抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因大豆的方法，為將外源DNA片段插入目的大豆基因組第17號染色體的第7,980,527-7,980,541位間，得到轉(zhuǎn)基因大豆。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因大豆對高劑量的草甘膦具有耐受性，可進一步通過與優(yōu)良大豆株系雜交來改良以優(yōu)化其他農(nóng)藝性狀如產(chǎn)量、品質(zhì)等。本發(fā)明的檢測方法可以鑒定插入的T-DNA和植物基因組DNA的結(jié)合區(qū)域并進一步鑒定轉(zhuǎn)基因大豆及其后代的細胞、組織、器官、制品等。
【專利說明】抗草甘麟轉(zhuǎn)基因大豆及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)或育種領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因大豆及其 應(yīng)用，更具體地，本發(fā)明涉及抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆及其制備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 大豆（Glycine max(L. ). Merr)起源于中國，是重要的油料作物和經(jīng)濟作物，也是 食用植物油與植物蛋白質(zhì)的主要來源。雜草是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，雜草與作 物競爭光、水、養(yǎng)分等資源，使作物減產(chǎn)。因此，大豆田間雜草的有效防除是大豆穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的 關(guān)鍵因素之一。傳統(tǒng)的人工除草包括手工拔草和使用簡單農(nóng)具除草等，耗時耗力，功效低且 不能大面積及時防除。除草劑的使用大大提高了農(nóng)田雜草的防治效率，傳統(tǒng)除草劑氯嘧磺 隆、甲磺隆等在土壤中殘留嚴重、污染環(huán)境，使用范圍較小。
[0003] 草甘膦（Glyphosate)為內(nèi)吸傳導(dǎo)型、廣譜滅生性除草劑，具有殺草譜廣、高效、低 毒、無殘留等優(yōu)點，尤其對人畜毒害小，是全球應(yīng)用范圍最廣的除草劑之一，其作用機制是 通過不可逆地與植物體內(nèi)EPSPS合酶（5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶）結(jié)合催化植 物和微生物體內(nèi)莽草酸的代謝途徑，擾亂莽草酸合成途徑導(dǎo)致代謝過程紊亂，干擾蛋白質(zhì) 合成，阻止次生產(chǎn)物的形成，最終使植株死亡；另一個重要的作用機理是抑制植物的光合磷 酸化。但草甘膦在殺滅雜草的同時也傷害大豆，培育抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物是保護作物不受 草甘膦傷害，提高雜草綜合防治效率的重要途徑之一。已有的研宄和轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā) 展歷史證明大豆對除草劑草甘膦的耐受性將是對于雜草防除、管理的有用性狀。
[0004] 為賦予農(nóng)作物草甘膦的耐受性，研宄者集中于向植物體內(nèi)導(dǎo)入能增加草甘膦耐受 性的基因，如EPSPS，EPSPS基因通常來自于微生物，具有草甘膦抗性，因而在存在草甘膦的 情況下保持了他們的催化活性（PCT/CN03/00651)。當前全球商業(yè)化種植的草甘膦抗性轉(zhuǎn)基 因作物絕大多數(shù)為針對EPSPS所設(shè)計。
[0005] 在植物組織中N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（GAT)能夠通過N-乙?；饔檬沟貌莞熟⒈挥行У?降解，從而失去除草劑活性，且乙?；牟莞熟⒉皇荅PSPS的有效作用底物，從而賦予植物 對草甘膦的耐受性（ZL 2005 1 0086626. X)。利用N-乙?；氖侄闻嘤D(zhuǎn)基因作物可以使 得草甘膦在植物整個生長周期都可以應(yīng)用，不受生長發(fā)育階段的限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因大豆的方法。
[0007] 本發(fā)明提供的方法，為將外源DNA片段插入目的大豆基因組第17號染色體的第 7, 980, 527-7, 980, 541位間，替換掉第17號染色體的第7, 980, 527-7, 980, 541位間13bp的 堿基序列，得到轉(zhuǎn)基因大豆；
[0008] 所述轉(zhuǎn)基因大豆的草甘膦抗性高于所述目的大豆；
[0009] 所述外源DNA片段為含有5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因和N-乙酰轉(zhuǎn) 移酶基因的DNA分子。
[0010] 上述方法中，所述5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因為G2-aroA ;
[0011] 所述N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因為GAT ;
[0012] 所述外源DNA片段為序列表中序列10或序列1自5'末端第6189-10927位核苷 酸。上述方法中，所述外源DNA片段在所述轉(zhuǎn)基因大豆的上游側(cè)翼片段為所述目的大豆基 因組第17號染色體的自第7, 980, 527位核苷酸起向其上游方向延伸得到的長度為0至5Kb 的任意一個DNA片段；
[0013] 所述上游側(cè)翼片段具體為序列表中序列8所示的核苷酸；
[0014] 所述外源DNA片段在所述轉(zhuǎn)基因大豆的下游側(cè)翼片段為所述目的大豆基因組第 17號染色體的自第7, 980, 541位核苷酸起向其下游方向延伸得到的長度為0至5Kb的任意 一個DNA片段；
[0015] 所述下游側(cè)翼片段具體為序列表中序列9所示的核苷酸。所述上游側(cè)翼片段為所 述轉(zhuǎn)基因大豆基因組中緊鄰所述外源DNA片段5'末端的片段；
[0016] 所述下游側(cè)翼片段為所述轉(zhuǎn)基因大豆基因組中緊鄰所述外源DNA片段3'末端的 片段；
[0017] 上述方法中，所述外源DNA片段通過含有所述外源DNA片段的重組載體導(dǎo)入所述 目的大豆；
[0018] 所述重組載體的核苷酸序列具體為序列表中序列1。
[0019] 上述方法中，所述目的大豆為中黃10號。
[0020] 本發(fā)明另一個目的是提供用于檢測植物樣品是否來源于上述方法制備的轉(zhuǎn)基因 大豆或其后代的方法。
[0021] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：檢測所述植物樣品的基因組DNA中是否含有 DNA片段A，所述DNA片段A由權(quán)利要求3中的所述外源DNA片段在所述轉(zhuǎn)基因大豆的上游 側(cè)翼片段、權(quán)利要求3中的所述外源DNA片段和權(quán)利要求3中的所述外源DNA片段在所述 轉(zhuǎn)基因大豆的下游側(cè)翼片段組成；
[0022] 若含有所述DNA片段A，則所述植物樣品為或候選為所述轉(zhuǎn)基因大豆或其后代；
[0023] 若不含有所述DNA片段A，則所述植物樣品不為或候選不為所述轉(zhuǎn)基因大豆或其 后代。
[0024] 上述方法中，
[0025] 所述方法為如下1)或2)或3):
[0026] 1)直接測序植物樣品的基因組DNA，判斷所述測序植物樣品含有所述DNA片段A ;
[0027] 2)用引物對1或引物對2進行PCR擴增，若有目的擴增產(chǎn)物，則所述測序植物樣品 含有所述DNA片段A;
[0028] 所述引物對1為能夠擴增由所述外源DNA片段5'端和緊鄰其的所述上游側(cè)翼序列 部分或全部片段組成的DNA分子甲的引物對；其對應(yīng)的目的擴增產(chǎn)物為所述DNA分子甲；
[0029] 所述引物對2為能夠擴增含有所述外源DNA片段3'端和緊鄰其的所述下游側(cè)翼序 列的部分或全部組成的DNA分子乙的引物對；其對應(yīng)的目的擴增產(chǎn)物為所述DNA分子乙；
[0030] 3)用能特異結(jié)合所述DNA分子甲或其DNA分子乙的探針對所述待測植物樣品DNA 進行Southern雜交，若能雜交得到雜交片段，則所述植物樣品來源于所述轉(zhuǎn)基因大豆或其 后代。
[0031] 上述方法中，所述引物對1由序列表中序列10所示的單鏈DNA分子和序列表中序 列11所示的單鏈DNA分子組成；
[0032] 所述引物對1對應(yīng)的目的特異片段大小為810bp，其核苷酸序列具體為序列15 ;
[0033] 所述引物對2由序列表中序列12所示的單鏈DNA分子和序列表中序列13所示的 單鏈DNA分子組成；
[0034] 所述引物對2對應(yīng)的目的特異片段大小為1627bp，其核苷酸序列具體為序列16 ;
[0035] 3)中，所述探針的核苷酸序列為序列6。
[0036] 本發(fā)明第三個目的是提供用于檢測樣品是否來源于所述轉(zhuǎn)基因大豆或其后代的 試劑盒。
[0037] 本發(fā)明提供的試劑盒，包括1)所述外源DNA片段、2)所述引物對1、3)所述引物對 2或4)所述探針。
[0038] 上述試劑盒還可以記載上述方法的說明書。
[0039] 上述方法制備的轉(zhuǎn)基因大豆在育種中的應(yīng)用。
[0040] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明采用在大豆17號染色體的7980527至7980541位置間 插入外源DNA片段，得到含有外源DNA片段的轉(zhuǎn)基因大豆；外源DNA片段包括草甘膦抗性基 因G2-aroA和草甘膦降解基因N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因GAT基因；轉(zhuǎn)基因大豆草甘膦抗性高于未 轉(zhuǎn)基因的野生型大豆。該轉(zhuǎn)基因大豆對高劑量草甘膦有耐受性，其可進一步通過與優(yōu)良大 豆株系雜交來改良以優(yōu)化其他農(nóng)藝性狀如產(chǎn)量、品質(zhì)等。該轉(zhuǎn)外源DNA片段大豆共表達抗 草甘膦基因EPSPS(G2-ar 〇A)和草甘膦降解基因N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（GAT)，在苗期（子葉 出土且真葉未展開時期）單株對1-1. 5ul的草甘膦異丙胺鹽（Roundup)原液處理具有耐受 性，田間對每公頃約3至12升的草甘膦異丙胺鹽（Roundup)處理具有耐受性。獲得良好雜 草控制的總標準計量根據(jù)雜草壓力在每公頃3-6升之間變動。本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因大豆在這 些濃度處理時甚至更高濃度（12升/公頃）處理時，除草劑處理對植物活力和葉持綠等性 狀不產(chǎn)生任何可測的影響。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041] 圖1為轉(zhuǎn)基因大豆T0代耐1. 5L/公頃草甘膦噴施鑒定材料PCR分析
[0042] 圖2為轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6外源T-DNA的拷貝數(shù)分析
[0043] 圖3為轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6的T1植株的草甘膦抗性鑒定
[0044] 圖4為轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6純合抗性株系在12L/公頃草甘膦異丙胺鹽處理下抗性
[0045] 圖5為轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6純合株系的PCR分子檢測
[0046] 圖6為轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6外源T-DNA插入位點及整合方式示意圖
[0047] 圖7為轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6驗證引物所在位置示意圖
[0048] 圖8為所述轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6后代植株定性PCR擴增圖

【具體實施方式】
[0049] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0050] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0051] 大豆品種為中黃10號（ZhonghuanglO,其統(tǒng)編號：ZDD23873,記載在如下文獻中： 〈〈中國大豆品種志〉〉，邱麗娟、王曙明主編，中國農(nóng)業(yè)出版社，2007,公眾可從中國農(nóng)業(yè)科 學(xué)院作物科學(xué)研宄所獲得，取中黃10號的子葉節(jié)作為轉(zhuǎn)化材料；
[0052] 根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)菌株為AglO,記載在如下文獻中：程 偉.AtMGT4基因在水稻中異位表達的初步研宄（D).湖南師范大學(xué)，2012;公眾可從中國農(nóng) 業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研宄所獲得。
[0053] 大豆組織培養(yǎng)基以MS和B5培養(yǎng)基為主，121°C滅菌15-20min。
[0054] 萌發(fā)培養(yǎng)基：B5+20g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉，pH5. 8 ;
[0055]共培養(yǎng)基：1/10 B5+30g/L 蔗糖+3.9g/L 2-(N-嗎啡啉）乙磺酸（MES)+1.67mg/ L6_BA+39mg/L 乙酰丁香酮 +0? 25mg/L 赤霉素（GA3)+lmmol/L 二硫蘇糖醇 +lmmol/L 硫代硫 酸鈉+lmmol/L半胱氨酸+5g/L瓊脂粉，pH5. 4 ;
[0056]共培養(yǎng)液：1/10 B5+30g/L 蔗糖+3.9g/L 2-(N-嗎啡啉）乙磺酸（MES)+1.67mg/ L6_BA+39mg/L 乙酰丁香酮 +0. 25mg/L 赤霉素（GA3);
[0057] 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：B5+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉+0. 6g/L 2-(N-嗎啡啉）乙磺 酸（MES)+1. 67mg/L 6_BA+150mg/L 噻抱霉素 +400mg/L 幾節(jié)青霉素 +15mg/L glyphosate， pH5. 7 ；
[0058] 芽伸長培養(yǎng)基：MS+B5有機+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉+0?6g/L 2-(N-嗎啡啉） 乙磺酸（MES)+50mg/L天冬氨酸+50mg/L谷氨酰胺+0? 3mg/L卩引噪-3-乙酸（IAA)+0. 5mg/ L赤霉素（GA3) +150mg/L噻孢霉素+400mg/L羧節(jié)青霉素+0? lmg/L玉米素（Ze) +5mg/L glyphosate, pH5. 7 ；
[0059] 生根培養(yǎng)基：MS+B5有機+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉+0?6g/L 2- (N-嗎啡啉）乙磺 酸（MES) 50mg/L天冬氨酸+50mg/L谷氨酰胺，pH5. 7 ;
[0060] 農(nóng)桿菌培養(yǎng)用YEP和LB培養(yǎng)基。
[0061] 乙酰丁香酮、MS和B5干粉培養(yǎng)基和乙酰丁香酮為sigma公司產(chǎn)品，2-(N-嗎啡 啉）乙磺酸（MES)、噻孢霉素、羧芐青霉素、瓊脂粉、玉米素、天冬氨酸、谷氨酰胺、赤霉素素 (GA3)和6-芐氨基腺嘌呤（6-BA)為Biodee公司產(chǎn)品，蔗糖為國產(chǎn)試劑。
[0062] 以下實施例進一步描述了得到本發(fā)明和隨后的結(jié)果時所用的材料和方法，它們通 過舉例說明提供，并且它們的敘述不應(yīng)認為是要求權(quán)利和本發(fā)明的限制。
[0063] 實施例1、轉(zhuǎn)基因大豆的遺傳轉(zhuǎn)化
[0064] 1、重組載體的獲得
[0065] (1)根據(jù)A. thaliana-rbcS加G2-EPSPS基因優(yōu)化后合成序列，重新設(shè)計PCR引物， 上游帶有酶切位點是Xbal，下游帶有酶切位點SacI，PCR擴增rbcS-G2-EPSPS片段（序列 1自5'末端第8204-9784位核苷酸），連接到T-A載體上，獲得質(zhì)粒prbcS-G2-EPSPS，酶切 及測序驗證。
[0066] (2)pBI 121 (王華新，曹家樹，向珣等.pBI 121表達載體構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化植株的快速 鑒定.浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2008,34(2) :137-142;公眾可從中國農(nóng)業(yè)科 學(xué)院作物科學(xué)研宄所獲得）和pCAMBIA2300(鞏元勇，馮永坤，倪萬潮等.植物表達載體 pCAMBIA2300-35S-GUS-CaMVterm 的構(gòu)建及驗證.中國生物工程雜志，2013, 33(3) :86-91 ; 公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研宄所獲得）用Hind III /EcoR I雙酶切，將pBI121帶 有 p35S-GUS-Nos 的 3. Okb 片段連入 pCAMBIA2300,形成中間載體 p35S-2300-GUS ;
[0067] (3)p35S-2300-GUS 載體及 prbcS-G2-EPSPS 用 Xbal/Sac I 酶切后，9. 8kb 的P35S-2300-GUS載體骨架與1. 5kb rbcS-G2-EPSPS片段連接，得到中間載體 p35S-2300-rbcS-G2-EPSPS，該載體為將 prbcS-G2-EPSPS 中的 rbcS-G2-EPSPS 片段替換（2) 得到的P35S-2301-GUS相應(yīng)酶切位點中的⑶S片段形成的。將p35S-2300-rbcS-G2-EPSPS 用Xhol單酶切除掉植物篩選標記kan，收集10. 4kb中間載體載體骨架。（4)根據(jù)優(yōu)化后 GAT基因合成序列，基因上下游帶有單酶切位點Xhol，連接優(yōu)化后GAT基因和上述（3)得到 的中間載體載體骨架到重組載體pKT-rGE ;，其全序列為序列1。
[0068] 序列表中序列1中，自5'末端第9789-10360位核苷酸為導(dǎo)肽Rbcs和草甘膦抗 性基因Rbcs-EPSPS(G2-aroA)的啟動子增強型35S、5'末端第8255-9784位核苷酸為導(dǎo)肽 Rbcs和草甘膦抗性基因Rbcs-EPSPS(G2-aroA)、5'末端第7926-8196位核苷酸為草甘膦抗 性基因EPSPS (G2-aroA)終止子N0S、5'末端第6903-7673位核苷酸為草甘膦降解基因N-乙 酰轉(zhuǎn)移酶基因增強型35S、5'末端第6456-6896位核苷酸為草甘膦降解基因N-乙酰轉(zhuǎn)移酶 基因GAT、5'末端第6248-6455位核苷酸為草甘膦降解基因N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因終止子CaMV 35S polyA〇
[0069] 2、轉(zhuǎn)基因大豆的獲得
[0070] 1)、重組根瘤農(nóng)桿菌的獲得
[0071] 將上述1獲得的重組載體pKT-rGE導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌AglO中，得到重組農(nóng)桿菌 AglO/pKT-rGE。
[0072] 2)再生大豆植株的獲得
[0073] 重組農(nóng)桿菌AglO/pKT-rGE轉(zhuǎn)化離體培養(yǎng)的大豆（Glycine max)中黃10號的子葉 節(jié)外植體，農(nóng)桿菌與外植體共侵染后共培養(yǎng)3天，在含有草甘膦的篩選環(huán)境下經(jīng)器官再生 途徑誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株，叢生芽誘導(dǎo)階段，使用15mg/L濃度的草甘膦（Sigma公司）作為篩選 劑，誘導(dǎo)3-6周；伸長芽誘導(dǎo)階段，使用5mg/L濃度的草甘膦（sigma公司）作為篩選劑，誘 導(dǎo)4-8周；誘導(dǎo)和伸長階段，每2周更換一次培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)化細胞再生，為抑制根癌農(nóng)桿菌的 快速生長，在誘導(dǎo)和伸長培養(yǎng)基中分別添加150mg/L濃度的噻孢霉素和400mg/L濃度的羧 芐青霉素，待伸長芽伸長至4-6cm時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，獲得再生大豆植株。
[0074] 3)轉(zhuǎn)基因大豆的鑒定
[0075] (1)草甘膦篩選
[0076] 將再生植株移栽至土壤中溫室或培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，光照條件是16h光照和8h黑 暗，在第一至第三復(fù)葉期，用草甘膦異丙胺鹽（Roundup)噴施處理來自獨立轉(zhuǎn)化體，使用刻 度噴霧器，以每公頃1. 5L的草甘膦異丙胺鹽（Roundup)劑量施用除草劑水溶液。草甘膦施 用2周后，調(diào)查每個植株對草甘膦處理的反應(yīng)，其中5個轉(zhuǎn)化子對1. 5L/公頃的草甘膦異丙 胺鹽（Roundup)噴施處理表現(xiàn)出較強的耐受性（給予編號為ZH10-1，2, 3, 5,6)，其中編號 ZH10-6耐受性最高，較對照植株（中黃10號）生長旺盛，生長活力不受影響，葉片未發(fā)現(xiàn)變 黃褪綠的癥狀，編號為ZH10-1，2, 3, 5,6的再生植株為T0代轉(zhuǎn)基因大豆，T0代轉(zhuǎn)基因大豆 的草甘膦抗性高于野生型大豆中黃10號。
[0077] (2) PCR篩選
[0078] 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)用于鑒定EPSPS (G2-aroA)和GAT基因的存在，從編號 ZH10-1，2,3,5,6的T0代轉(zhuǎn)基因大豆植株上收集20-50mg新鮮幼嫩的葉子置于2mL離心管 中用于提取植物基因組DNA，DNA提取方法參照Murray and Thompson (1980)介紹的方法。 用Takara公司生產(chǎn)的EX-Taq PCR試劑盒，參照說明書進行PCR反應(yīng)，20 y 1 PCR反應(yīng)體系 含 10XEX-Taq buffer 2yl，2mM dNTPs 2 111，1〇1^的基因特異性上下游引物各0.5 4 1， EX-Taq 酶 0.2yl，補水至 20yl ;PCR 反應(yīng)程序為 94°C，4min(l 循環(huán)）；94°C，30s(變 性），60°C，30s (退火），72°C，45s (延伸）35 循環(huán)；72°C (終延伸）lOmin (1 循環(huán)）。
[0079]擴增 EPSPS (G2_aroA)的引物對：

【權(quán)利要求】
1. 一種培育轉(zhuǎn)基因大豆的方法，為將外源DNA片段插入目的大豆基因組第17號染色 體的第7, 980, 527-7, 980, 541位間，替換掉第17號染色體的第7, 980, 527-7, 980, 541位間 13bp的堿基序列，得到轉(zhuǎn)基因大豆； 所述轉(zhuǎn)基因大豆的草甘膦抗性高于所述目的大豆； 所述外源DNA片段為含有5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因和N-乙酰轉(zhuǎn)移酶 基因的DNA分子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于： 所述5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因為G2-aroA ; 所述N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因為GAT ; 所述外源DNA片段為序列表中序列10或序列1自5'末端第6189-10927位核苷酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述外源DNA片段在所述轉(zhuǎn)基因大 豆的上游側(cè)翼片段為所述目的大豆基因組第17號染色體的自第7, 980, 527位核苷酸起向 其上游方向延伸得到的長度為0至5Kb的任意一個DNA片段； 所述外源DNA片段在所述轉(zhuǎn)基因大豆的下游側(cè)翼片段為所述目的大豆基因組第17號 染色體的自第7, 980, 541位核苷酸起向其下游方向延伸得到的長度為0至5Kb的任意一個 DNA片段。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于： 所述上游側(cè)翼片段為序列表中序列8所示的核苷酸； 所述下游側(cè)翼片段為序列表中序列9所示的核苷酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述方法，其特征在于：； 所述外源DNA片段通過含有所述外源DNA片段的重組載體導(dǎo)入所述目的大豆； 所述重組載體的核苷酸序列具體為序列表中序列1 ; 所述目的大豆為中黃10號。
6. 用于檢測或輔助檢測植物樣品是否來源于權(quán)利要求1-5中任一所述方法制備的轉(zhuǎn) 基因大豆或其后代的方法，包括如下步驟：檢測所述植物樣品的基因組DNA中是否含有DNA 片段A，所述DNA片段A由權(quán)利要求3中的所述外源DNA片段在所述轉(zhuǎn)基因大豆的上游側(cè)翼 片段、權(quán)利要求3中的所述外源DNA片段和權(quán)利要求3中的所述外源DNA片段在所述轉(zhuǎn)基 因大豆的下游側(cè)翼片段組成； 若含有所述DNA片段A，則所述植物樣品為或候選為所述轉(zhuǎn)基因大豆或其后代； 若不含有所述DNA片段A，則所述植物樣品不為或候選不為所述轉(zhuǎn)基因大豆或其后代。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于： 所述方法為如下1)或2)或3): 1) 直接測序植物樣品的基因組DNA，判斷所述測序植物樣品含有所述DNA片段A ; 2) 用引物對1或引物對2進行PCR擴增，若有目的擴增產(chǎn)物，則所述測序植物樣品含有 所述DNA片段A ; 所述引物對1為能夠擴增由所述外源DNA片段5'端和緊鄰其的所述上游側(cè)翼序列部 分或全部片段組成的DNA分子甲的引物對；其對應(yīng)的目的擴增產(chǎn)物為所述DNA分子甲； 所述引物對2為能夠擴增含有所述外源DNA片段3'端和緊鄰其的所述下游側(cè)翼序列 的部分或全部組成的DNA分子乙的引物對；其對應(yīng)的目的擴增產(chǎn)物為所述DNA分子乙； 3)用能特異結(jié)合所述DNA分子甲或其DNA分子乙的探針對所述待測植物樣品DNA進行 Southern雜交，若能雜交得到雜交片段，則所述植物樣品來源于所述轉(zhuǎn)基因大豆或其后代。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于： 2) 中，所述引物對1由序列表中序列10所示的單鏈DNA分子和序列表中序列11所示 的單鏈DNA分子組成； 所述引物對2由序列表中序列12所示的單鏈DNA分子和序列表中序列13所示的單鏈 DNA分子組成； 3) 中，所述探針的核苷酸序列為序列6。
9. 用于檢測樣品是否來源于所述轉(zhuǎn)基因大豆或其后代的試劑盒，其包括：1)權(quán)利要求 6中所述外源DNA片段、2)權(quán)利要求6中所述引物對1、3)權(quán)利要求6中所述引物對2或4) 權(quán)利要求6中所述探針； 所述試劑盒還具體記載權(quán)利要求1-8中任一所述方法的說明書。
10. 權(quán)利要求1-8中任一所述方法制備的轉(zhuǎn)基因大豆在育種中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/82GK104450775SQ201410730395
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】邱麗娟, 郭兵福, 郭勇, 張麗娟, 金龍國, 洪慧龍, 化宿南 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所