一種耐高溫的超氧化物歧化酶及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種耐高溫的超氧化物歧化酶及其編碼基因和應(yīng)用。該基因編碼的超氧化物歧化酶其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SCSIO15029克隆得到一個新的超氧化物歧化酶基因sod，其編碼的超氧化物歧化酶SOD酶活為5511.46U mg-1，最適pH值為7.5，最適溫度在40℃左右，具有極高溫度熱穩(wěn)定性，可用于生物醫(yī)藥、化妝品和食品領(lǐng)域。
【專利說明】一種耐高溫的超氧化物歧化酶及其編碼基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥、化妝品和食品等領(lǐng)域，具體涉及一種耐高溫的超氧化物歧 化酶及其編碼基因和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】：
[0002] 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，S0D)主要生理作用是清除體內(nèi)氧自由 基，超氧化物歧化酶需要結(jié)合金屬離子才能催化清除氧自由基的過程，因此根據(jù)金屬離子 輔基的不同，可以將SOD分為三大類：Cu/Zn S0D，F(xiàn)e或Mn-SOD以及Ni-SOD。SOD酶制劑被 廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)藥、化妝品和食品領(lǐng)域。
[0003] SOD對許多疾病都有治療效果，比如癌癥。研究表明在癌癥早期SOD的活力較 低，服用SOD藥物能夠預(yù)防和治療癌癥。SOD強(qiáng)大的抑癌作用，不僅體現(xiàn)在抑制癌細(xì)胞擴(kuò) 散上，而且還能腫瘤發(fā)生早期的新陳代謝（Robbins and Zhao 2014)。SOD的抑癌機(jī)制比 較復(fù)雜，據(jù)報(bào)道，SOD缺乏能夠?qū)е翫NA雙鏈斷裂，從而導(dǎo)致細(xì)胞缺乏RAD54B，引起細(xì)胞凋 亡過程，而SOD能夠抑制多種腫瘤的發(fā)生，因此SOD抑癌機(jī)制可能次相關(guān)（Sajesh，Bailey et al. 2013)。SOD藥物對于食道癌、直腸癌和乳腺癌等均有較好療效（O'Leary，Hrabe et al. 2013 ；Radenkovic, Milosevic et al. 2013 ；Sun, Wang et al. 2013)〇
[0004] 在化妝品中添加 SOD的主要作用是利用SOD來清除自由基，人們在長期的強(qiáng)光，缺 氧等環(huán)境下能產(chǎn)生對皮膚造成損害的活性氧?；钚匝醪荒芗皶r(shí)清除會導(dǎo)致衰老。Semseil 等（Semseil，1999)發(fā)現(xiàn)衰老過程和SOD表達(dá)量的減少密切相關(guān)。另外，皮膚中的SOD表達(dá) 量也會隨著年齡的增長而減少。SOD可以通過皮膚吸收，解決諸多皮膚問題，因此SOD深受 女性的喜愛。曲愛琴等（曲愛琴等，1997)給酵母SOD高產(chǎn)菌適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以 純化得到了 SOD酶以為原料制成的霜劑化妝品對皺紋、粉刺和色素沉著有明顯療效，總有 效率為82. 1%。充分地支持這一結(jié)論。
[0005] SOD在食品中也有較大的應(yīng)用價(jià)值，一些SOD通過口服也是有效的，因此通過食物 補(bǔ)充SOD也是可行的。SOD酸奶、SOD啤酒、水果、大米等食品不斷被開發(fā)。但是食品加工過 程大多涉及到加熱提取，滅菌等過程，因此常溫SOD酶很難滿足應(yīng)用，開發(fā)穩(wěn)定高效的SOD 酶顯得十分迫切。
[0006] 如上所述，SOD酶主要應(yīng)用在食品、生物醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域，在這些領(lǐng)域都要求 SOD具有較高的穩(wěn)定性和酶活?，F(xiàn)階段SOD的來源主要有：第一，從動物或其組織中直接提 取。這種方法提取的SOD具有排他性，且不易常溫保存、又有艾滋病等血液病毒交叉感染的 潛在危險(xiǎn)，所以國際衛(wèi)生組織呼吁：立刻停止動物性SOD的使用。第二，從微生物或其它生 物中提取。此種方法，原材料的獲得和提取純化方法都比較繁瑣。第三，利用生物工程的方 法發(fā)酵獲得。這種方法不僅安全、不受原材料制約，而且技術(shù)簡單、效率高、成本低，是篩選 高活性，高穩(wěn)定性SOD酶較為可行的方法。
[0007] SOD酶穩(wěn)定性和酶活較高的多集中在SODA家族的Fe和Mn-SOD。如Zhu等從 深海來源的耐熱微生物（Geobacillus sp EPT3)克隆表達(dá)了一種Mn-SOD，這種SOD在 90°C下處理Ih仍有57%的酶活（Zhu，Wang et al.2014)。Liu等從嗜熱細(xì)菌（Thermus thermophilus HB27)分離一種Mn-SOD則能耐受更高的溫度，在100 °C處理Ih殘留酶 活仍有 57 % (Liu, Yin et al. 2011)。Boyadzhieva 等從一株枯草芽抱桿菌（Bacillus I i cheni f ormi s)中純化了一個Mn-SOD，酶在95 °C的半衰期為IOmin，但是其酶活高達(dá)9780U mg_l(Boyadzhieva，Atanasova et al. 2010)。Wang 等從鹽菌屬細(xì)菌（Rhodothermus sp XMH10)中克隆表達(dá)的一種SOD酶。該酶對KCN, NaN3和H2O2均不敏感，也屬于Mn-SOD酶 (Wang，Yang et al. 2008)。從以上的研究不難發(fā)現(xiàn)Mn-SOD-般具有較好的熱穩(wěn)定性，僅有 少量的報(bào)道其它類型的SOD具有耐高溫能力，如從熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus) 的一種Cu/Zn-SOD也具有較強(qiáng)的耐高溫能力，在70°C處理Ih剩余53 %酶活（E，Guo et al. 2007)。因此從SODA中開發(fā)穩(wěn)定性較好的超氧化物歧化酶是一種不錯的策略。
[0008] 因此獲得1?酶活和1?穩(wěn)定性的SOD是提1?其應(yīng)用價(jià)值的關(guān)鍵。本發(fā)明涉及到深海 來源的枯草芽孢桿菌中克隆一個SOD基因（屬SODA家族），并重組表達(dá)SOD酶，對SOD酶進(jìn) 行酶學(xué)性質(zhì)分析。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0009] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種新的、耐高溫的超氧化物歧化酶及其編碼基因。
[0010] 本發(fā)明的超氧化物歧化酶S0D，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 本發(fā)明的編碼上述超氧化物歧化酶SOD的超氧化物歧化酶基因 sod，其特征在于， 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。超氧化物歧化酶基因 sod全長609bp，編碼202個氨基 酸，命名為：超氧化物歧化酶S0D，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0012] 含有上述超氧化物歧化酶基因 sod的重組表達(dá)載體。
[0013] 所述的表達(dá)載體優(yōu)選為pET_28a(+)。
[0014] 一種含有上述重組表達(dá)載體的基因工程菌。
[0015] 所述的工程菌優(yōu)選為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0016] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述超氧化物歧化酶SOD在催化超氧陰離子自由基 發(fā)生歧化反應(yīng)中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明從枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)SCSI015029克隆得到一個新的超 氧化物歧化酶基因 sod，其編碼的超氧化物歧化酶SOD酶活為5511. 46U mg'最適pH值為 7. 5,最適溫度在40°C左右，具有極高溫度熱穩(wěn)定性，可用于生物醫(yī)藥、化妝品和食品領(lǐng)域。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0018] 圖1是超氧化物歧化酶SOD的SDS-PAGE圖，其中A :未誘導(dǎo)的BL21 (DE3)粗酶液； B: IPTG誘導(dǎo)的BL21 (DE3)粗酶液；C :純化的SOD蛋白；
[0019] 圖2是不同pH對超氧化物歧化酶SOD活力的影響；
[0020] 圖3是不同溫度對超氧化物歧化酶SOD酶活的影響；
[0021] 圖4是40?90°C處理后的酶液的SDS-PAGE圖；
[0022] 圖5是不同溫度處理Ih后超氧化物歧化酶SOD的活性情況。

【具體實(shí)施方式】：
[0023] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0024] 實(shí)施例1 :超氧化物歧化酶基因 sod開放閱讀框邊界確定
[0025] 將枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)SCSI015029在LB固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)。LB 液體培養(yǎng)基配方為：每升水中含有NaCl 10g，酵母粉5g，蛋白胨10g。將NaCl 10g，酵母粉 5g，蛋白胨IOg放入IOOOml水中，混勻后滅菌備用。LB固體培養(yǎng)基是LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ) 上每升添加瓊脂15g。
[0026] 挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中，200rpm，37°C培養(yǎng)。取3mL菌液離心，收集菌體， 用DNA提取試劑盒提取總DNA，經(jīng)16S rRNA驗(yàn)證無誤后，交至上海美吉生物科技有限公司測 序。
[0027] 對基因組進(jìn)行注釋，分析其中的超氧化物歧化酶基因 sod，確定了其中超氧化物歧 化酶基因 sod，設(shè)計(jì)引物如下：
[0028] 正向引物：5 ' -GGAATTCCATATGGCTTACGAACTTCCAGAATTAC-3 '
[0029] 反向引物：5 ' -CCGCTCGAGTTATTTTGCTTCGCTGTATAG-3，。
[0030] 實(shí)施例2 :超氧化物歧化酶基因 sod的克隆及載體構(gòu)建
[0031] 1、PCR 擴(kuò)增
[0032] 引物送至上海生物工程有限公司合成引物，合成的引物使用TE稀釋到10 μ M，建 立如下反應(yīng)體系（表1):
[0033] 引物為：
[0034] 正向引物：5 ' -GGAATTCCATATGGCTTACGAACTTCCAGAATTAC-3 '
[0035] 反向引物：5 ' -CCGCTCGAGTTATTTTGCTTCGCTGTATAG-3 '
[0036] 表I :PCR反應(yīng)體系

【權(quán)利要求】
1. 一種超氧化物歧化酶SOD，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. -種編碼權(quán)利要求1所述的超氧化物歧化酶SOD的超氧化物歧化酶基因sod，其特 征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. -種含有權(quán)利要求2所述的超氧化物歧化酶基因sod的重組表達(dá)載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體為pET-28a (+)。
5. -種含有權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體的基因工程菌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述的工程菌為大腸桿菌 BL21(DE3) 〇
7. 權(quán)利要求1所述的超氧化物歧化酶SOD在催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)中的 應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/53GK104388401SQ201410669742
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】胡云峰, 鄧盾, 張?jiān)? 孫愛君, 梁甲元, 李潔, 田新朋 申請人:中國科學(xué)院南海海洋研究所