一種microRNA比色傳感器的制備與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種基于功能核酸的microRNA(miRNA)比色傳感器，該傳感器通過(guò)引入分子信標(biāo)以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶miRNA的高特異性的識(shí)別，通過(guò)鏈替代聚合反應(yīng)（SDA）、nicking trigger引發(fā)的滾環(huán)擴(kuò)增，及DNAzyme信號(hào)放大等生物放大策略實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量miRNA高靈敏的檢測(cè)。應(yīng)用本發(fā)明的傳感器對(duì)miRNA進(jìn)行檢測(cè)，miRNA的濃度在10aM-1nM范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程式為Y=0.5929+0.02916LogX，相關(guān)系數(shù)為0.994，最低檢測(cè)限為5aM。與現(xiàn)有技術(shù)比較，所述傳感器靈敏度高、特異性好、成本低、操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)周期短，適用于實(shí)際樣品的測(cè)定。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種microRNA比色傳感器的制備與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種比色傳感器的制備與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] microRNA (miRNA)是一類(lèi)新型的腫瘤標(biāo)志物，由含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體經(jīng)Dicer 酶加工而成的一類(lèi)高度保守的非編碼單鏈小RNA分子（約19-23個(gè)核苷酸），其表達(dá)具有 時(shí)序性和組織特異性，通過(guò)降解mRNA或抑制蛋白的翻譯來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞生 長(zhǎng)、增殖、凋亡、應(yīng)激及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。miRNA在細(xì)胞、組織、血清及體液 中均可檢測(cè)到，其通過(guò)激活癌基因或沉默抑癌基因誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，在腫瘤組織中miRNA 表現(xiàn)與正常組織含量完全不同的異常表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)80%以上的腫瘤組織中miRNA-126、 miRNA-143及miRNA-145明顯表達(dá)下調(diào)，相反另一些miRNA如miRNA-21則明顯表達(dá)上調(diào)， 提示某些特異性miRNAs的異常表達(dá)通常對(duì)一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的提示意義，如 miRNA-21是血清中最早發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)miRNA，其在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者血清中高表達(dá)， 而另一些 miRNA (如循環(huán)外泌體 miRNA21、miRNA144、miRNA200a、miRNA200b、miRNAc 等） 的異常表達(dá)或表達(dá)量的調(diào)整同樣見(jiàn)于卵巢癌患者，胃癌患者中miR-20b、miR-20a、miR-17、 miR-21等表達(dá)上升，乳腺癌中miRNA-21、miRNA-195及miRNA-155表達(dá)上升。與mRNA相 t匕，miRNA體內(nèi)代謝周期長(zhǎng)，含量?jī)H占總mRNA的約0. 01%，單個(gè)細(xì)胞中的平均拷貝數(shù)約為 500,不同類(lèi)型miRNA量的差異范圍達(dá)到數(shù)量級(jí)，其在組織、血液和體液中能抵抗內(nèi)源性RNA 酶的降解，在極端環(huán)境中（如冷凍、培化和強(qiáng)酸強(qiáng)堿）也能保持穩(wěn)定。研究證明將患者血清 中異常表達(dá)的miRNA與其他常見(jiàn)腫瘤標(biāo)志物（如CA125)聯(lián)合檢測(cè)有助于提高卵巢癌的早 起診斷敏感性或特異性進(jìn)而提高早期診斷率。因此，miRNA作為一種新型腫瘤標(biāo)志物在分 子水平上對(duì)腫瘤的早期篩查、早期診斷、臨床治療及預(yù)后起著至關(guān)重要的作用。miRNA對(duì)臨 床腫瘤的早期檢測(cè)及診療監(jiān)測(cè)具有重要意義，但由于miRNA具有痕量、序列短及序列相似 性高的特點(diǎn)，這對(duì)其檢測(cè)方法應(yīng)用于實(shí)際臨床實(shí)踐的靈敏度和特異性提出了很高的要求， 傳統(tǒng)的常規(guī)檢測(cè)方法通常不能滿(mǎn)足臨床工作對(duì)腫瘤早期、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的實(shí)際需要。近年 來(lái)，隨著對(duì)miRNA功能研究的不斷深入，miRNA的檢測(cè)與生物分析方法已不斷發(fā)展為分子生 物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的重要研究領(lǐng)域。傳統(tǒng)的miRNA檢測(cè)方法主要有Northern印跡、微陣列 雜交、RT-PCR等，但各種方法互有優(yōu)劣，目前尚缺乏簡(jiǎn)便、快速、高靈敏、高特異的檢測(cè)方法。 Northern印跡是最早用于各種miRNA分析的技術(shù)，被認(rèn)為是miRNA研究分析的金標(biāo)準(zhǔn)，該 方法由于檢測(cè)步驟復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、通量低、靈敏度低且需對(duì)大量的樣品進(jìn)行檢測(cè)，不適于對(duì) 日常miRNA進(jìn)行分析。微陣列技術(shù)具有高通量檢測(cè)能力并能對(duì)多種miRNA進(jìn)行分析，然序 列短及序列相似性高的miRNA具有交叉雜交的可能性，導(dǎo)致該方法的靈敏度及特異性均降 低，因而只適于一般的篩查分析，而不適于精確定量分析。qRT-PCR的方法因其高度的特異 性和靈敏度而被廣泛用于miRNA的檢測(cè)，但操作過(guò)程需要逆轉(zhuǎn)錄步驟和溫度循環(huán)，且需設(shè) 計(jì)引物及昂貴儀器，從而限制了該方法的使用。
[0003] 因此，為適應(yīng)臨床診斷治療，特別是個(gè)體化診斷治療的需求，現(xiàn)有技術(shù)旨在建立一 種比色傳感器用于miRNA的快速、靈敏、特異檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的第一方面提供一種檢測(cè)miRNA的比色傳 感器，包括擴(kuò)增反應(yīng)體系和催化反應(yīng)體系，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系包括針對(duì)miRNA的莖環(huán)模板、 啞鈴狀滾環(huán)模板、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、dNTP、緩沖體系。
[0005] 優(yōu)選地，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系中，所述莖環(huán)模板是由分子信標(biāo)MB和功能核酸⑶NA雜 交獲得的MB/⑶NA。
[0006] 優(yōu)選地，所述分子信標(biāo)MB包括3個(gè)DNA片段，片段I為特異性識(shí)別miRNA的莖環(huán) 部分，片段II為與功能核酸GDNA互補(bǔ)的部分，片段III的互補(bǔ)序列與啞鈴狀滾環(huán)模板部分互 補(bǔ)。
[0007] 優(yōu)選地,所述分子信標(biāo)MB的序列如SEQ ID NO. 1所示,具體為：
[0008] 5，-GTCAGATGAATTCGTGTGAGAGCACCTCAGCCCGCCCAACGCGCGTCAACATCAGTCTGATAAGCT AGACGCGCG-3,。
[0009] 更優(yōu)選地，所述分子信標(biāo)MB的序列，具體為：
[0010] 5，-GTCAGATGAATTCGTGTGAGAGCACCTCAGCCCGCCCAACGCGCGTCAACATCAGTCTGATAAGCT AGACGCGCG 6C SPACER-3'。該序列可以防止非特異性擴(kuò)增。
[0011] 優(yōu)選地，所述G-DNA的序列如SEQ ID NO. 2所示，具體為：
[0012] 5' -GGGTTGGGCGGGTTGGG-3'
[0013] 更優(yōu)選地，所述G-DNA的序列，具體為：
[0014] 5'-GGGTTGGGCGGGTTGGG 6C SPACER-3'。該序列可以防止非特異性擴(kuò)增。
[0015] 優(yōu)選地，所述分子信標(biāo)MB和功能核酸⑶NA的摩爾比例為I : 1?1. 6:1，更優(yōu)選為 1. 2:1，在該比例下背景信號(hào)最小。
[0016] 優(yōu)選地，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系中，所述莖環(huán)模板的終濃度為0. 1?5μΜ，更優(yōu)選為 1 μ Mo
[0017] 本發(fā)明的傳感器通過(guò)引入所述莖環(huán)模板，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)靶miRNA的高特異性的識(shí) 別。
[0018] 優(yōu)選地，所述啞鈴狀滾環(huán)模板的序列如SEQ ID NO. 3,具體為：
[0019] 5，-GTGAGAGCCCAACCCGCCCTACCCTAGACCTCAGCTCTCACACGAATTCCCGTCAGATGAATTCG T-3，。
[0020] 優(yōu)選地，所述啞鈴狀滾環(huán)模板為5'端磷酸化的模板。
[0021] 優(yōu)選地，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系中，啞鈴狀滾環(huán)模板的終濃度為IOOng/ μ L?600ng/ μ L，更優(yōu)選為500ng/y L。
[0022] 所述啞鈴狀滾環(huán)模板通過(guò)自身互補(bǔ)鏈接3'端和5'端，簡(jiǎn)化了常規(guī)線(xiàn)性滾環(huán)模板 的反應(yīng)所需的步驟。
[0023] 本發(fā)明的傳感器，引入莖環(huán)模板和啞鈴狀滾環(huán)模板，通過(guò)鏈替代聚合反應(yīng)（SDA)、 nicking trigger引發(fā)的滾環(huán)擴(kuò)增的生物放大策略，可實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量miRNA的高靈敏的檢測(cè)。
[0024] 進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系中，所述具有鏈置換活性的DNA聚合酶是Phi29 DNA Polymerase ;所述限制性核酸內(nèi)切酶是Nb. BbvCI。
[0025] 優(yōu)選地，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系中，Phi29 DNA Polymerase的終濃度為0· 1?0· 2U/ μ L，更優(yōu)選為0· 2υ/μ L。
[0026] 優(yōu)選地，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系中，Nb. BbvCI的終濃度為0. 05?0. 25U/ μ L，更優(yōu)選為 I. 5U/y L0
[0027] 進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系中，緩沖體系選自Phi29DNA Polymerase Buffer和 Cutsmart buffer。
[0028] 優(yōu)選地，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系還包括BSA和RNase。
[0029] 擴(kuò)增反應(yīng)體系中，dNTP、BSA、Phi29DNA Polymerase Buffer、Cutsmart buffer、 RNase均為常見(jiàn)組分，其含量亦為常規(guī)。一般而言，dNTP含量為IOmM,使用終濃度為200 μ M， RNase 終濃度含量為 lU/ul，BSA、Phi29DNA Polymerase Buffer、Cutsmart buffer 則稀釋 為IX左右即可。
[0030] Phi29DNA Polymerase> Nb. BbvCI> dNTP> BSA> Phi29DNA Polymerase Buffer> Cutsmart buffer、均可經(jīng)市售途徑購(gòu)買(mǎi)獲得，市售染料會(huì)有不同的濃縮倍數(shù)（如20X， 50X)，在配置擴(kuò)增反應(yīng)體系時(shí)，一般作適當(dāng)?shù)南♂尲纯伞?br> [0031] 優(yōu)選地，擴(kuò)增反應(yīng)在 I X Phi29DNA Polymerase Buffer 和 I X Cutsmart buffer 混 合液中進(jìn)行，每100 μ L擴(kuò)增反應(yīng)體系中包含如下成分，其終濃度分別為：

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)miRNA的比色傳感器，包括擴(kuò)增反應(yīng)體系和催化反應(yīng)體系，所述擴(kuò)增反應(yīng) 體系中包括針對(duì)miRNA的莖環(huán)模板、啞鈴狀滾環(huán)模板、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、限制 性核酸內(nèi)切酶、dNTP、緩沖體系。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的比色傳感器，其特征在于，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系中，所述莖環(huán)模 板是由分子信標(biāo)MB和功能核酸GDNA雜交獲得的MB/GDNA，所述分子信標(biāo)MB的序列如SEQ ID NO. 1所示，所述功能核酸⑶NA的序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的比色傳感器，其特征在于，所述分子信標(biāo)MB和功能核酸GDNA 的摩爾比例為1:1?1. 6:1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的比色傳感器，其特征在于，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系中，所述莖環(huán)模 板的終濃度為〇. 1?5 y M。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的比色傳感器，其特征在于，所述啞鈴狀滾環(huán)模板的序列如SEQ ID NO. 3。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的比色傳感器，其特征在于，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系中，啞鈴狀滾環(huán) 模板的終濃度為l〇〇ng/ ii L?600ng/ y L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的比色傳感器，其特征在于，所述擴(kuò)增反應(yīng)體系中，所述具有鏈 置換活性的DNA聚合酶是Phi29DNA Polymerase ;所述限制性核酸內(nèi)切酶是Nb.BbvCI ;所述 緩沖體系選自 Phi29DNA Polymerase Buffer 和 Cutsmart buffer。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的比色傳感器，其特征在于，所述催化反應(yīng)體系包括Hemin、 ABTS2-和 H202。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104404140SQ201410629839
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】丁世家, 李丹丹, 程偉, 顏玉蓉, 袁泰先, 張曄, 李勝?gòu)?qiáng), 丁小娟, 袁睿, 吳茳鈴 申請(qǐng)人:重慶醫(yī)科大學(xué)