級(jí)種子 采用固態(tài)培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C，培養(yǎng)24小時(shí)；二級(jí)種子為液態(tài)培養(yǎng)基搖床培 養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C，轉(zhuǎn)速175rpm，培養(yǎng)10-12小時(shí)；種子罐培養(yǎng)條件為液體培養(yǎng)基攪拌培 養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C恒溫，轉(zhuǎn)速80rpm，通氣量1:1。 C、 固體菌劑的發(fā)酵 將經(jīng)空氣干燥后的廢棄物生物質(zhì)原料，粉碎或輾碎成1-5_的顆粒狀；將生物質(zhì)顆粒 及其他配料裝在耐高溫的塑料袋中，ll〇°C滅菌1小時(shí)待用； 將種子罐中的種子培養(yǎng)液按照重量比10:1的固液比噴灑到堆料表面，將發(fā)酵種子培 養(yǎng)液與固體發(fā)酵培養(yǎng)基均勻混合；將接種后的物料放到固體發(fā)酵床上在28-30°C條件下進(jìn) 行增殖培養(yǎng)3-5天，則制得微生物固定化材料； 將步驟B中的一級(jí)種子液按比例l:10(V/w)接入處理好的固定化載體中，保持水分 50-55%，在28-30°C條件下吸附、固定、增值3-5天；按上述方法增值3次，即得固定化菌 劑。 D、堆制產(chǎn)品干燥、粉化、計(jì)量、包裝 將固定化菌劑在溫度為40?60°C條件下干燥，至含水量為6?10%，將菌劑粉碎，過(guò) 5mm 篩。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石油降解菌固體菌劑的制備方法，其特征在于：步驟A 和B中所使用的培養(yǎng)基中均含有石油和聚山梨酯-80的增溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種石油降解菌固體菌劑的制備方法，其特征在于：所述石 油和聚山梨酯-80的增溶液中石油質(zhì)量濃度為2%，聚山梨酯-80質(zhì)量濃度為4%，剩余為 水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的一種石油降解菌固體菌劑的制備方法，其特征在 于： 所述富集培養(yǎng)基為： 含石油0. 025g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 0. 5g，（NH4)2S04 0. lg， MgS04 ? 7H20 0? 025g，KN03 0? 24g，KH2P04 0? 57g，pH 值 7. 2,蒸餾水 1000mL，0. IMPa，121°C， 高壓蒸汽滅菌20min。 所述篩選培養(yǎng)基為： 含石油0? 025g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，瓊脂20g，NaC10. 5g，（NH4)2S04 0? lg， MgS04 ? 7H20 0? 025g，KN03 0? 24g，KH2P04 0? 57g，pH 值 7. 2,蒸餾水 1000mL，0. IMPa，121°C， 高壓蒸汽滅菌20min。 所述馴化培養(yǎng)基A為： 含石油0? 025g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P04 0? 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl2 0? 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 1000mL，pH 值 7. 2,0. lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。 所述馴化培養(yǎng)基B為： 含石油0? 050g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P04 0? 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl2 0? 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 1000mL，pH 值 7. 2,0. lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。 所述馴化培養(yǎng)基C為： 含石油0? 075g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P04 0? 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl2 0? 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 1000mL，pH 值 7. 2,0. lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。 所述馴化培養(yǎng)基D為： 含石油0? 100g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P04 0? 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl2 0? 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 1000mL，pH 值 7. 2,0. lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。 所述馴化培養(yǎng)基E為： 含石油0? 125g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P04 0? 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl2 0? 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 1000mL，pH 值 7. 2,0. lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。 所述含油平板用培養(yǎng)基為： 含石油0? 125g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P04 0? 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl2 0? 2g，微量元素溶液 lmL，瓊脂 20g，蒸餾水 1000mL，pH 值 7. 2,0. IMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。 LB斜面用培養(yǎng)基為： 蛋白胨 10g，酵母粉 5g，NaCl 5g，瓊脂 20g，蒸餾水 1000mL，pH 值 7.0,0. lMPa，121°C，高 壓蒸汽滅菌20min。 微量元素溶液：MnS04 39 . 9mg，ZnS04 ? 7H20 42. 8mg，F(xiàn)eCl2 ? 4H2015. 73mg，CuS04 40mg， 蒸饋水lOOOmL。 菌種保藏培養(yǎng)基：牛肉膏5§，蛋白胨1(^，似(：15§，瓊脂2(^，蒸餾水100〇1^，？11值7.2? 7. 4,0? IMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。
5. 權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)制備的石油降解菌固體菌劑用于修復(fù)石油污染的土壤。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的石油降解菌固體菌劑用于修復(fù)石油污染的土壤，其特征在 于：具體的方法為：將所制備的石油降解菌固體菌劑按照10-100公斤/畝土地投加于石油 污染土壤中，同時(shí)輔助施加化肥和有機(jī)肥，翻耕0-30cm表土混勻，同時(shí)種植玉米、黃豆和苜 蓿三種作物中的一種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的石油降解菌固體菌劑用于修復(fù)石油污染的土壤，其特征在 于：所述苜蓿為紫花苜蓿。
【文檔編號(hào)】C12N1/36GK104450597SQ201410756751
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】鄭慶柱, 田俠 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)