一種適用于檢測蘿卜葉緣裂刻性狀的分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于蔬菜分子標(biāo)記制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種適用于檢測蘿卜葉緣裂刻性狀的分子標(biāo)記及應(yīng)用。本發(fā)明通過選擇合適的親本雜交得到F1植株，播種該F1種子，將F1植株套袋自交和回交得到F2及BC1分離群體，通過構(gòu)建蘿卜葉淺裂基因池和葉全裂基因池、設(shè)計(jì)特異引物、PCR以及回收、克隆、測序等步驟，篩選得到與蘿卜葉緣缺裂基因緊密連鎖的分子標(biāo)記HY-18，該分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。本發(fā)明還公開了該分子標(biāo)記的制備方法。本發(fā)明制備的分子標(biāo)記可用于蘿卜葉缺裂群體分析，為蘿卜分子育種提了實(shí)用標(biāo)記和方法。
【專利說明】-種適用于檢測蘿卜葉緣裂刻性狀的分子標(biāo)記及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蔬菜分子標(biāo)記制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種適用于檢測蘿卜葉緣裂刻 性狀的分子標(biāo)記及應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記可以作為蘿卜葉緣裂刻性狀育種的標(biāo)記，為培育 遺傳穩(wěn)定的葉緣裂刻蘿卜新品種提供分子標(biāo)記。

【背景技術(shù)】
[0002] 葉片是植物進(jìn)行光合作用、呼吸作用和蒸騰作用的主要器官，影響植物的光合效 率、產(chǎn)量及其品質(zhì)等。植物葉片形態(tài)由葉形、葉尖、葉基及葉緣等幾個(gè)部分組成，其中葉緣具 有全緣、鋸齒、裂刻、波浪等形狀。葉緣的適度裂刻可改變植株的株型，提高群體的通風(fēng)性、 透光性及整個(gè)植株的光能利用率，同時(shí)在一定程度上抑制病蟲害的發(fā)生，并且有利于植物 對高溫、干旱等逆境的適應(yīng)性。
[0003] 蘿卜（Raphanus sativus L.)為十字花科蘿卜屬一、二年生草本植物，是重要的蔬 菜作物。傳統(tǒng)的蘿卜葉形主要分為全緣葉和羽狀裂葉，而葉緣裂刻全裂的蘿卜葉形是蘿卜 種質(zhì)資源多樣性的表現(xiàn)，由于全裂葉對全緣葉的為顯性表現(xiàn)，其可以作為蘿卜雜交育種中 假雜種篩選的輔助性狀進(jìn)行利用。與傳統(tǒng)表型選擇相比，可在植物生長的任何時(shí)期，不受環(huán) 境條件的影響，并且可以排除等位基因互作而造成的干擾，具有快速、經(jīng)濟(jì)，高效，準(zhǔn)確等優(yōu) 點(diǎn)。在蘿卜葉緣全裂育種過程中，將分子標(biāo)記技術(shù)和回交育種相結(jié)合是一種全新的蘿卜育 種途徑，可以借助分子標(biāo)記對葉緣全裂性狀的基因型進(jìn)行直接而快速地前景選擇，排除環(huán) 境和外界因素的影響。同時(shí)對背景進(jìn)行選擇，加快遺傳背景恢復(fù)速度，縮短育種年限和減輕 連鎖累贅。
[0004] 植物葉緣裂刻目的性狀的定位方面，主要集中在擬南芥和番茄等植物上，而對蕓 薹屬植物中葉緣裂刻性狀的研究還較少?；蓰渹b等（惠麥俠等.白菜葉緣裂刻近等基因 系的CDNA-AFLP分析及SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010,43(21) :4447-4454)利用 cDNA-ALP技術(shù)，開發(fā)了一條與裂刻緊密連鎖的SCAR標(biāo)記用于裂葉純合和雜合的分子輔助 選擇。鄧杰等（鄧杰等.控制大白菜和白菜型油菜葉緣裂刻的QTL定位及分析.園藝學(xué) 報(bào)，2012.，39 (4) : 661-668)通過構(gòu)建白葉緣裂刻BC2DH群體，在A03和AlO上各存在一個(gè) 與白菜葉緣裂刻相關(guān)的QTL。然而目前關(guān)于蘿卜葉緣裂刻的分子標(biāo)記尚未見報(bào)道，目前也沒 有利用分子標(biāo)記輔助選擇對蘿卜葉緣裂刻的育種選擇也未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于獲得一種適用于檢測蘿卜葉緣裂刻性狀的分子標(biāo)記。所述的分 子標(biāo)記可以作為蘿卜葉緣裂刻育種標(biāo)記，為培育遺傳穩(wěn)定的葉緣裂刻蘿卜新品種提供分子 記。
[0006] 本發(fā)明利用分子標(biāo)記與集團(tuán)混合法（BSA)相結(jié)合，尋找葉緣裂刻蘿卜的AFLP標(biāo) 記，并將其轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的顯性SCAR標(biāo)記，為蘿卜葉緣裂刻性狀的篩選提供一種簡單、快 速和有效的輔助選育方法。
[0007] 本發(fā)明通過以下方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] 申請人:通過試驗(yàn)獲得一種適用于檢測蘿卜葉緣裂刻性狀的SCAR分子標(biāo)記，它的 核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示。
[0009] 申請人:提供了一種制備蘿卜葉緣裂刻性狀檢測的SCAR分子標(biāo)記的方法，其按照 以下步驟：
[0010] DF2分離群體的獲得：以葉緣淺裂蘿卜"武青一號"為母本（購自武漢市武蔬種 業(yè)），以葉緣全裂蘿卜"新洲花葉"（購自武漢市新洲區(qū)惠農(nóng)種子批發(fā)部）為父本，進(jìn)行雜交 得到F1，將F1植株套袋自交、回交，得到F2和BC1分離群體；
[0011] 2)構(gòu)建F2分離群體的基因池：
[0012] 米用集團(tuán)混合法（bulked segregation analysis,簡稱BSA，參見文獻(xiàn)Michelmore R W等，Identification of markers linked to disease resistance gene by bulked segr egant analysis:a rapid method to detect markers in specific genomic regions usi ng segregating population, Pro. Natl. Acad. Sci. , USA, 88:9829-9832)，構(gòu)建葉淺裂 DNA 池和葉全裂DNA池兩個(gè)基因池；
[0013] 3)將兩親本間有差異的引物對，對上述步驟2)構(gòu)建的兩個(gè)基因池進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 選擇在兩個(gè)基因池中表現(xiàn)有差異的引物組合EA1/MC8、EA3/MC4、EA4/MC4進(jìn)一步對基因池 間各單株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測，確定篩選出的引物組合EA1/MC8為葉緣 裂刻性狀的連鎖標(biāo)記，再對F 2分離群體的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測；
[0014] 其中：
[0015] 兩親本間有差異的引物對的DNA序列如下所示：
[0016] EAl: 5，-GAC TGC GTA CCAATT CAAA-35 MC8; Si-GAT GAG TCC TOA GTAACT 0-35 ；
[0017]

【權(quán)利要求】
1. 一種適用于檢測蘿卜葉緣裂刻性狀的分子標(biāo)記，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。
2. -種擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記的引物對，其DNA序列如下所示： 正向引物 5 ' -ACTGGTTATCTTGTGGTGATGGAAAC-3 '， 反向引物 5' -AAGTCGGTTTGGATAAGCATAGGGGG-3'。
3. -種制備檢測蘿卜葉緣裂刻性狀的分子標(biāo)記的方法，其特征在于下列步驟： 1) 以蘿卜"武青一號"為母本，以蘿卜"新洲花葉"為父本進(jìn)行雜交得到雜種F1，將所得 的F1植株套袋自交、回交，得到F 2和BC1分離群體； 2) 采用集體混合法構(gòu)建蘿卜葉淺裂DNA池和葉全裂DNA池； 3) 將兩親本間有差異的引物對，對上述步驟2)構(gòu)建的兩個(gè)基因池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇 在兩個(gè)基因池中表現(xiàn)有差異的引物組合EA1/MC8、EA3/MC4、EA4/MC4進(jìn)一步對基因池間各 單株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測，確定篩選出的引物組合EA1/MC8為葉緣裂刻 性狀的連鎖標(biāo)記，再對F 2分離群體的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測； 其中： 兩親本間有差異的引物對的DNA序列如下所示： EAl :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CM A-3' MC8 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT G-3'； EA2 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CM T-3' MG7 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA AGT 03'； EA2 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAA T-3' MC6 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT T_3'； EA2 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAA T-3' MC7 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACTC-3'； EA3 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAA C-3' MC3 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA 03'； EA3 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CM C-3' MC2 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA T_3' ； EA3 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAA C-3' MC4 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA G_3'； EA3 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CM C-3' MC6 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT T_3'； EA3 :5' -GAC TGC GTA CCA ATT CM C-3' MC12 :5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACC G_3'； EA3 :5' -GAC TGC GTA CCA ATT CM C-3' MC14 :5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACG T_3'； EA4 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CM G-3' MCI :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA A_3' EA4 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CM G-3' MC2 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA T_3'； EA4 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAA G-3' MC4 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACA G_3'； EA4 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CM G-3' MC5 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT A_3' ； EA4 :5, -GAC TGC GTA CCA ATT CM G-3， MCll :5, -GAT GAG TOC TGA GTA ACC 03,； EA4 :5' -GAC TGC GTA CCA ATT CM G-3' MC16 :5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACG G_3'； EA5 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT A-3' MC6 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT T_3'； EA5 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT A-3' MC7 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT 03'； EA5 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT A-3' MC8 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT G_3'； EA5 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT A-3' MG16 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA AGG G_3'； EA6 :5' -GAC TGC GTA CCA ATT CAT T-3' MC14 :5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACG T_3'； EA6 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT T-3' MC15 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACG 03'； EA6 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT T-3' MG8 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA AGT G_3'； EA6 :5, -GAC TGC GTA CCA ATT CAT T-3， MG13 :5, -GAT GAG TCC TGA GTA AGG T_3,； EA7 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT C-3' MG13 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA AGG T_3'； EA7 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT C-3' MG15 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA AGG 03'； EA8 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT G-3' MC7 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT C_3'； EA8 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAT G-3' MG9 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA AGC A_3'； EAll:5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAC C-3' MC6 :5'-GAT GAG TCC TGA GTA ACT T_3'； EA14 :5'-GAC TGC GTA CCA ATT CAG T-3' MG16 :5'_GAT GAG TCC TGA GTA AGG G. -3' 4) 將步驟3)篩選得到的與蘿卜葉緣缺刻性狀緊密連鎖的AFLP標(biāo)記引物組合EA1/MC8 的片段進(jìn)行回收、克隆、測序，所得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所 示； 其中：EA1/MC8引物組合的序列如下： EAl :5' -GAC TGC GTA CCA ATT CAA A-3'， MC8 :5' -GAT GAG TCC TGA GTA ACT G-3'。 5) 通過對步驟4)測序結(jié)果進(jìn)行特異引物的設(shè)計(jì)，將篩選得到的與蘿卜葉緣缺刻性狀 緊密連鎖的AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記引物，該SCAR標(biāo)記引物的DNA序列如下所示； 正向引物 5 ' -ACTGGTTATCTTGTGGTGATGGAAAC-3 '， 反向引物 5' -AAGTCGGTTTGGATAAGCATAGGGGG-3'。
4. 權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在輔助選擇蘿卜葉緣裂刻性狀中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求2所述的引物對在輔助選擇蘿卜葉緣裂刻性狀中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/10GK104313149SQ201410566923
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】熊秋芳, 張雪麗, 張小康, 張雪清, 徐長城 申請人:武漢市蔬菜科學(xué)研究所