融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種I-TevIN201-Cas9null融合蛋白及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明通過(guò)將I-TevIN201的N端201氨基酸和Cas9null（沒(méi)有切割活性）的N端融合，得到一種I-TevIN201-Cas9null融合蛋白，該蛋白在gRNA的引導(dǎo)下，可以序列特異性的切割CNNNG位點(diǎn)，達(dá)到精確切割基因組的作用，從而使細(xì)胞的脫靶效應(yīng)大大降低；此外利用本發(fā)明所得I-TevIN201-Cas9null融合蛋白做藥物篩選或基因修飾時(shí)更安全，該蛋白還可用于基因治療。
【專(zhuān)利說(shuō)明】I -Tev I圓-〇359。。| I融合蛋白及其應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種I-Tevlwwi-化s9"uii融合蛋白及其應(yīng) 用。
[0003]

【背景技術(shù)】
[0004] CRISPR-化S源自細(xì)菌和古細(xì)菌的免疫系統(tǒng)，可利用祀點(diǎn)特異性的RNA將化s9核酸 酶帶到基因組上的具體祀點(diǎn)，從而對(duì)特定基因位點(diǎn)進(jìn)行修飾。RNA導(dǎo)向化s9可W在多種細(xì) 胞和生物體中發(fā)揮功能，在特異位點(diǎn)裂解完整基因組?；痵9該種基因組編輯的潛能使該項(xiàng) 技術(shù)已經(jīng)廣泛用于人的細(xì)胞系，小鼠，大鼠，多物種的基因敲除及敲入。
[0005] I-TevI是一種歸巢酶，它有N末端的催化結(jié)構(gòu)域，中間的鏈接區(qū)域和C末端的DNA 結(jié)合域構(gòu)成。該酶序列特異性的識(shí)別CNNNG序列。
[0006] 特異性的濁NA祀向的化s9基因敲除技術(shù)已經(jīng)有了比較廣的應(yīng)用，但是該技術(shù)存 在很大的不足，就是脫祀效應(yīng)。為了提高打祀的特異性，有很多改進(jìn)，比如選擇多個(gè)濁NA打 祀，然后進(jìn)行脫祀效應(yīng)分析，此外，還有用兩個(gè)突變型的化s9即Cas9 nickase，用兩個(gè)gRNA 引導(dǎo)化s9 nickase去進(jìn)行切割。還有的科學(xué)家用失活的化s9即化s9duii，連接一個(gè)化rkl 蛋白（Cas9"uii-ForkI )，對(duì)特定基因位點(diǎn)進(jìn)行修飾，但是仍然存在脫祀效應(yīng)。為了最大程度 上提高其特異性，我們用失活的化s9即化s9"uii和特異性識(shí)別CNNNG序列的I-TevI W2CU蛋 白融合，形成一個(gè)濁NA祀向的，特異性切割CNNNG序列工具酶，該工具酶可W對(duì)基因組進(jìn)行 精確的基因編輯。
[0007]


【發(fā)明內(nèi)容】

[000引解決的技術(shù)問(wèn)題： 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種I-Tevlwwi-化s9"uii融合蛋白，即將 I-Tevlw2cu的N端201氨基酸和化s9。。11 (沒(méi)有切割活性）的N端融合。該蛋白在濁NA的引 導(dǎo)下，可W序列特異性的切割CNNNG位點(diǎn)，達(dá)到精確切割基因組的作用，使產(chǎn)生的脫祀效應(yīng) 大大降低。
[000引技術(shù)方案： I-TevI胃-Cas9"ii融合蛋白，所述融合蛋白為由SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列組成的 蛋白。
[0010] 所述的I-TevlN2cn-化s9"uii融合蛋白的核巧酸序列。
[0011] W上所述的核巧酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[001引所述的I-TevI胃-Cas9"uii融合蛋白，其第十位天冬氨酸突變成丙氨酸，第839位 組氨酸突變成丙氨酸，第840位組氨酸突變成丙氨酸，第863位天冬醜胺突變成丙氨酸，該 突變蛋白沒(méi)有核酸酶活性。
[001引所述的I-TevlN20i-Cas9n山1融合蛋白，其中I-TevlN20i蛋白由歸巢酶I-TevI N末端 201個(gè)氨基酸組成，包含I-TevI的酶的催化活性區(qū)域和連接域。
[0014] 所述的I-TevlN2cn-Cas9nuii融合蛋白在藥物篩選及基因修飾中的應(yīng)用。
[0015] 所述的I-Tevlwwi-化s9"uii融合蛋白的基因可W克隆到真核表達(dá)載體上，用于細(xì)胞 和動(dòng)物的基因修飾。
[0016] 有益效果 本發(fā)明通過(guò)將I-Tevlw2cu的N端201氨基酸和化s9。。11 (沒(méi)有切割活性）的N端融合， 得到一種I-Tevlw2cn-化s9"ii融合蛋白，該蛋白在gRNA的引導(dǎo)下，可W序列特異性的切割 CNNNG位點(diǎn)，達(dá)到精確切割基因組的作用，從而使細(xì)胞的脫祀效應(yīng)大大降低；此外利用本發(fā) 明所得I-Tevlwwi-化s9"uii融合蛋白做藥物篩選或基因修飾時(shí)更安全，該蛋白還可用于基因 治療。
[0017] 現(xiàn)有的技術(shù)對(duì)基因組切割都是序列非特異的切割，gRNA的引導(dǎo)下，化s9蛋白可W 在濁NA序列上，序列兩邊做隨意的切割。而本發(fā)明I-Tevlw2cu-化s9"uii融合蛋白可W精確 的進(jìn)行序列特異性的切割，在濁NA的引導(dǎo)下，特異性的識(shí)別切割CNNNG序列。所W，它的特 異性和可控性非常大，因此，本發(fā)明的應(yīng)用更廣，更實(shí)用。
[0018]

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[001引圖1為I-TevlN20rCas9nuu蛋白活性的驗(yàn)證圖，由圖可見(jiàn)為I-TevlN20i-Cas 9nuu蛋白 與線(xiàn)性化的質(zhì)粒PDNA3. 1，tracrRNA，Mg", gRNA賠育該一組，DNA有切割活性，其他組沒(méi)有 切割活性； 圖2為PCR擴(kuò)增Srebf2基因，回收PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果圖(野生型對(duì)照）； 圖3為1-16乂1,2。1-化39。山凍白對(duì)5'66'2基因切割活性驗(yàn)證圖，將1-16乂1,2。1-化39。山1 真核表達(dá)載體和濁NA載體同時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠L929細(xì)胞，經(jīng)過(guò)Hygromycin篩選，挑取一個(gè)單克 隆?；厥誔CR產(chǎn)物送測(cè)序，結(jié)果顯示與野生型對(duì)照對(duì)比，I-Tevlw2cii-化s9"uu蛋白對(duì)Srebf2 基因都有切割活性。
[0020] 圖4為I-Tevlw2cu-Cas9"uii蛋白對(duì)Srebf2基因切割活性驗(yàn)證圖，將 I-TevlN2cu-化s9"uii真核表達(dá)載體和濁NA載體同時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠L929細(xì)胞，經(jīng)過(guò)Hygromycin 篩選，隨機(jī)再挑取第二個(gè)單克隆。回收PCR產(chǎn)物送測(cè)序，結(jié)果顯示與野生型對(duì)照對(duì)比， I-Tevlw2cu-Cas9"uii蛋白對(duì)Srebf2基因都有切割活性。
[0021]

【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員 將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明 具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠(chǎng)商者，均為可W通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0023] 本發(fā)明中，引物 Prime;r_F、引物 Prime;r_ R、引物 I-TevlN2cii-化s9nuii _F: Ndel、引 物I-TevI胃-化s9"uii _R;、各引物購(gòu)于生工生物工程化海）股份有限公司；原核表達(dá)載體 pET-1化購(gòu)于Novagen;大腸桿菌E. coli E5L21購(gòu)于"TakarasIPTG購(gòu)于"Takara;膠回收試 劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；小鼠L929細(xì)胞購(gòu)于博研（上海）生物科技有限 公司，I-Tevlwwr化s9nuiiDNA序列是委巧生工生物工程（上海）股份有限公司合成的。
[0024] 實(shí)施例1 I-Tevlw2cn-Cas9"ii蛋白的表達(dá)與純化 方法如下： 第一部分；I-Tevlw2cii-化s9duii真核表達(dá)載體的構(gòu)建： 序列合成 I-TevlN2cu-Cas9"uii，W I-TevlN2cn-Cas9"uiiDNA 序列（SEQ ID NO. 2)為模板， 用引物 Primer_F;CAGCCTCCGGACTCTAGAATGAAAAGCGGAATTTATCAGAT (沈Q ID NO. 3)和引 物 Primer_ R: AACTCATTACTAACCGGTCACCTTCCTCTTCTTCTTGGGGTC (沈Q ID NO. 4)擴(kuò)增 I-TevlN2cu-Cas9"uii，克隆到 hCas9 載體的甜al&Agel 位點(diǎn)，構(gòu)建成 pI-TevlN2cn-Cas9"uii載體。
[0025] 具體的擴(kuò)增步驟如下： PCR擴(kuò)增I-Tevlw2(ii-化s9"ii，配置反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下： 表1反應(yīng)體系

【權(quán)利要求】
1. I-TevIN2Q1-CaS9 nullffi合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為由SEQ ID NO. 1所示氨基 酸序列組成的蛋白。
2. 編碼權(quán)利要求1所述的I-TevI N2(ll_Cas9null融合蛋白的核苷酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 /_J、i〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的I-TevI N2(ll_Cas9null?合蛋白，其特征在于，其第十位天冬氨 酸突變成丙氨酸，第839位組氨酸突變成丙氨酸，第840位組氨酸突變成丙氨酸，第863位 天冬酰胺突變成丙氨酸，該突變蛋白沒(méi)有核酸酶活性。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的I-TevI N2Q1-CaS9nullffi合蛋白，其特征在于，其中I-TevI疆蛋 白由歸巢酶I-TevI N末端201個(gè)氨基酸組成，包含I-TevI的酶的催化活性區(qū)域和連接域。
6. 權(quán)利要求1所述的I-TevI N2(ll-Cas9nullffi合蛋白在藥物篩選及基因修飾中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/52GK104513814SQ201410656386
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2014年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月18日
【發(fā)明者】李云英 申請(qǐng)人:李云英