一種大量樹突狀細(xì)胞的制備方法、所得樹突狀細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種大量樹突狀細(xì)胞的制備方法及所得樹突狀細(xì)胞。本發(fā)明提供的制備方法包括：獲得單個(gè)核細(xì)胞；取所得單個(gè)核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)，獲得樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞；培養(yǎng)，誘導(dǎo)所得樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞，檢測(cè)，收集樹突狀細(xì)胞。本發(fā)明提供的制備方法在獲得單個(gè)核細(xì)胞之后，通過貼壁培養(yǎng)即獲得樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞，再經(jīng)過培養(yǎng)、誘導(dǎo)，即制備獲得了樹突狀細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了將單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為樹突狀細(xì)胞，操作簡單，且單個(gè)核細(xì)胞來源充足，可用于樹突狀細(xì)胞的大量制備，使該制備方法更利于推廣和應(yīng)用。
【專利說明】一種大量樹突狀細(xì)胞的制備方法、所得樹突狀細(xì)胞

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫【技術(shù)領(lǐng)域】，特別一種樹突狀細(xì)胞的制備方法及所得樹突狀細(xì) 胞。

【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞免疫治療療法是采集人體自身免疫細(xì)胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)，使其數(shù)量成千倍增 多、靶向殺傷功能增強(qiáng)，然后再回輸?shù)饺梭w來殺滅血液及組織中的病原體、癌細(xì)胞、突變的 細(xì)胞，打破免疫耐受、激活和增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，兼顧治療和保健的雙重功效。細(xì)胞免疫 治療具有副作用小、靶向治療、作用范圍更加廣泛等特點(diǎn)，在臨床研宄中備受關(guān)注。據(jù)報(bào)道， 經(jīng)過多個(gè)療程的細(xì)胞免疫治療，能夠有效殺除患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)康復(fù)，改善患者的生 活質(zhì)量。樹突狀細(xì)胞療法是目前研宄最多的細(xì)胞免疫治療療法之一。
[0003] 樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DC)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞（Antigen presenting cell，APC)，一方面，其能夠刺激初始的T細(xì)胞增殖，啟動(dòng)免疫應(yīng)答；另一方面， 樹突狀細(xì)胞還能夠呈遞抗原給MHC-I類限制性⑶8+和MHC-II類限制性⑶4 +T淋巴細(xì)胞，誘 導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，被稱為"天然免疫佐劑"，因此，樹突狀細(xì)胞在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中具有獨(dú)特 的地位。近年來，以DC細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療在臨床應(yīng)用中得到越來越廣泛的關(guān)注，是國 內(nèi)外研宄的熱點(diǎn)。
[0004] 隨著研宄的深入，發(fā)現(xiàn)充足的DC細(xì)胞成為了 DC細(xì)胞免疫治療研宄中的技術(shù)瓶頸。 現(xiàn)有的DC細(xì)胞制備方法中，大多采用抽取外周血培養(yǎng)，分離出造血干細(xì)胞，之后在多種細(xì) 胞因子存在下培養(yǎng)、誘導(dǎo)所得造血干細(xì)胞，制備獲得DC細(xì)胞。整個(gè)過程操作復(fù)雜，并且因?yàn)?細(xì)胞來源少、所得造血干細(xì)胞的數(shù)量也少，最終影響了 DC細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量，導(dǎo)致治療效果 不理想。所以，十分有必要需找新的DC細(xì)胞的制備方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種大量樹突狀細(xì)胞的制備方法及所得樹 突狀細(xì)胞。本發(fā)明提供的制備方法在獲得單個(gè)核細(xì)胞之后，經(jīng)過培養(yǎng)、誘導(dǎo)，即制備獲得了 樹突狀細(xì)胞，操作簡單，且單個(gè)核細(xì)胞來源充足，可用于樹突狀細(xì)胞的大量制備，使該制備 方法更利于推廣和應(yīng)用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種樹突狀細(xì)胞的制備方法，其包括以下步驟：
[0008] 步驟1 :獲得單個(gè)核細(xì)胞；
[0009] 步驟2 :取所得單個(gè)核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)，獲得樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞；
[0010] 步驟3 :培養(yǎng)、誘導(dǎo)所得樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞，檢測(cè)，收集樹突狀細(xì)胞。
[0011] 在本發(fā)明中，單個(gè)核細(xì)胞可由外周血分離獲得，也可由骨髓分離獲得。其中，外周 血單個(gè)核細(xì)胞即外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。體外檢測(cè)淋巴細(xì) 胞首先要分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，目前主要的分離方法是Ficoll-hypaque (葡聚糖一泛影 葡胺）密度梯度離心法，因?yàn)檠褐懈饔行纬煞值谋戎卮嬖诓町?，因此得以分離。紅細(xì)胞和 粒細(xì)胞密度大于分層液，同時(shí)因紅細(xì)胞遇到Ficoll而凝集成串錢狀而沉積于管底。血小 板則因密度小而懸浮于血漿中，唯有與分層液密度相當(dāng)?shù)膯蝹€(gè)核細(xì)胞密集在血漿層和分層 液的界面中，呈白膜狀，吸取該層細(xì)胞遞經(jīng)洗滌高心重懸。本法分離單個(gè)核細(xì)胞純度可達(dá) 95 %，其中，淋巴細(xì)胞約占90 %?95 %，細(xì)胞獲得率可達(dá)80 %以上，細(xì)胞獲得率的高低與室 溫有關(guān)，超過25 °C時(shí)會(huì)影響細(xì)胞獲得率。
[0012] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，步驟3中的誘導(dǎo)所用誘導(dǎo)試劑包括第一誘導(dǎo) 試劑和第二誘導(dǎo)試劑；
[0013] 該第一誘導(dǎo)試劑包括GM-CSF、IL-4、人血白蛋白和谷氨酰胺；
[0014] 該第二誘導(dǎo)試劑包括TNF- α。
[0015] GM-CSF為粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，是一種細(xì)胞因子。優(yōu)選地，本發(fā)明提 供的制備方法中，第一誘導(dǎo)試劑中GM-CSF的濃度為lOOng/mL?200ng/mL。在本發(fā)明的 一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導(dǎo)試劑中的GM-CSF的濃度為100ng/mL。 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導(dǎo)試劑中的GM-CSF為 rhGM-CSF〇
[0016] IL-4為白細(xì)胞介素4,是一種細(xì)胞因子。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，第一 誘導(dǎo)試劑中IL-4的濃度為30ng/mL?50ng/mL。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的 制備方法中，第一誘導(dǎo)試劑中的IL-4的濃度為30ng/mL。在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本 發(fā)明提供的制備方法中，IL-4為rhIL-4。
[0017] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，以g/mL計(jì)，第一誘導(dǎo)試劑中人血白蛋白的濃 度為2%?4%。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，以g/mL計(jì)，第一誘 導(dǎo)試劑中的人血白蛋白的濃度為2 %。
[0018] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導(dǎo)試劑中，谷氨酰胺的濃度為2mmol/ L?4mmol/L。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導(dǎo)試劑中，谷氨 酰胺的濃度為2mmol/L。
[0019] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，第二誘導(dǎo)試劑中，TNF-α的濃度為500UI/ mL ?1500UI/mL。
[0020] TNF-a是一種腫瘤壞死因子。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的制備方法 中，第二誘導(dǎo)試劑中，TNF-a的濃度為l〇〇〇n/mL。
[0021] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，步驟3中培養(yǎng)、誘導(dǎo)包括：
[0022] 向樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞中加入含第一誘導(dǎo)試劑的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)；在補(bǔ)加兩次 所述完全培養(yǎng)液之后，再補(bǔ)加所述完全培養(yǎng)液與第二誘導(dǎo)試劑的混合溶液；之后，進(jìn)行檢 測(cè)，收集樹突狀細(xì)胞，即得。
[0023] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，步驟3中所述培養(yǎng)、誘導(dǎo)具 體為：
[0024] 向樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞中加入含該第一誘導(dǎo)試劑的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)；
[0025] 在培養(yǎng)的第二天、第四天分別補(bǔ)加該完全培養(yǎng)液；
[0026] 在培養(yǎng)的第六天，補(bǔ)加該完全培養(yǎng)液與第二誘導(dǎo)試劑的混合溶液；
[0027] 在培養(yǎng)的第七天，進(jìn)行檢測(cè)，收集樹突狀細(xì)胞，即得。
[0028] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的制備方法具體包括：
[0029] 取外周血，分離制備獲得單個(gè)核細(xì)胞；
[0030] 去除紅細(xì)胞、血小板后，進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；向貼壁細(xì)胞中加入含有rhGM-CSF、 rhIL-4、人血白蛋白和谷氨酰胺的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；在培養(yǎng)過程中，分別在第二天、第 四天補(bǔ)加該完全培養(yǎng)液；第六天，補(bǔ)加該完全培養(yǎng)液與第二誘導(dǎo)試劑的混合溶液；第七天， 進(jìn)行檢測(cè)，收集樹突狀細(xì)胞，即得。
[0031] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述收集樹突狀細(xì)胞為：將誘導(dǎo)并促熟后的DC細(xì)胞進(jìn) 行離心清洗后吸去上清，加入ImL細(xì)胞凍存液，混勻后凍存于2mL的凍存管中，置于凍存盒 中，放入-80°C冰箱保存；所述細(xì)胞凍存液包括20%人血白蛋白、無血清培養(yǎng)基和DMSO,所 述20 %人血白蛋白、無血清培養(yǎng)基和DMSO的體積比為5:4:1。
[0032] 本發(fā)明提供的制備方法獲得單個(gè)核細(xì)胞之后，通過貼壁培養(yǎng)的方式，獲得富含樹 突狀細(xì)胞前體細(xì)胞的貼壁細(xì)胞，之后再進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入誘導(dǎo)劑，經(jīng)過培養(yǎng)、誘導(dǎo)， 刺激樹突狀細(xì)胞成熟，獲得樹突狀細(xì)胞。整個(gè)制備過程操作簡單，且單個(gè)核細(xì)胞來源充足， 可用于樹突狀細(xì)胞的大量制備，使該制備方法更利于推廣和應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明提 供的制備方法制備獲得的樹突狀細(xì)胞數(shù)量多，能夠有用于制備含樹突狀細(xì)胞的藥物制劑。 本發(fā)明提供的制備方法制備獲得的樹突狀細(xì)胞可直接加入生理鹽水、人血白蛋白配置成細(xì) 胞回輸液，用于靜脈回輸；也可將所得樹突狀細(xì)胞進(jìn)行凍存，在使用的使用再進(jìn)行復(fù)蘇，配 置細(xì)胞回輸液，用于靜脈回輸。
[0033] 本發(fā)明提供了一種大量樹突狀細(xì)胞的制備方法及所得樹突狀細(xì)胞。本發(fā)明提供的 樹突狀細(xì)胞的制備方法包括：獲得單個(gè)核細(xì)胞；取所得單個(gè)核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)，獲得樹突狀 細(xì)胞前體細(xì)胞；培養(yǎng)，誘導(dǎo)所得樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞，檢測(cè)，收集樹突狀細(xì)胞。本發(fā)明提供的 制備方法在獲得單個(gè)核細(xì)胞之后，通過貼壁培養(yǎng)即獲得樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞，再經(jīng)過培養(yǎng)、 誘導(dǎo)，即制備獲得了樹突狀細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了將單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為樹突狀細(xì)胞，操作簡單， 且單個(gè)核細(xì)胞來源充足，可用于樹突狀細(xì)胞的大量制備，使該制備方法更利于推廣和應(yīng)用， 所得樹突狀細(xì)胞可用于制備藥物制劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明提供的制備方法成功制備獲 得了樹突狀細(xì)胞，所得樹突狀細(xì)胞數(shù)量大，成熟度高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1示實(shí)施例2中所得細(xì)胞的流式分析結(jié)果圖片，其中Rl代表細(xì)胞范圍；
[0035] 圖2示實(shí)施例2中所得細(xì)胞的CD83的流式細(xì)胞分析結(jié)果，其中N代表表達(dá)率；
[0036] 圖3示實(shí)施例2中所得細(xì)胞的CD86的流式細(xì)胞分析結(jié)果；
[0037] 圖4示實(shí)施例2中所得細(xì)胞的HLA-DR的流式細(xì)胞分析結(jié)果；
[0038] 圖5示實(shí)施例2中所得細(xì)胞的HLA-DR+CD83+的流式細(xì)胞分析結(jié)果；
[0039] 圖6示實(shí)施例2中所得細(xì)胞的HLA-DR+CD86+的流式細(xì)胞分析結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0040] 本發(fā)明公開了一種大量樹突狀細(xì)胞的制備方法及所得樹突狀細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以參考本文內(nèi)容，獲得該樹突狀細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)其應(yīng)用，特別需要指出的是，所有類似的替 換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的 方法已經(jīng)通過較佳的實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范 圍內(nèi)對(duì)本文制備方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0041] 本發(fā)明提供的一種大量樹突狀細(xì)胞的制備方法及所得樹突狀細(xì)胞中的試劑和原 料均可由市場(chǎng)購得。
[0042] 為了使本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合實(shí)施 例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0043] 實(shí)施例1樹突狀細(xì)胞的制備
[0044] 實(shí)驗(yàn)材料：
[0045] 血液來源于腫瘤患者，肺癌，男性，67歲；
[0046] 淋巴細(xì)胞分離液來源于天津?yàn)笊铮?br> [0047] LONZA x_vivol5無血清培養(yǎng)基來源于Ionza ;
[0048] rhGM-CSF 來源于 peprotech ;
[0049] rhIL-4來源于廈門特寶；
[0050] 20 %人血白蛋白（以g/mL計(jì)）來源于華蘭生物；
[0051] 熒光標(biāo)記的抗HLA-DR抗體來源于BD ;
[0052] 熒光標(biāo)記的抗⑶83抗體來源于BD ;
[0053] 熒光標(biāo)記的抗⑶86抗體來源于BD ;
[0054] 含rhGM-CSF、rhIL-4、Gln和人血白蛋白的LONZA x-vivol5完全培養(yǎng)基的配置方 法：將上述因子按濃度加入LONZA X-viv〇15培養(yǎng)基中，配置成至200mL DC完全培養(yǎng)液。
[0055] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0056] (1)血細(xì)胞分離機(jī)富集大量單個(gè)核細(xì)胞
[0057] 取血液，使用Fresenius COM. TEC血細(xì)胞分離機(jī)，循環(huán)12個(gè)循環(huán)，獲得約80mL富 含單個(gè)核細(xì)胞的血樣懸液。
[0058] (2)單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過純化并誘導(dǎo)為樹突狀細(xì)胞
[0059] 用3管（15mL/管）淋巴細(xì)胞分離液分離所得血樣懸液，排除紅細(xì)胞，血小板等成 分，獲得更加純凈的單個(gè)核細(xì)胞，具體操作為：密度梯度離心，轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心 20分鐘，收集白膜狀層細(xì)胞。
[0060] 取所得單個(gè)核細(xì)胞，加入到6個(gè)T752cm培養(yǎng)瓶（分別標(biāo)記為1-6號(hào)培養(yǎng)瓶）中， 每瓶加入15mL LONZA x-vivol5無血清培養(yǎng)基，放置在37°C、5% CO2孵箱中，孵育0. 5h ;孵 育完畢后取出，倒掉懸浮細(xì)胞，并用LONZA X-viv〇15無血清培養(yǎng)基清洗貼壁細(xì)胞一次，使其 更加純凈，得樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞。
[0061] 分別保留貼壁細(xì)胞，共六份。向每份貼壁細(xì)胞中各加入含rhGM-CSF(終濃度為 100ng/mL)、rhIL-4 (終濃度為30ng/mL)、Gln (終濃度為2mmol/L)、20 %人血白蛋白濃度 為2% (gp，以g/mL計(jì)，人血白蛋白的終濃度為0.4%)的LONZA X-viv〇15完全培養(yǎng)基 15mL，所得培養(yǎng)體系中，貼壁細(xì)胞的濃度約為2xl0 6個(gè)/mL ;開始培養(yǎng)，第2、4天各瓶中補(bǔ)加 上述含 rhGM-CSF (終濃度為 100ng/mL)、rhIL-4(終濃度為 30ng/mL)rhIL-4、Gln (終濃度 為2mmol/L)、20%人血白蛋白濃度為2% (即，以g/mL計(jì)，人血白蛋白的終濃度為2%)的 完全培養(yǎng)基5mL繼續(xù)培養(yǎng)；第6天，各瓶中加入含終濃度ΙΟΟΟΠ/mL TNF- α因子的5mL上 述含 rhGM-CSF (終濃度為 100ng/mL)、rhIL-4(終濃度為 30ng/mL)rhIL-4、Gln (終濃度為 2mmol/L)、20%人血白蛋白濃度為2% (即，以g/mL計(jì)，人血白蛋白的終濃度為0.4%)的 完全培養(yǎng)基，孵育過夜；第7天，進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)后收獲DC細(xì)胞并保存。
[0062] 常規(guī)檢測(cè)方法為免疫表型檢測(cè)，具體為：取促成熟后DC細(xì)胞（即培養(yǎng)第7天，將細(xì) 胞混勻后取樣），用PBS洗2次后，各取I X IO5AiU lmL，分別加入相應(yīng)的FCM管中。加入待 檢測(cè)單克隆抗體：抗HLA-DR抗體、抗⑶83抗體和抗⑶86抗體各5 μ L，4°C避光孵育30分 鐘，每10分鐘搖晃1次，使細(xì)胞與抗體充分接觸。用PBS洗2次，并重懸在400 μ L的PBS 中，采用流式細(xì)胞儀FASCSCalibur (BD Biosciences)檢測(cè)。
[0063] 1號(hào)培養(yǎng)瓶中的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)所得細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果見表1、圖1-圖6。
[0064] 表11號(hào)培養(yǎng)瓶的檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)
[0065]

【權(quán)利要求】
1. 一種樹突狀細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1:獲得單個(gè)核細(xì)胞； 步驟2 :取所述單個(gè)核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)，獲得樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞； 步驟3 :培養(yǎng)、誘導(dǎo)所述樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞，檢測(cè)，收集樹突狀細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3中的所述誘導(dǎo)所用誘導(dǎo)試劑包 括第一誘導(dǎo)試劑和第二誘導(dǎo)試劑； 所述第一誘導(dǎo)試劑包括GM-CSF、IL-4、人血白蛋白和谷氨酰胺； 所述第二誘導(dǎo)試劑包括TNF- a。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述第一誘導(dǎo)試劑中，所述GM-CSF的 濃度為 l〇〇ng/mL ?200ng/mL。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，所述第一誘導(dǎo)試劑中，所述IL-4 的濃度為30ng/mL?50ng/mL。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，以g/mL計(jì)，所述第一誘 導(dǎo)試劑中，所述人血白蛋白的濃度為2 %?4 %。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述第一誘導(dǎo)試劑中， 所述谷氨酰胺的濃度為2mmol/L?4mmol/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述第二誘導(dǎo)試劑中， 所述 TNF- a 的濃度為 500UI/mL ?150〇n/mL。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟3中所述培養(yǎng)、誘導(dǎo)包括： 向所述樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞中加入含所述第一誘導(dǎo)試劑的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)；補(bǔ)加兩 次所述完全培養(yǎng)液，再補(bǔ)加所述完全培養(yǎng)液與所述第二誘導(dǎo)試劑的混合溶液；檢測(cè)，收集樹 突狀細(xì)胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述收集樹突狀細(xì)胞為： 將誘導(dǎo)并促熟后的樹突狀細(xì)胞進(jìn)行離心清洗后吸去上清，加入lmL細(xì)胞凍存液，混勻 后凍存于2mL的凍存管中，置于凍存盒中，放入-80°C冰箱保存；所述細(xì)胞凍存液包括20% 人血白蛋白、無血清培養(yǎng)基和DMS0,所述20 %人血白蛋白、無血清培養(yǎng)基和DMS0的體積比 為 5:4:1。
10. 如權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)所述的制備方法制備獲得的樹突狀細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/0784GK104498434SQ201410730272
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】徐獻(xiàn)毅, 史軍, 呂垚 申請(qǐng)人:北京益諾勤生物技術(shù)有限公司