攜帶cas9的重組腺病毒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種攜帶CAS9的重組腺病毒及其應(yīng)用。本發(fā)明要求保護(hù)攜帶Cas9蛋白的編碼基因的重組腺病毒；所述Cas9蛋白如序列表的序列7所示。所述Cas9蛋白的編碼基因具體可如序列表的序列6自5’末端第789-5045位核苷酸所示。本發(fā)明還保護(hù)以上所述的重組腺病毒在制備用于敲除目的基因的試劑盒中的應(yīng)用。CRISPR方法具有效率高，速度快，費(fèi)用低的特點(diǎn)。本發(fā)明提供的CAS9的重組腺病毒可用于：(1)蛋白功能細(xì)胞平臺，快速基因修飾，高通量篩選；(2)肝臟蛋白功能平臺，在肝臟實(shí)現(xiàn)快速、特異基因敲除；(3)小鼠基因改造平臺，制備基因敲除/敲入小鼠。
【專利說明】攜帶CAS9的重組腺病毒及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種攜帶CAS9的重組腺病毒及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]隨著基因組注釋項(xiàng)目(genome annotat1n projects)的不斷發(fā)展和完善，以及蛋白質(zhì)組計劃(proteome projects)的實(shí)施,科研人員們已經(jīng)開始躍躍欲試，想要將組學(xué)研究的成果盡早地運(yùn)用到基礎(chǔ)科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，以及個性化醫(yī)療(personalizedmedicine)當(dāng)中。不過海量的組學(xué)信息也給科研人員們出了一個不小的難題，那就是該如何將這些枯燥的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成有意義的蛋白質(zhì)功能，或者與臨床相關(guān)的信息呢？解決這個問題的核心就在于盡快開發(fā)出一種高效率的、可靠的方法，來幫助科研人員研究基因型(genotype)對表型(phenotype)的影響作用。利用同源重組機(jī)制(homologousrecombinat1n)對基因進(jìn)行定向失活(Targeted gene inactivat1n)就是這樣一種好方法，可以幫助科研人員明確基因或蛋白的功能。不過在實(shí)際工作中使用這種方法也會受到好幾個因素的限制，比如存在效率太低、費(fèi)時費(fèi)力、而且有可能導(dǎo)致突變等的限制。
[0003]近十年來出現(xiàn)了兩種新的研究手段，可以幫助科研人員對各種細(xì)胞和各種生物體內(nèi)的幾乎任意基因進(jìn)行人工操作。這種新技術(shù)就是我們常說的“基因組編輯技術(shù)(genome editing) ”，包括鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶(transcript1n activator-like effector nucleases, TALEN)。這兩種核酸酶都是嵌合體，都是由經(jīng)過設(shè)計的、序列特異性的DNA結(jié)合元件(programmable, sequence-specific DNA-binding modules)和非特異性的 DNA 切割結(jié)構(gòu)域結(jié)合而成的。ZFN和TALEN都可以對DNA進(jìn)行各種遺傳修飾，這兩種核酸酶的作用機(jī)制都是先對D NA雙鏈分子進(jìn)行切割，形成DNA雙鏈斷裂切口(DNA double-strand break，DSB)，然后激活細(xì)胞內(nèi)的非同源末端連接(nonhomologous end joining, NHEJ)修復(fù)機(jī)制(這是一種非保真的、容易出現(xiàn)遺傳突變的修復(fù)機(jī)制)或者同源重組(homology-directed repair,HDR)修復(fù)機(jī)制(這是一種高保真的修復(fù)機(jī)制，不容易出現(xiàn)突變)，利用細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制對DNA進(jìn)行遺傳學(xué)修飾。
[0004]這種由序列特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與非特異性的DNA切割結(jié)構(gòu)域組合而成的人工核酸酶就是這種基因組編輯技術(shù)的重要組成部分。這些嵌合式的核酸酶能夠以極高的效率、極高的精確度對基因組進(jìn)行人工修飾，切割DNA產(chǎn)生DSB，然后利用NHEJ或HDR等DSB修復(fù)機(jī)制完成所需要的各種人工修飾。由于科研人員們對鋅指蛋白和TALE蛋白等蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的設(shè)計能力越來越強(qiáng)，所以這種基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用范圍也一再地被拓展。這些既簡單又靈活的核酸酶在遺傳工程學(xué)領(lǐng)域里發(fā)揮了極大的作用，其重要性也在與日俱增，已經(jīng)站到了遺傳工程工作的最前線。
[0005]CRISPRs 全稱為規(guī)律成族間隔短回文重復(fù)(Clustered regularly interspacedshort palindromic repeats),這是一類廣泛分布于細(xì)菌和古菌基因組中的重復(fù)結(jié)構(gòu)。這一模式出現(xiàn)在超過40 %的細(xì)菌和90 %的古生菌中。研究表明，CRISPR與一系列相關(guān)蛋白、前導(dǎo)序列一起，能為原核生物提供對抗噬菌體等外源基因的獲得性免疫能力。
[0006]起初，很多研究人員假定這些奇怪的重復(fù)序列是毫無意義的，但是2005年，三個生物信息學(xué)團(tuán)隊(duì)報告，間隔區(qū)DNA通常和噬菌體的基因序列相匹配，表明CRISPR在微生物免疫中可能發(fā)揮了作用。馬里蘭州美國國家生物技術(shù)信息中心的Eugene Koonin和他的同事提出，細(xì)菌和古生菌獲得了噬菌體DNA，之后將其作為RNA分子(能阻止外來DNA的匹配)的一個模板保存起來，就像真核細(xì)胞利用一個被稱作核糖核酸干擾(RNAi)的系統(tǒng)摧毀RNA一樣。
[0007]2007年，Rodolphe Barrangou、Philippe Horvath和其他人證明，他們能通過添加或刪除和噬菌體DNA相匹配的間隔區(qū)DNA，改變嗜熱鏈球菌對噬菌體攻擊的抵抗力。這一發(fā)現(xiàn)使得杜邦公司能夠?yàn)槭称飞a(chǎn)培育更強(qiáng)壯的菌株。他們同時也發(fā)現(xiàn)了其中隱藏的基本的原理:遭遇噬菌體入侵時，CRISPR會作出反應(yīng)，此時細(xì)菌把間隔區(qū)DNA和DNA回文序列轉(zhuǎn)錄成一串長的RNA分子，tracrRNA (—個額外的RNA片段)和Cas9 —起作用產(chǎn)生crRNA (源自間隔區(qū)的RNAs)。2011年， Charpentier于在《自然》雜志上提出，Cas9、tracrRNA和crRNA一起以某種方法攻擊和crRNA配對的外來DNA。
[0008]不僅是食品科學(xué)家和微生物學(xué)家，很多領(lǐng)域的研究人員都意識到細(xì)菌免疫系統(tǒng)的重要性，因?yàn)樗邆湟粋€非常有價值的特性:以某個特定的基因序列為目標(biāo)。許多科研團(tuán)隊(duì)利用它來刪除、添加、激活或抑制人體、老鼠、斑馬魚、細(xì)菌、果蠅、酵母、線蟲和農(nóng)作物細(xì)胞中的目標(biāo)基因，從而證明了這個技術(shù)的廣泛適用性。
[0009]在以上提到的三種精確操縱基因的技術(shù)中，CRISPR的功效和易用性在各方面都更勝一籌。在切割目標(biāo)DNA方面，CRISPR系統(tǒng)要比TALENs更高效，且能比TALENs處理更多的基因。
[0010]Zhang Feng和他的同事的實(shí)驗(yàn)顯示，CRISPR能立刻鎖定和切割人體細(xì)胞中的兩個基因。在與馬薩諸塞州懷海德生物醫(yī)學(xué)研究所發(fā)育生物學(xué)家Rudolf Jaenisch的合作中，Zhang分裂了小鼠胚胎干細(xì)胞中的5個基因。這些工作為培育轉(zhuǎn)基因小鼠打下了基礎(chǔ)，這是生物醫(yī)學(xué)研究的一個關(guān)鍵工具。他的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，這能簡單地將Cas9信使RNA和兩個向?qū)NAs注入老鼠的卵子或受精卵中。此外，通過對Cas9基因進(jìn)行改構(gòu)和利用一對gRNA引入不同的切割位點(diǎn)，CRISPR的脫靶效應(yīng)問題也被克服。至此，CRISPR技術(shù)本身走向完善，并開始進(jìn)入了應(yīng)用階段。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是提供一種攜帶CAS9的重組腺病毒及其應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明要求保護(hù)攜帶Cas9蛋白的編碼基因的重組腺病毒；所述Cas9蛋白如序列表的序列7所不。所述Cas9蛋白的編碼基因具體可如序列表的序列6自5’末端第789-5045位核苷酸所示。
[0013]所述的重組腺病毒的制備方法包括如下步驟:
[0014](I)將所述Cas9蛋白的編碼基因插入pD0NR?221載體的attLl和attL2位點(diǎn)之間，得到中間質(zhì)粒；
[0015](2)將中間質(zhì)粒與pAD-DEST載體發(fā)生gateway反應(yīng)，得到含有所述CAS9蛋白的編碼基因的重組質(zhì)粒，即為重組質(zhì)粒PAD-DEST-CAS9 ；
[0016](3)將重組質(zhì)粒pAD-DEST-CAS9導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞并培養(yǎng)，得到所述重組腺病毒。
[0017]所述中間質(zhì)粒具體可為用序列表的序列6所不的含有Cas9蛋白的編碼基因的雙鏈DNA分子替換pD0NR?221載體的attLl和attL2之間的小片段(含attLl和attL2)，得到的重組質(zhì)粒。
[0018]所述哺乳動物細(xì)胞具體可為293細(xì)胞。
[0019]本發(fā)明還保護(hù)一種重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒pAD-DEST-CAS9)，其制備方法如下:
[0020](I)將所述Cas9蛋白的編碼基因插入pD0NR?221載體的attLl和attL2位點(diǎn)之間，得到中間質(zhì)粒；
[0021](2)將中間質(zhì)粒與pAD-DEST載體發(fā)生gateway反應(yīng)，得到含有所述CAS9蛋白的編碼基因的重組質(zhì)粒。
[0022]本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述的重組腺病毒在制備用于敲除目的基因的試劑盒中的應(yīng)用。所述目的基因具體可為CEBPA蛋白的編碼基因。所述CEBPA蛋白的編碼基因具體可為具有序列表的序列3所示的核苷酸的DNA分子。
[0023]本發(fā)明還保護(hù)一種用于敲除目的基因的試劑盒，包括以上任一所述的重組腺病毒。所述試劑盒還可包括攜帶所述目的基因的sgRNA的編碼基因的重組慢病毒。所述目的基因具體可為CEBPA蛋白的編碼基因。所述CEBPA蛋白的編碼基因具體可為具有序列表的序列3所示的核苷酸的DNA分子。所述目的基因的sgRNA的編碼基因具體可如序列表的序列I或序列2所示。所述攜帶所述目的基因的sgRNA的編碼基因的重組慢病毒的制備方法具體如下:將重組質(zhì)粒pLent1-U6 sgRNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞并培養(yǎng)，得到攜帶所述目的基因的sgRNA的編碼基因的重組慢病毒；所述重組質(zhì)粒pLent1-U6sgRNA的制備方法如下:①合成序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子并作為模板,采用序列表的序列4所示的單鏈DNA分子和序列表的序列5所示的單鏈DNA分子組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；②合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子并作為模板，采用序列表的序列4所示的單鏈DNA分子和序列表的序列5所示的單鏈DNA分子組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；③用限制性內(nèi)切酶SalI和XbaI酶切pLK0.1載體，回收載體骨架；④將步驟①得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、步驟②得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟③得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pLent1-U6 sgRNA。所述試劑盒還可包括所述重組質(zhì)粒pLenti_U6 sgRNA。所述哺乳動物細(xì)胞具體可為293T細(xì)胞。
[0024]發(fā)明人構(gòu)建了 pLenti_U6 sgRNA慢病毒載體和CAS9腺病毒載體。pLenti_U6sgRNA慢病毒載體導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞并培養(yǎng)，可以得到表達(dá)特定基因的小向?qū)NA(smallguide RNA, sgRNA)的重組慢病毒。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求，可以設(shè)計并合成針對不同基因的pLent1-U6sgRNA載體。CAS9腺病毒載體導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞并培養(yǎng)，可以得到表達(dá)CAS9蛋白的重組腺病毒。將表達(dá)特定基因的小向?qū)NA的重組慢病毒和表達(dá)CAS9蛋白的重組腺病毒共同感染目的細(xì)胞，就可以沉默目的細(xì)胞中的特定基因，很方便的對各種細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯。也可以將表達(dá)特定基因的小向?qū)NA的重組慢病毒和表達(dá)CAS9蛋白的重組腺病毒共同感染小鼠，可以對小鼠肝臟(腺病毒在肝臟中可以得到富集)中蛋白進(jìn)行基因組編輯，從而無需制備轉(zhuǎn)基因組小鼠。制備轉(zhuǎn)基因小鼠耗費(fèi)的時間長，約需3個月，應(yīng)用病毒感染的方法僅需1-2周。制備轉(zhuǎn)基因小鼠的單個基因費(fèi)用在大約15萬元，應(yīng)用病毒感染的方法所需花費(fèi)在I萬元左右。
[0025]CRISPR方法具有效率高，速度快，費(fèi)用低的特點(diǎn)。本發(fā)明提供的CAS9的重組腺病毒可用于:(1)蛋白功能細(xì)胞平臺，快速基因修飾，高通量篩選；(2)肝臟蛋白功能平臺，在肝臟實(shí)現(xiàn)快速、特異基因敲除；(3)小鼠基因改造平臺，制備基因敲除/敲入小鼠。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為實(shí)施例2的結(jié)果。
[0027]圖2為實(shí)施例3的步驟3的結(jié)果。
[0028]圖3為實(shí)施例3的步驟4的結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0029]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0030]pLK0.1 載體:sigma 公司，貨號:SHC001o 293T 細(xì)胞=ATCC,編號為 CRL-3216。AML12細(xì)胞(小鼠正常肝細(xì)胞):ATCC，編號為CRL-2254。293細(xì)胞:ATCC，編號為CRL-1573。pAD-DEST 載體(pBL0CK-1T?6-DEST Vector):1nvitrogen 公司，產(chǎn)品目錄號為V48720。C57小鼠:北京華阜康生物科技股份有限公司。pD0NR?221載體(Gateway?pD0NR?221 Vector) =Invitrogen 公司，目錄號 12536017。
[0031 ] 實(shí)施例1、sgRNA病毒液和CAS9病毒液的制備
[0032] 一、靶位點(diǎn)的選擇
[0033]米用CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-A(CCAAT_enhancer binding protein-alpha, CEBPA)作為靶序列，驗(yàn)證CRISPR/Cas9系統(tǒng)的可靠性和真實(shí)性，為了避免脫靶效應(yīng)，選擇兩個gRNA串聯(lián)的靶區(qū)域，
[0034]兩個gRNA的DNA序列分別如下:
[0035]gRNA1:5，-GAAAGGACGAAACACCGAAGGCGGCCGGGTCGATGTAGGgttttagagctagaaat_3’ ；
[0036]gRNA2:5’-GAAAGGACGAAACACCGCACAGCCGACAGCAGGAGAAGGgttttagagctagaaat~3’。
[0037]gRNAl如序列表的序列I所示(其靶區(qū)域?yàn)樾蛄斜淼男蛄?自5’末端第323-345位核苷酸)。gRNA2如序列表的序列2所示(其靶區(qū)域?yàn)樾蛄斜淼男蛄?自5’末端第375-397位核苷酸)。CEBPA蛋白的編碼基因的片段如序列表的序列3所示。
[0038]二、重組質(zhì)粒 pLenti_U6 sgRNA 的構(gòu)建
[0039]1、合成序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子。
[0040]2、以步驟I合成的DNA分子為模板，采用CRISPR-F和CRISPR-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0041]CRISPR-F (序列表的序列 4):5’ -GTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG-3，；
[0042]CRISPR-R(序列表的序列 5):5’ -gttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagο?ο?ββββο-3 ο
[0043]3、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0044]4、以步驟3合成的DNA分子為模板，采用CRISPR-F和CRISPR-R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0045]5、用限制性內(nèi)切酶SalI和XbaI酶切pLK0.1載體，回收約4kbp的載體骨架。
[0046]6、采用Gibson Assembly試劑盒(NffB,產(chǎn)品目錄號為E2611,說明書見https: //www.neb, com/protocols/2012/09/25/gibson-assembly-master-mix-assemb ly)并按試劑盒說明書操作，使得步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、步驟3得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟5得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pLent1-U6 sgRNA。
[0047]三、sgRNA重組慢病毒的制備
[0048]1、取對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，胰蛋白酶消化后用含10% (體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基懸浮得到細(xì)胞懸液，將每20ml細(xì)胞懸液(含1.2 X 17個細(xì)胞)接種至一個直徑為15cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h(細(xì)胞密度達(dá)到70% -80% )。
[0049]2、完成步驟I后，棄除上清液，加入新配制的DMEM培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2h。
[0050]3、完成步驟2后，借助Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號為12566014)并按說明書操作，每個細(xì)胞培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染20μ g重組質(zhì)粒pLent1-U6sgRNA，在37°C>5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8h。
[0051]4、完成步驟3后，棄除上清液，用20ml PBS緩沖液(pH7.4,0.01M)洗滌沉淀，然后加入新配制的含10% (體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h。
[0052]5、完成步驟4后,取上清液。
[0053]6、取步驟5得到的上清液，4°C、4000g離心10min，收集上清液。
[0054]7、將 I 體積份 lentivirus precipat1n solut1n (ALSTEM,產(chǎn)品目錄號為 VC100)和4體積份步驟6得到的上清液置于離心管中并混勻，然后4000 Xg離心20min，離心管中的體系分為2層，收集上層清液，即為含有表達(dá)gRNAl和gRNA2的慢病毒的病毒液，簡稱sgRNA病毒液(sgRNA病毒液中的病毒含量為2 X 107pfu/ml)。
[0055]四、重組質(zhì)粒pAD-DEST-CAS9的構(gòu)建
[0056]1、用序列表的序列6所示的含有Cas9蛋白的編碼基因的雙鏈DNA分子替換pD0NR?221載體的attLl和attL2之間的小片段(含attLl和attL2)，得到中間質(zhì)粒。序列表的序列6中，自5’末端第789-5045位核苷酸為CAS9蛋白的編碼基因。
[0057]2、中間質(zhì)粒與pAD-DEST載體發(fā)生gateway反應(yīng)(BP重組)，得到含有CAS9蛋白的編碼基因的重組質(zhì)粒，即為重組質(zhì)粒PAD-DEST-CAS9。
[0058]五、CAS9重組腺病毒的制備
[0059]1、取對數(shù)生長期的293細(xì)胞，胰蛋白酶消化后用含10% (體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基懸浮得到細(xì)胞懸液，將每1ml細(xì)胞懸液(含5 X 15個細(xì)胞)接種至一個直徑為60mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h(細(xì)胞匯合率為50-70% )。
[0060]2、完成步驟I后，棄除上清液，加入新配制的DMEM培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2h。
[0061]3、用限制性內(nèi)切酶Pac I酶切重組質(zhì)粒pAD_DEST_CAS9，使其線性化，得到線性化質(zhì)粒。
[0062]4、完成步驟2后,借助Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號:12566014)并按說明書操作，轉(zhuǎn)染6yg步驟3得到的線性化質(zhì)粒(以單個培養(yǎng)皿計)，在37°C>5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8h。
[0063]5、完成步驟4后，棄除上清液，用20ml PBS緩沖液(pH7.4,0.01Μ)洗滌，然后加入新配制的含10% (體積比)小牛血清、I %青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7天。
[0064]6、完成步驟5后，用細(xì)胞刮從培養(yǎng)皿中刮下細(xì)胞并移入50ml錐形管，離心收集細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基重懸，得到細(xì)胞懸液。
[0065]7、將步驟6得到的細(xì)胞懸液進(jìn)行反復(fù)凍融(現(xiàn)在液氮中凍結(jié)細(xì)胞，然后在37°C水浴中溶解，劇烈振蕩；共凍融4次)，收集上清液，即為初始病毒液。
[0066]8、取對數(shù)生長期的293細(xì)胞，胰蛋白酶消化后用含10% (體積比)FBS的DMEM培養(yǎng)基懸浮得到細(xì)胞懸液，將每1ml細(xì)胞懸液(含5 X 15個細(xì)胞)接種至一個直徑為60mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h(細(xì)胞匯合率為50-70% )。
[0067]9、完成步驟8后,加入步驟7得到的初始病毒液,病毒液的體積為細(xì)胞培養(yǎng)液的體積的50 %，在37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4天(培養(yǎng)2-3天即可看到明顯的細(xì)胞裂解或CPE現(xiàn)象)，然后收集上清液。
[0068]10、將15% CsCl和40% CsCl加入Beckman離心管中制備CsCl梯度溶液。
[0069] 11、將步驟9得到的上清液滴加于步驟10得到的CsCl梯度溶液上，4°C、30000rpm離心16小時，離心管中的體系顯示兩條帶(處于上層的為腺病毒空殼，處于下層的為活病毒顆粒)，收集下層部分，在TBS緩沖液中透析一小時，然后在含有10%甘油的TBS緩沖液中透析兩次，得到含有CAS9重組腺病毒的病毒液，簡稱CAS9病毒液(CAS9病毒液中的病毒含量為 10X10lclpfu/ml)。
[0070]六、制備對照病毒液
[0071 ] 用靶向GFP基因的兩個gRNA代替gRNAl和gRNA2，進(jìn)行步驟二和三，得到sgRNA病毒液的對照病毒液，簡稱對照病毒液。
[0072]實(shí)施例2、體外活性檢測
[0073]1、用DMEM培養(yǎng)基懸浮AML12細(xì)胞，得到細(xì)胞濃度為5X 15個/ml的細(xì)胞懸液。
[0074]2、分組處理
[0075]實(shí)驗(yàn)組:將Iml步驟I得到的細(xì)胞懸液、Iml實(shí)施例1的步驟三得到的sgRNA病毒液、0.1ml實(shí)施例1的步驟五得到的CAS9病毒液混合，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h ；
[0076]對照組:將Iml步驟I得到的細(xì)胞懸液、Iml實(shí)施例1的步驟六得到的對照病毒液、
0.1ml實(shí)施例1的步驟五得到的CAS9病毒液混合，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h。
[0077]3、完成步驟2后，取細(xì)胞，提取基因組DNA，采用Fl和Rl組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)+?
日O
[0078]Fl: 5，-ATTCGCGACCCGAAGCTGCG-3，；
[0079]Rl: 5，-TGTTCTTGTCCACCGACTTCTTGGCT-3，。
[0080]4、取步驟3得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行T7E1酶切(設(shè)置不進(jìn)行T7E1酶切的對照處理)，然后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。對照組進(jìn)行T7E1酶切的處理、實(shí)驗(yàn)組不進(jìn)行T7E1酶切的對照處理，條帶單一。實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行T7E1剪切后，出現(xiàn)彌散條帶，即在sgRNA和CAS9蛋白的作用下，CEBPA蛋白的編碼基因發(fā)生了剪切并產(chǎn)生了錯配的雜合雙鏈，從而可以被T7E1酶切。
[0081 ] 實(shí)施例3、體內(nèi)活性檢測
[0082]1、分組處理
[0083]實(shí)驗(yàn)組:取4只C57小鼠，每只尾靜脈注射0.1ml實(shí)施例1的步驟三得到的sgRNA病毒液和0.1ml實(shí)施例1的步驟五得到的CAS9病毒液；
[0084]對照組:取I只C57小鼠，每只尾靜脈注射0.1ml實(shí)施例1的步驟六得到的對照病毒液和0.1ml實(shí)施例1的步驟五得到的CAS9病毒液。
[0085]2、注射病毒液7天后，取小鼠的肝臟。
[0086]3、取步驟2得到的肝臟，提取基因組DNA，采用Fl和Rl組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行T7E1酶切(設(shè)置不進(jìn)行T7E1酶切的對照處理)，然后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2。對照組進(jìn)行T7E1酶切的處理、實(shí)驗(yàn)組不進(jìn)行T7E1酶切的對照處理，條帶單一。實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行T7E1剪切后，出現(xiàn)彌散條帶，即在sgRNA和CAS9蛋白的作用下，CEBPA蛋白的編碼基因發(fā)生了剪切并產(chǎn)生了錯配的雜合雙鏈，從而可以被T7E1酶切。將目的片段測序，結(jié)果表明，剪輯比例高達(dá)70%以上，
[0087]4、取步驟2得到的肝臟，提取總蛋白，進(jìn)行Western檢測，采用的一抗為CEBPa抗體(14AA)(購自Santa Cruz B1technology,目錄號:sc_61)。結(jié)果見圖3,實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟中的CEBPA蛋白含量顯著低于對照組小鼠，即在sgRNA和CAS9蛋白的作用下，CEBPA蛋白的編碼基因發(fā)生了剪切，從而CEBPA蛋白含量顯著降低。
【權(quán)利要求】
1.攜帶Cas9蛋白的編碼基因的重組腺病毒；所述Cas9蛋白如序列表的序列7所示。
2.如權(quán)利要求1所述的重組腺病毒，其特征在于:所述Cas9蛋白的編碼基因如序列表的序列6自5’末端第789-5045位核苷酸所不。
3.如權(quán)利要求1或所述的重組腺病毒，其特征在于:其制備方法包括如下步驟: (1)將所述Cas9蛋白的編碼基因插入pDONR?221載體的attLl和attL2位點(diǎn)之間，得到中間質(zhì)粒； (2)將中間質(zhì)粒與pAD-DEST載體發(fā)生gateway反應(yīng)，得到含有所述CAS9蛋白的編碼基因的重組質(zhì)粒，即為重組質(zhì)粒PAD-DEST-CAS9 ； (3)將重組質(zhì)粒pAD-DEST-CAS9導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞并培養(yǎng)，得到所述重組腺病毒。
4.如權(quán)利要求3所述的重組腺病毒，其特征在于:所述哺乳動物細(xì)胞為293細(xì)胞。
5.—種重組質(zhì)粒，其制備方法如下: (1)將所述Cas9蛋白的編碼基因插入pDONR?221載體的attLl和attL2位點(diǎn)之間，得到中間質(zhì)粒； (2)將中間質(zhì)粒與p AD-DEST載體發(fā)生gateway反應(yīng)，得到含有所述CAS9蛋白的編碼基因的重組質(zhì)粒。
6.權(quán)利要求1至4中任一所述的重組腺病毒在制備用于敲除目的基因的試劑盒中的應(yīng)用。
7.一種用于敲除目的基因的試劑盒，包括權(quán)利要求1至4中任一所述的重組腺病毒。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括攜帶所述目的基因的sgRNA的編碼基因的重組慢病毒。
9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括攜帶所述目的基因的sgRNA的編碼基因的重組質(zhì)粒。
10.如權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于:所述目的基因?yàn)镃CAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-A。
【文檔編號】C12N15/861GK104178461SQ201410400098
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月14日
【發(fā)明者】張普民, 程然然, 彭瑾, 閆永紅, 卞廣興 申請人:北京蛋白質(zhì)組研究中心