一株具有內(nèi)毒素吸附特性的耶氏酵母及其吸附特性研究方法
【專利摘要】一株具有內(nèi)毒素吸附特性的耶氏酵母及其吸附特性研究方法，屬于酵母菌屬的內(nèi)毒素吸附潛能探究【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明公開了一株具有強(qiáng)內(nèi)毒素吸附特性的食品來源菌株，耶氏酵母菌( Yarrowia lipolytica ) SCPW20，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2014528。其鑒定結(jié)果為耶氏酵母菌屬，且與解脂耶氏酵母標(biāo)準(zhǔn)菌株 Yarrowia lipolytica CLIB122的表型相似，拓展了酵母菌屬在內(nèi)毒素去除或治療領(lǐng)域中的應(yīng)用潛能。而且，相較于益生菌而言，作為簡單真核生物的酵母菌，具有接近高等真核生物研究的優(yōu)勢，該內(nèi)毒素吸附菌株在吸附特性研究方面具有更廣泛的研究價(jià)值，拓展了內(nèi)毒素吸附菌劑的開發(fā)應(yīng)用，更有益于促進(jìn)內(nèi)毒素引發(fā)的相關(guān)疾病研究。
CCTCC NO:M 2014528
20141029
【專利說明】—株具有內(nèi)毒素吸附特性的耶氏酵母及其吸附特性研究方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株具有內(nèi)毒素吸附特性的耶氏酵母及其吸附特性研究方法，其中一株具有強(qiáng)內(nèi)毒素吸附特性的耶氏酵母菌，是一種具有內(nèi)毒素去除應(yīng)用潛能的食品來源菌，而且該吸附特性具有一定的研究價(jià)值。屬于酵母菌屬的內(nèi)毒素吸附潛能探究【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]內(nèi)毒素(即1？幻是存在于大多數(shù)革蘭氏陰性菌外膜的主要組成部分，可通過激活宿主細(xì)胞內(nèi)II財(cái)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等，促進(jìn)炎性細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，進(jìn)而引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，造成疾病或者死亡。鑒于攜帶內(nèi)毒素的細(xì)菌可能從工廠生產(chǎn)線上分離出來，醫(yī)學(xué)臨床樣本中也普遍存在，如腦脊液，骨髓，血液等，因而是否能有效地清除內(nèi)毒素或破壞其活性成分，已成為內(nèi)毒素污染治理或治療內(nèi)毒素血癥的重要所在，主要涉及內(nèi)毒素吸附研究等。
[0003]內(nèi)毒素吸附研究主要包括內(nèi)毒素吸附介質(zhì)或材料的臨床應(yīng)用探究，以及內(nèi)毒素吸附菌劑的開發(fā)應(yīng)用等。目前已有研究發(fā)現(xiàn)具有內(nèi)毒素吸附特性的益生菌，如乳酸菌、雙歧桿菌等，而且雙歧桿菌屬制劑已應(yīng)用于內(nèi)毒素相關(guān)疾病的臨床治療中。一般采用流式細(xì)胞術(shù)篩選內(nèi)毒素吸附菌，其具有簡單快速的特點(diǎn)，但是其高靈敏度的特點(diǎn)可能會(huì)造成假陽性結(jié)果，往往需要對(duì)內(nèi)毒素含量進(jìn)行定量分析以進(jìn)一步確定。此外，也還少有內(nèi)毒素吸附菌這一特性的直觀觀察與探索研究，以及其它類別的內(nèi)毒素吸附菌屬研究報(bào)道，而這些可能對(duì)內(nèi)毒素吸附菌劑的開發(fā)應(yīng)用更具指導(dǎo)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一種能夠高效吸附內(nèi)毒素的耶氏酵母菌，以及該菌株的內(nèi)毒素吸附特性具有哪些特點(diǎn)以及應(yīng)用潛能。
[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是尋找一種更直觀地觀察耶氏酵母菌的內(nèi)毒素吸附特性的方法，以此探究該特性的應(yīng)用潛能。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明借鑒免疫細(xì)胞體系下的內(nèi)毒素?zé)晒馐聚櫡?，建立酵母菌與熒光素標(biāo)記內(nèi)毒素的孵育反應(yīng)體系，在內(nèi)毒素含量變化分析的基礎(chǔ)上，觀察耶氏酵母菌的內(nèi)毒素吸附現(xiàn)象，并進(jìn)行內(nèi)毒素濃度、菌株活性、外力作用等方面影響的探究。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:一株具有內(nèi)毒素吸附特性的酵母菌，其分類命名為耶氏酵母菌、丫虹1~0評(píng)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為IX丁IX^0:1 2014528。
[0008]所述的耶氏酵母菌^0:1 2014528的內(nèi)毒素吸附特性的初步鑒定方法，以內(nèi)毒素特有的0)0基團(tuán)的含量作為內(nèi)毒素含量的表征，根據(jù)內(nèi)毒素與耶氏酵母菌孵育體系中的內(nèi)毒素含量降低比例計(jì)算耶氏酵母菌的內(nèi)毒素吸附率，并以釀酒酵母菌作為低內(nèi)毒素吸附菌株對(duì)照。
[0009]所述的耶氏酵母菌^0:1 2014528的內(nèi)毒素吸附現(xiàn)象的直觀觀察方法，利用熒光素標(biāo)記內(nèi)毒素與耶氏酵母菌^0:1 2014528進(jìn)行孵育反應(yīng)，301孵育30 -11后，用指甲油封片孵育反應(yīng)液，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到熒光信號(hào)明顯聚集于耶氏酵母菌細(xì)胞周圍的現(xiàn)象，而作為陰性對(duì)照的釀酒酵母菌實(shí)驗(yàn)組則無此現(xiàn)象。
[0010]所述的耶氏酵母菌的內(nèi)毒素吸附現(xiàn)象具有一定的專一性，即一株標(biāo)準(zhǔn)菌株11^01x^103 01.18122 (21180 ??！， 6七 3,1.01011111^, 6X^1-6881011 811(1
01181'&01:61-1281:1011 0？ 8 116界 11^)886 ？^0111 丫31~1~0評(píng) 13.0101:601111010^7
16^^61-8, 2011，33(12): 2445-2452.)表現(xiàn)出相似的特性，而且該吸附特性與酵母細(xì)胞的活性有一定聯(lián)系，此外離心作用對(duì)該吸附特性的影響不大。
[0011]所述的研究表明，耶氏酵母菌的內(nèi)毒素吸附特性極可能與其表面的某種特殊物質(zhì)有關(guān)，而且菌株活性降低或死亡不會(huì)影響體外體系中內(nèi)毒素的去除效果，因此探究酵母菌的這種內(nèi)毒素吸附或降解作用，將更具研究價(jià)值，而開發(fā)酵母菌劑在內(nèi)毒素血癥治療方面的應(yīng)用也更具現(xiàn)實(shí)意義。
[0012]內(nèi)毒素吸附特性分析方法:
1(00 (2-酮基-3-脫氧辛酸)定量檢測:1(00基團(tuán)作為內(nèi)毒素的特殊結(jié)構(gòu)之一，其含量可以表征內(nèi)毒素的含量。分別取10 111孵育初始和結(jié)束后的反應(yīng)液上清，加入1此0.2
I??！2304，100。〇水浴30 111111 ；待冷卻至室溫后，12000印111離心5砧打；轉(zhuǎn)移0.5 111[上相至新的離心管中，加入0.25 1111 0.04 I ?。?04 (溶于0.125 I $3()4),混合并室溫放置20 111111 ；繼續(xù)加入0.25 2.6%似八802 0^^0.5 I此1，界八)，震蕩并室溫放置至棕紅色消失；繼續(xù)加入 0.5 1111 0.6% 硫代巴比妥酸111111 ；趁熱繼續(xù)加入1 III[二甲基亞砜(0130),冷卻至室溫后，548 11111下測定終溶液的吸光值(以同樣處理?xiàng)l件下，不含1(00的？83為空白對(duì)照組，進(jìn)行調(diào)零由于吸光值的大小與1(00含量成正比，因而吸光值的相對(duì)大小可以表征內(nèi)毒素含量的相對(duì)高低。根據(jù)同一批實(shí)驗(yàn)下，孵育初始與結(jié)束后的反應(yīng)液上清所測得的吸光值變化，可以計(jì)算出與內(nèi)毒素孵育反應(yīng)后酵母菌的內(nèi)毒素降低水平。
[0013]示蹤觀察:收集新鮮的對(duì)數(shù)前期耶氏酵母細(xì)胞培養(yǎng)液(00, =1.0-2.0),？88 (邱7.4)清洗菌泥2~3次后，制成？83菌懸液待用；混合？呢/111匕溶于？83)與耶氏酵母菌懸液，制成耶氏酵母菌濃一定(00^=3.0-4.0),濃度不定(20-500 0 8/00的系列反應(yīng)液，30-(:孵育反應(yīng)20~30 111111后，取8 ^[反應(yīng)液制片，并用指甲油封片；在激光共聚焦顯微鏡下，采用480 11111檢測波長觀察熒光信號(hào)的分布情況。
[0014]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供的內(nèi)毒素吸附菌株在吸附特性研究方面具有更廣泛的研究價(jià)值，拓展了內(nèi)毒素吸附菌劑的開發(fā)應(yīng)用，在治療內(nèi)毒素血癥方面更具有指導(dǎo)意義。
[0015]生物材料樣品保藏:本發(fā)明涉及的一株具有內(nèi)毒素吸附特性的酵母菌，其分類命名為耶氏酵母菌11^01^103) 3(^120，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為^0:1 2014528，保藏日期2014年10月29日。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1菌株％？120、0118122和階4742的內(nèi)毒素吸附特性分析。采用1(00定量法檢測不同菌株與內(nèi)毒素孵育反應(yīng)體系中的內(nèi)毒素含量降低比例。
[0017]圖2菌株％？120和118122的細(xì)胞存活率變化。

【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1內(nèi)毒素吸附菌株的篩選
挑選從發(fā)酵食品中分離出的系列單菌落培養(yǎng)物，液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)前期，用？83清洗菌泥2~3次后，制成006。。?4.0的？83菌懸液待用。選用31卿3公司￡.⑶11 0111:84來源制成濃度為21？8的？83母液待用。取母液與菌懸液混合，制成初始濃度為1匕細(xì)胞濃度為⑶，?2.0的反應(yīng)體系，301孵育反應(yīng)30 -11后，離心取上清進(jìn)行1(00定量檢測。其中，以僅含菌體反應(yīng)液上清作為空白對(duì)照，計(jì)算分析菌株的內(nèi)毒素降低水平。成功篩選出一株內(nèi)毒素降低水平高達(dá)65%的菌株(圖1),并通過初步的菌落形態(tài)與顯微鏡觀察鑒定為耶氏酵母菌％？120。
[0019]實(shí)施例2內(nèi)毒素吸附特性菌株的183也嫩鑒定
以待鑒定菌株的基因組為模版，使用常規(guī)酵母183也嫩鑒定引物進(jìn)行183也嫩序列的擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收擴(kuò)增產(chǎn)物后，由上海生工生物工程公司完成測序工作，其核苷酸序列如3即10勵(lì).1。將測序結(jié)果導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行81%丨序列比對(duì)分析，得出序列覆蓋率最高的酵母菌為解脂耶氏酵母，鑒定為耶氏酵母種屬，并命名為131-1-0^13 111)01^103 80？120，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0020]實(shí)施例3菌株％？120的內(nèi)毒素吸附特性分析 1、印0定量分析不同酵母菌株的內(nèi)毒素降低水平差異
另選取一株解脂耶氏酵母標(biāo)準(zhǔn)菌株111)01^1:103 1X18122，以實(shí)驗(yàn)室常用酵母標(biāo)準(zhǔn)菌株$￡10011^0111/068 061~6^18136 814742作為對(duì)照，通過1(00定量分析比較三株菌的內(nèi)毒素降低水平，可以看出兩株耶氏酵母菌均表現(xiàn)出較高的內(nèi)毒素降低水平，釀酒酵母菌的內(nèi)毒素降低水平則不明顯(結(jié)果如圖0。
[0021〕 2、熒光示蹤法觀察不同酵母菌株的內(nèi)毒素吸附現(xiàn)象
同樣選用318胍公司厶⑶11 0111:84來源制成約1呢/此的？83母液，并進(jìn)行適當(dāng)稀釋備用。向待考察的新鮮菌懸液中加入一定量？1101^3母液，制成初始濃度為100 11 ^/^1,細(xì)胞濃度約為00,=4.0的反應(yīng)體系，孵育反應(yīng)后制片觀察熒光信號(hào)分布情況?？梢钥吹絻芍暌辖湍讣?xì)胞膜壁上均表現(xiàn)出明顯的熒光信號(hào)聚集現(xiàn)象，形成特殊的熒光包被細(xì)胞膜壁的結(jié)構(gòu)；而釀酒酵母孵育體系中的熒光信號(hào)則分散于細(xì)胞周圍的液體環(huán)境中，沒有形成熒光包圍結(jié)構(gòu)。推測耶氏酵母細(xì)胞表面可能具有特異性吸附的結(jié)構(gòu)組成，且這種特異性吸附增強(qiáng)了耶氏酵母降低內(nèi)毒素含量的能力。
[0022]3、菌株％？胃20的內(nèi)毒素吸附特性分析
選取含不同濃度？1101^3 (50 11 ^/1111,100 4姐、500 ^ 8/1)的反應(yīng)體系，觀察菌株％？120吸附內(nèi)毒素的現(xiàn)象是否具有飽和特征?？梢钥闯鲭S著？1101^3添加濃度的增加，熒光包被結(jié)構(gòu)的信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；且在達(dá)到一定濃度后，細(xì)胞周圍的液體環(huán)境中才表現(xiàn)出明顯的熒光信號(hào)，因而推測菌株％？120細(xì)胞表面的熒光信號(hào)聚集行為是隨著濃度的增加而趨近于飽和的。
[0023]此外，當(dāng)菌株細(xì)胞活性喪失或死亡時(shí)，孵育反應(yīng)過程中菌株可作為接納的“載體”，細(xì)胞整體都呈現(xiàn)出熒光狀態(tài)；而且離心處理的正常菌株細(xì)胞孵育反應(yīng)液中，仍可觀察到明顯的熒光包被細(xì)胞膜壁的結(jié)構(gòu)，說明耶氏酵母細(xì)胞的這種內(nèi)毒素吸附特性具有一定的生物活性以及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
[0024]實(shí)施例4菌株％？120和118122的細(xì)胞存活率分析
離心分離菌株與內(nèi)毒素的孵育反應(yīng)液初始濃度為1呢/此),盡量去除反應(yīng)液上清中的⑶義并避免菌體損失；重新制成？83菌懸液后，進(jìn)行10倍梯度稀釋，并從不同梯度稀釋樣液中，取10 9 [涂布或點(diǎn)樣于奸0固體平板培養(yǎng)基上，并保證每組數(shù)據(jù)至少設(shè)置三個(gè)平行樣；301培養(yǎng)2~3天，記錄比較與1？3的孵育反應(yīng)對(duì)菌株的細(xì)胞存活率影響，可以看出菌株％？120和118122的細(xì)胞存活率變化均不明顯(結(jié)果如圖2\
[0025]雖然本發(fā)明以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一株具有內(nèi)毒素吸附特性的酵母菌，其分類命名為耶氏酵母菌(Yarrowialipolytica) SCPW20，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO: Μ2014528。
2.權(quán)利要求1所述的耶氏酵母菌CCTCCΝ0:Μ 2014528的內(nèi)毒素吸附特性的初步鑒定方法，其特征在于以內(nèi)毒素特有的KD0基團(tuán)的含量作為內(nèi)毒素含量的表征，根據(jù)內(nèi)毒素與耶氏酵母菌孵育體系中的內(nèi)毒素含量降低比例計(jì)算耶氏酵母菌的內(nèi)毒素吸附率，并以釀酒酵母菌作為低內(nèi)毒素吸附菌株對(duì)照。
3.權(quán)利要求1所述的耶氏酵母菌CCTCCΝ0:Μ 2014528的內(nèi)毒素吸附現(xiàn)象的直觀觀察方法，其特征在于利用熒光素標(biāo)記內(nèi)毒素與耶氏酵母菌CCTCC Ν0:Μ 2014528進(jìn)行孵育反應(yīng)，30°C孵育30 min后，用指甲油封片孵育反應(yīng)液，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到熒光信號(hào)明顯聚集于耶氏酵母菌細(xì)胞周圍的現(xiàn)象，而作為陰性對(duì)照的釀酒酵母菌實(shí)驗(yàn)組則無此現(xiàn)象。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK104498375SQ201410713700
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月2日
【發(fā)明者】王小元, 申露露, 蔡李萍, 李燁 申請(qǐng)人:江南大學(xué)