一株產(chǎn)d-阿拉伯糖醇的魯氏酵母菌株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一株產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的魯氏酵母菌株及其應用，涉及微生物工業(yè)菌株開發(fā)及應用領域。從天然荊條花蜜中分離到一株產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的耐高滲酵母菌Zygosaccharomycesrouxii。本發(fā)明所提供的菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CCTCC NO：M 2014205。5L發(fā)酵罐試驗跟蹤表明，該菌株代謝正常，發(fā)酵性能穩(wěn)定。利用該酵母菌株轉(zhuǎn)化底物D-葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇，工藝簡單，節(jié)約環(huán)保，其轉(zhuǎn)化率可達40%，具有實際應用價值，是一株優(yōu)良的產(chǎn)D-阿拉伯糖醇酵母菌株。CCTCC NO：M 20142052014.05.14
【專利說明】—株產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的魯氏酵母菌株及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物工業(yè)菌株開發(fā)及應用領域，涉及一種產(chǎn)D-阿拉伯糖醇酵母菌的篩選及其轉(zhuǎn)化D-葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的技術方法。
[0002]

【背景技術】
[0003]D-阿拉伯糖醇是一種天然存在的五碳多元糖醇，又稱D_( + )_阿拉伯醇，D( + )_樹膠糖醇，其分子式為C5H12O5，與木酮糖和木糖醇是同分異構體。常溫下，D-阿拉伯糖醇純品外觀為白色晶體，有甜味，吸濕性強。D-阿拉伯糖醇是一種具有較高營養(yǎng)價值的天然低熱值甜味物質(zhì)，抗齲齒，在生物機體內(nèi)的代謝作用不影響胰島素水平，可作為糖尿病人的營養(yǎng)齊U、治療劑，兒童防齲食品，食品添加劑，同時也是一種重要的神經(jīng)性藥物的合成中間體。因此，D-阿拉伯糖醇在食品，化工，醫(yī)藥等領域具有重要的應用價值。
[0004]目前，D-阿拉伯糖醇的制備方法主要采用化學合成和生物合成法?；瘜W合成法即通過催化還原D-阿拉伯糖醇或者D-來蘇糖獲得，該法工藝復雜，設備要求高，環(huán)境污染嚴重，尚未實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。生物合成法是利用微生物體內(nèi)的酶系將葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-阿拉伯糖醇，生產(chǎn)工藝簡單，操作粗放，投資小收益大。Spencer等人最早發(fā)現(xiàn)耐高滲酵母可產(chǎn)多元醇，開辟了生產(chǎn)多元糖醇的新途徑。Onishi等人報道了轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇是可行的。隨后，利用微生物制備D-阿拉伯糖醇的研究受到了國內(nèi)外學者的廣泛關注。
[0005]目前制約D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量的主要因素是副產(chǎn)物的產(chǎn)生和低轉(zhuǎn)化率，從自然環(huán)境直接分離篩選高產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的優(yōu)良酵母是最經(jīng)濟實用的獲得生產(chǎn)出發(fā)菌株的方法。本發(fā)明從天然荊條花蜜樣品中分離到一株產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的耐高滲魯氏接合酵母(.Zygosaccharomyces rouxii )0所提供菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號為:CCTCC M 2014205。利用該酵母菌株轉(zhuǎn)化底物D-葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇，工藝簡單，節(jié)約環(huán)保，其轉(zhuǎn)化率可達40%，具有實際應用價值，是一株優(yōu)良的產(chǎn)D-阿拉伯糖醇酵母菌株。
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一株新的產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的耐高滲魯氏酵母菌株，及其在葡萄糖發(fā)酵方面的應用。
[0008]本發(fā)明先利用高滲液體培養(yǎng)基對所采集的天然花蜜樣品進行富集培養(yǎng)，隨后涂布于高滲平板，挑取疑似菌落進行搖瓶發(fā)酵，采用薄層(微晶纖維素)層析法對發(fā)酵液中的糖醇類物質(zhì)進行初步定性檢測和粗定量檢測，初步篩選出D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量高、甘油等其他副產(chǎn)物產(chǎn)量低且葡萄糖殘留量少的菌株，將其發(fā)酵液再次通過高效液相色譜法進行定量復篩檢測，選育優(yōu)良的酵母菌株。
[0009]1、本發(fā)明所提供的魯氏接合酵母菌株JM-C46 (,Zygosaccharomyces rouxiiJM-C46)，已于2014年5月14日保藏于位于中國武漢武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為:CCTCCNO: M 2014205。
[0010]2、本發(fā)明利用所提供酵母菌株，采用250ml三角瓶進行搖瓶發(fā)酵，首先通過響應面法(RSM)對試驗菌株轉(zhuǎn)化底物葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基組分進行了優(yōu)化，然后通過單因素試驗對發(fā)酵條件進行了優(yōu)化；最后采用5L發(fā)酵罐試驗，進一步評價該菌株的發(fā)酵性能及其生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的能力。
[0011]發(fā)酵試驗結果表明:該菌株葡萄糖耐受濃度可達到500g/L。最適發(fā)酵條件為:底物D-葡萄糖濃度20-25%、酵母提取物1.07%、胰蛋白胨0.72%、發(fā)酵溫度30°C、自然pH、搖床轉(zhuǎn)速200rpm、轉(zhuǎn)化時間4天、接種量10%。
[0012]5L發(fā)酵罐試驗結果表明:該菌株在最適發(fā)酵條件下發(fā)酵結束后:葡萄糖殘量為:3.89 g/L、D-阿拉伯糖醇含量為:79.16 g/L、甘油含量為:9.43 g/L、乙醇含量為:3.21g/L。該菌株的產(chǎn)D-阿拉伯糖醇能力較高。
[0013]有益效果:
I)本發(fā)明采用高糖富集培養(yǎng)技術、薄層層析技術以及高效液相色譜技術篩選到了產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的優(yōu)良菌株CCTCC M 2014205。該菌株產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的能力較高。對發(fā)展生物轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的技術路線有一定的促進作用。
[0014]2)發(fā)酵罐試驗跟蹤的各項性能指標表明:該菌株代謝正常，產(chǎn)D-阿拉伯糖醇能力強，甘油、乙醇等副產(chǎn)物含量較低，葡萄糖殘?zhí)橇枯^低，是一株優(yōu)良的D-阿拉伯糖醇生產(chǎn)菌株。

【具體實施方式】
[0015]下面的實施例可以使本領域研究人員更全面地了解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0016]1、本發(fā)明所提供的魯氏接合酵母菌株JM-C46 (,Zygosaccharomyces rouxiiJM-C46)，已于2014年5月14日保藏于位于中國武漢武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為:CCTCCNO: M 2014205。
[0017]該菌株特點如下:
在顯微鏡下觀察，該菌株的細胞為圓形，多端芽殖；在固體培養(yǎng)基上，該菌株菌落特征為:奶油色，凸起，表面光滑濕潤，粘稠，邊緣整齊，菌落較小。
[0018]本發(fā)明酵母菌株采用下述流程進行選育:
花蜜樣品采集、高滲液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)、梯度稀釋、涂布高滲平板、劃線分離疑似菌落、進行搖瓶培養(yǎng)、薄層層析法初篩、高效液相色譜法復篩、5L發(fā)酵罐試驗、獲得目的菌株、鑒定、保藏。
[0019]實施例1:
具體操作過程如下:
1、高滲富集培養(yǎng)
配制富集培養(yǎng)基:40% D-glucose, 1% yeast extract, 1% peptone。
[0020]不同花蜜樣品分別稱取1.0 g，加入到含有20ml富集培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，渦旋均勻。30°C，200r/min，搖瓶培養(yǎng)3d。
[0021]將最終富集培養(yǎng)物梯度稀釋后，分別吸取200 μ I涂布到高滲平板，30°C培養(yǎng)3d。
[0022]挑選生長良好的疑似酵母的單菌落劃線分離純化，斜面保存于4°C冰箱。
[0023]2、采用TLC法初篩
配制發(fā)酵培養(yǎng)基:20% D-glucose, 1% yeast extract, 1% peptone。
[0024]在超凈工作臺，將分離到的不同酵母菌株，各取一環(huán)接入含有20ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中。30°C，200r/min,搖瓶培養(yǎng)4d。
[0025]發(fā)酵液處理方法:取不同菌株的發(fā)酵液各1ml, 1000r離心lOmin。
[0026]以微晶纖維素板為層析介質(zhì)，展開劑及其配比為:乙酸乙酯:吡啶:冰醋酸:水=16:10:2:3。層析前，層析劑需要預飽和Ih0
[0027]配制2%D_葡萄糖和2%D_阿拉伯糖醇標準溶液以及二者等比例的混合標樣，層析上樣量為I μ L，點樣線位于距離層析板下邊緣1.8厘米處，點樣結束后晾干，方可放入層析缸，層析時間為80min，重復層析3?4次。
[0028]層析結束后自然晾干，或置于50°C烘箱中加快殘留試劑的蒸發(fā)。
[0029]顯色劑的配制:硝酸銀丙酮溶液A-飽和氫氧化鈉酒精溶液B
A:取0.1mL飽和硝酸銀溶液,用丙酮稀釋至20mL,再逐滴加水至硝酸銀溶解即可將NaOH飽和水溶液用酒精稀釋至0.5mol/L。
[0030]用三角噴壺先將硝酸銀-丙酮溶液均勻噴于層析板上，充分晾干后再噴氫氧化鈉-乙醇溶液。
[0031]顯色完畢后標記D-阿拉伯糖醇含量較高的菌株，等待后續(xù)的進一步篩選。
[0032]3、采用HPLC法復篩
配制發(fā)酵培養(yǎng)基:20% D-glucose, 1% yeast extract, 1% peptone。
[0033]在超凈工作臺，將初篩得到的酵母菌株，各取一環(huán)接入含有20ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中。30°C，200r/min,搖瓶培養(yǎng)4d。
[0034]發(fā)酵液處理方法:取不同菌株的發(fā)酵液各1ml，用等體積的三氯乙酸沉淀蛋白3h，12000r離心20min,經(jīng)0.45 μ m水膜過濾處理,進樣量20 μ L。
[0035]1%質(zhì)量濃度標準溶液的配制:準確稱取D-葡萄糖、D-阿拉伯糖醇、赤蘚糖醇、乙醇、甘油各0.lg，用乙腈水溶液(V⑶:V水=1:1)定容至10ml。
[0036]樣品測定的分析條件:采用示差折光檢測器(RID，ShodexRIlOO)，色譜柱型號:，柱溫35°C，流動相為乙腈水溶液(Vill =V*=80:20)，流速0.8mL/min，檢測器溫度35°C，泵壓 43bar。
[0037]樣品測定方法:打開檢測器，預熱使穩(wěn)定；設定分析程序；安裝色譜柱，打開液相色譜儀，通入流動相，設定流速0.lmL/min，平衡2h ;使流動相流過樣品池，待基線穩(wěn)定后，在樣品表輸入樣品信息，按設定程序測樣，根據(jù)相同的保留時間來分析產(chǎn)物和底物的濃度。
[0038]4、搖瓶發(fā)酵試驗
I)在超凈工作臺上取保藏于試管斜面上的酵母菌一環(huán)，接入裝有10ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C、200rpm培養(yǎng)16h，以此作為種子發(fā)酵液。
[0039]2)葡萄糖濃度的優(yōu)化
配置不同葡萄糖濃度(15、20、25、30、35、40%)的發(fā)酵培養(yǎng)基50ml于250ml三角瓶中，其它成分相同，包括1%酵母提取物，1%蛋白胨。以接種量5%接入已配置好的各培養(yǎng)基中，30°C、200rpm、培養(yǎng)4天后，發(fā)酵液1000r離心lOmin，利用TLC法和HPLC法檢測發(fā)酵液上清中的殘?zhí)橇亢虳-阿拉伯糖醇量。
[0040]3)接種量的優(yōu)化
以不同接種量(5、8、10、12、15%)將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖濃度25%)中，30°C、200rpm、培養(yǎng)4天后，檢測發(fā)酵液上清中殘?zhí)橇亢虳-阿拉伯糖醇量的方法同上。[0041 ] 4)培養(yǎng)溫度的確定
以最佳接種量(10%)將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖濃度25%)中，在不同培養(yǎng)溫度(25、28、30、33、37 °C )條件下，200rpm培養(yǎng)4天后，檢測發(fā)酵液上清中殘?zhí)橇亢虳-阿拉伯糖醇量的方法同上。
[0042]5 )培養(yǎng)時間的確定
以最佳接種量(10%)將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖濃度25%)中，30°C、200rpm培養(yǎng)6天，每隔24h取樣1ml，檢測不同時期發(fā)酵液上清中殘?zhí)橇亢虳-阿拉伯糖醇量的方法同上。
[0043]6)搖床轉(zhuǎn)速的確定
以最佳接種量(10%)將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖濃度25%)中，在不同轉(zhuǎn)速(100、150、200、250rpm)下，30°C培養(yǎng)96h后，檢測發(fā)酵液上清中殘?zhí)橇亢虳-阿拉伯糖醇量的方法同上。
[0044]5、5L發(fā)酵罐試驗
I)在超凈工作臺上取保藏于試管斜面上的酵母菌一環(huán)，接入裝有10ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C、200rpm培養(yǎng)16h，使菌體處于對數(shù)生長中期。
[0045]2)將處于對數(shù)期的菌種接入裝有2L發(fā)酵液的5L發(fā)酵罐中。接種量為10%，30°C、200rpm培養(yǎng)4_6天，整個生長期容氧控制10% (通氣速率為0.5L/min)。
[0046]3)發(fā)酵結束后:葡萄糖殘量為:3.89 g/L、D_阿拉伯糖醇含量為:79.16 g/L、甘油含量為:9.43 g/L、乙醇含量為:3.21 g/L。該菌株產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的能力較高，轉(zhuǎn)化率可達 40% ο
【權利要求】
1.魯氏接合酵母菌株JM-C46Zygosaccharomyces rouxi i JM-C46，保藏編號為:CCTCCNO: M 2014205。
2.權利要求1所述的魯氏接合酵母菌株的應用，按照下述步驟進行: 1)在超凈工作臺上取保藏于試管斜面上的酵母菌一環(huán)，接入裝有10ml發(fā) 酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C、200rpm培養(yǎng)16h，以此作為種子發(fā)酵液； 2)葡萄糖濃度的優(yōu)化 配置葡萄糖濃度為15-40%的發(fā)酵培養(yǎng)基50ml于250ml三角瓶中，其它成分相同，包括質(zhì)量濃度為1%酵母提取物，質(zhì)量濃度為1%蛋白胨；以接種量5%接入已配置好的各培養(yǎng)基中，3(TC、200rpm、培養(yǎng)4天后，發(fā)酵液1000r離心1min ； 3)接種量的優(yōu)化 以體積比為5-15%接種量將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入葡萄糖質(zhì)量濃度為25%發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C、200rpm、培養(yǎng) 4 天后； 4)培養(yǎng)溫度的確定 以體積比為10%接種量將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入葡萄糖質(zhì)量濃度為25%發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度25-37°C條件下，200rpm培養(yǎng)4天后； 5)培養(yǎng)時間的確定 以體積比為10%接種量將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入葡萄糖質(zhì)量濃度為25%發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C,200rpm培養(yǎng)6天，每隔24h取樣1ml，檢測不同時期發(fā)酵液上清中殘?zhí)橇亢虳-阿拉伯糖醇量的方法同上； 6)搖床轉(zhuǎn)速的確定 以體積比為10%接種量將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入葡萄糖質(zhì)量濃度為25%發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)基中，在100-250rpm轉(zhuǎn)速下，30°C培養(yǎng)96h后， 7)5L發(fā)酵罐試驗 A.在超凈工作臺上取保藏于試管斜面上的酵母菌一環(huán)，接入裝有10ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C、200rpm培養(yǎng)16h，使菌體處于對數(shù)生長中期； B.將處于對數(shù)期的菌種接入裝有2L發(fā)酵液的5L發(fā)酵罐中； 接種量為10%，30°C、200rpm培養(yǎng)4_6天，整個生長期容氧控制10%，通氣速率為0.5L/min ； C.發(fā)酵結束后:葡萄糖殘量為:3.89 g/L、D-阿拉伯糖醇含量為:79.16 g/L、甘油含量為:9.43 g/L、乙醇含量為:3.21 g/L ;該菌株產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的能力較高，轉(zhuǎn)化率可達40%。
【文檔編號】C12N1/16GK104342377SQ201410337503
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年7月16日 優(yōu)先權日:2014年7月16日
【發(fā)明者】齊向輝, 王旭, 林靜, 朱靜斐, 羅艷, 王亮, 孫文敬 申請人:江蘇大學