一種嗜壓菌處理深海溢油的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用嗜壓菌處理深海溢油的方法。具體包括采用內(nèi)壓為0.3-0.4MPa的壓力裝置梯度篩選馴化石油降解嗜壓菌，以多孔氧化鋯作為嗜壓菌載體進(jìn)行不同濃度的原油降解效果測(cè)試。本發(fā)明針對(duì)深海高壓、洋流復(fù)雜等環(huán)境，以海上溢油區(qū)域底泥中的土著菌為菌源，利用特制的加壓裝置并以梯度濃度原油為唯一碳源對(duì)土著菌進(jìn)行馴化和篩選，得到了可在0.3-0.4MPa下降解原油的嗜壓菌。以篩選出來(lái)的嗜壓菌為研究對(duì)象，進(jìn)行了0.3-0.4MPa下的以原油為唯一碳源，原油濃度分別為1g/L、3g/L和5g/L的降解實(shí)驗(yàn)，在連續(xù)測(cè)定30天時(shí)，降解率分別達(dá)到86.9％、68.3％；和49.1％，可知本發(fā)明所篩選馴化的嗜壓菌在0.3-0.4MPa的高壓下對(duì)原油具有較好的降解效率，本發(fā)明為深海溢油的生物修復(fù)提供了一條新途徑。
【專利說(shuō)明】一種嗜壓菌處理深海溢油的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于深海溢油處理【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種處理深海溢油嗜壓菌的篩選、 載菌與修復(fù)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著世界對(duì)石油及其制品需求的日益增長(zhǎng)，在海上開(kāi)采、運(yùn)輸、裝卸以及利用石油 過(guò)程中的溢油事故也日益增多，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。以渤海灣為例渤海海域是我國(guó)唯 一半封閉型內(nèi)海，面積77284平方公里，具有獨(dú)特的資源優(yōu)勢(shì)和地緣優(yōu)勢(shì)，是環(huán)渤海經(jīng)濟(jì)圈 的重要支持系統(tǒng)。環(huán)渤海地區(qū)包括山東、河北、遼寧、天津三省一市。近十幾年來(lái)，環(huán)渤海 地區(qū)海洋經(jīng)濟(jì)一直以10%以上的速度保持著高速增長(zhǎng)，以海洋油氣業(yè)為主要海洋產(chǎn)業(yè)，其 石油探明儲(chǔ)量約占全國(guó)石油總儲(chǔ)量的26%，2009年全國(guó)海洋石油產(chǎn)量為3. 7X10Tt，其中 62. 99%產(chǎn)自渤海。海洋石油的開(kāi)發(fā)蓬勃發(fā)展，由此導(dǎo)致的跑、冒、滴、漏等溢油事故時(shí)有發(fā) 生。特別是康菲石油公司于2011年6月在渤海蓬萊19-3油田發(fā)生的，截至2011年8月13 日礦物油油基泥漿溢出總量已增加到2500桶（400立方米）。此次大規(guī)模的漏油事故造成 山東省長(zhǎng)島縣七八成扇貝死亡，養(yǎng)殖戶基本絕收，大部分養(yǎng)殖戶都因此蒙受巨額損失。雖然 像康菲石油如此大規(guī)模的漏油事故在渤海尚屬罕見(jiàn)，但是海上鉆井平臺(tái)大大小小的石油溢 漏在渤海是一種常態(tài)，對(duì)于這種溢油如不加以控制，長(zhǎng)此以往就如同埋下一顆生態(tài)炸彈治 理起來(lái)難度極大。
[0003] 海上原油泄漏等事故對(duì)我國(guó)近岸海域產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，在溢油事故處理中采取 的投加消油劑等措施將海洋表面的浮油轉(zhuǎn)移到海洋沉積物中，但這并不能徹底解決海洋溢 油對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)造成的危害。如參考文獻(xiàn)l:Benjamin J. Place, Matt J. Perkins, Ewan Sinclair 等.Trace analysis of surfactants in Corexit oil dispersant formulations and seawater.Deep-Sea Research II. 2014, 1:1-9 中詳細(xì)記錄了在 2010 年 4月墨西哥灣"深水地平線"鉆井平臺(tái)爆炸后，投加石油分散劑來(lái)處理浮油導(dǎo)致分散劑沉積 在海底沉積物中造成二次污染，海水樣品中雙（2-乙基己酯）磺基琥珀酸酯（DOSS)的濃縮 物濃度范圍從71到13000ng/L不等，對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)造成不同程度的危害。微生物降解是 去除環(huán)境中石油污染物的主要途徑，相對(duì)物理或化學(xué)方法它具有成本低、投資少、效率高的 特點(diǎn)。應(yīng)用微生物來(lái)催化降解石油烴類，減小或最終消除石油污染，正受到世界各國(guó)的普遍 重視。如參考文獻(xiàn) 2 :Roger C. Prince, Kelly M. McFarlin, Josh D. Butler 等.The primary biodegradation of dispersed crude oil in the sea. Chemosphere. 2012,4:521-526 中 提到的微生物降解是處理石油泄漏事故重要的工具，具有高效和范圍廣的特點(diǎn)。許多微生 物能以烴類為唯一碳源生長(zhǎng)，降解石油烴的微生物大量存在于受石油烴污染的水體和底部 沉積物中。
[0004] 深海石油開(kāi)采的特點(diǎn)要求其生物修復(fù)條件應(yīng)不同于近岸海域，一方面深海溢油 被消油劑沉到海底后由于海洋潮汐、波浪的影響，向溢油海域投放的高效石油降解菌劑 很難進(jìn)入并固著在沉積物中，導(dǎo)致沉積物中的微生物含量較少，削弱了微生物對(duì)沉積物 中石油經(jīng)的降解能力。如參考文獻(xiàn) 3 :J. C. Dietrich, C. J. Trahan, Μ· T. Howard. Surface trajectories of oil transport along the Northern Coastline of the Gulf of Mexico. Continental Shelf Research. 2012:17-47中描述建立溢油擴(kuò)散的計(jì)算模型時(shí)需 要考慮到潮汐，河流交換，風(fēng)向風(fēng)浪的影響，而這些因素為深海溢油的典型環(huán)境特點(diǎn)。而公 告號(hào)為CN102604924、名稱為"一種海洋石油降解菌劑及其制備"所述是將菌劑附著于一種 可漂浮的生物載體上，這種菌劑對(duì)于海洋溢油的浮油處理具有較好的降解效果，但其對(duì)于 深海沉積物中的原油的降解是不適用的。另一方面30米以下的深海海域具有高壓的特點(diǎn)， 因此要求降解菌及其載體都能夠耐受高壓環(huán)境，必須采用能夠耐受高壓的微生物來(lái)提高 對(duì)沉積物中石油經(jīng)類的降解效率。如參考文獻(xiàn)4 :Simon T. Egan, David M. McCarthy, John ff. Patching, Gerard T. A. Fleming. An investigation of the physiology and potential role of components of the deep ocean bacterial community(of the NE Atlantic)by enrichments carried out under minimal environmental change. 2012:11 - 20 中所述： 海水中深度每增加10米，液體靜壓力將隨之增加〇. IMPa。參考文獻(xiàn)5 :曹華明.極端微生 物的研究及應(yīng)用.天津農(nóng)業(yè)科學(xué).2013,19(10) :22-25中定義嗜壓菌是依賴于高壓條件才 能良好生長(zhǎng)的微生物。所以在深海中能正常發(fā)揮降解作用的微生物必須能夠承受比海水表 面高的壓力，這對(duì)于深海原油降解是必不可少的。因此，研究海洋深度在40m以下，可承受 溢油海域0. 4MPa以下的壓力而不破裂、比重大不易被海底洋流沖擊而發(fā)生遷移、無(wú)需外力 即可沉入指定地點(diǎn)的載體及及其負(fù)載的高效降油嗜壓菌菌劑，是實(shí)現(xiàn)深海溢油生物修復(fù)的 有效、有針對(duì)性的途徑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)深海高壓洋流的復(fù)雜環(huán)境，以海底土著菌為菌源，經(jīng)過(guò)一系列的篩選 得到了降解石油的嗜壓菌。以篩選出來(lái)的嗜壓菌為研究對(duì)象，進(jìn)行了一系列的降解實(shí)驗(yàn)，測(cè) 定了該嗜壓菌對(duì)原油的降解效果。
[0006] 1、本發(fā)明的嗜壓菌的篩選步驟如下
[0007] (1)取海上溢油區(qū)域海底受石油污染的沉積物作為石油降解土著菌菌源；
[0008] (2)嗜壓石油降解菌的篩選，具體步驟如下：
[0009] ①將從采樣點(diǎn)采集的沉積物2g加入盛有IOOmL無(wú)菌海水配制的LB培養(yǎng)基的錐形 瓶中，將其置于圖1所示〇. 3-0. 4MPa的恒溫壓裝置中培養(yǎng)，經(jīng)梯度馴化篩選得到嗜壓菌菌 液。
[0010] ②取篩選得到的嗜壓菌菌液中取出5mL，加入盛有IOOmL富集培養(yǎng)液A (75% LB培 養(yǎng)基+lg/L原油+海水定容至IOOmL)中，28°C，置于0. 3-0. 4MPa的加壓裝置中培養(yǎng)。
[0011] ③待富集培養(yǎng)液A渾濁時(shí)，取5mL接至IOOmL富集培養(yǎng)液B (50% LB培養(yǎng)基+2g/L 原油+海水定容至IOOmL)中，28°C，置于0.3-0. 4MPa的加壓裝置中培養(yǎng)。
[0012] ④待富集培養(yǎng)液B渾濁時(shí)，取5mL接至IOOmL富集培養(yǎng)液C (25% LB培養(yǎng)基+3g/L 原油+海水定容至IOOmL)中，28°C，置于0.3-0. 4MPa的加壓裝置中培養(yǎng)。
[0013] ⑤待富集培養(yǎng)液C渾濁時(shí)，取5mL接至IOOmL富集培養(yǎng)液D (4g/L原油+海水定容 至IOOmL)中，28°C，置于0. 3-0. 4MPa的加壓裝置中培養(yǎng)，得到以石油為唯一碳源的石油烴 降解嗜壓菌，保存至20%的甘油溶液中，-20°C保藏。
[0014] (3)載體載菌，具體步驟如下：
[0015] ①取步驟二中篩選得到的石油降解嗜壓菌菌液2mL，接至IOOmLLB培養(yǎng)基中，把滅 菌的多孔氧化鋯投入，28°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)；
[0016] ②根據(jù)石油降解嗜壓菌生長(zhǎng)曲線在26小時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)氧化鋯載體載 菌過(guò)程結(jié)束，得到載菌活性最大時(shí)期的氧化鋯載體，載菌量約為I. IXlO8-L 2X108cfu/ 個(gè)。
[0017] (4):石油降解嗜壓菌對(duì)原油的降解實(shí)驗(yàn)
[0018] ①每個(gè)濃度梯度各取50ml的三角燒瓶14個(gè)，按照l(shuí)g/L，3g/L和5g/L濃度梯度分 別向無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中添加原油（原油已被消油劑溶解，消油劑用量為原油重量的25%)作 為唯一碳源，超聲使原油與無(wú)機(jī)鹽盡可能混合均勻，取不同濃度梯度的原油溶液20ml分裝 到50ml的三角燒瓶中，封口后進(jìn)行滅菌。
[0019] ②待溫度降到室溫之后，向每個(gè)實(shí)驗(yàn)三角燒瓶中各添加入1塊按照步驟三方法載 菌的多孔氧化鋯載體，三個(gè)不同濃度的對(duì)照三角燒瓶中各添加3塊已滅菌的未載菌的多孔 氧化鋯載體，置于〇. 3-0. 4MPa的加壓裝置中放入25°C人工氣候箱中進(jìn)行降解。
[0020] ③每隔5d從3個(gè)濃度梯度的實(shí)驗(yàn)三角燒瓶中每次取出兩只三角燒瓶連同燒瓶中 的多孔氧化鋯載體一起置于IOOml的離心管中，在超凈工作臺(tái)中先用石油醚沖洗每支燒瓶 上附著的原油，盡量減少原油的附著，并將洗液倒入離心管中；向各離心管中分別加入石油 醚至50ml，萃取、超聲各30min，3500r/min離心IOmin,取各實(shí)驗(yàn)離心管中的上層液體。
[0021] ④將每個(gè)濃度梯度下實(shí)驗(yàn)離心管中的上層液體置于質(zhì)量已知的恒重小試管Hi1中， 60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至石油醚完全揮發(fā)，取出小試管，室溫下稱其重量m 2 ;同樣將對(duì)照組離心管中 的上層液體置于恒重小試管Hi3中，60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至石油醚完全揮發(fā)，取出小試管，室溫下稱 量小試管的重量111 4，每個(gè)濃度梯度下的對(duì)照組有三支小試管，取3個(gè)小試管中蒸發(fā)前后重量 差的平均值，記為mQ。
[0022] 原油降解率的計(jì)算公式如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種處理深海溢油嗜壓菌的篩選方法，其特征是在于以下幾個(gè)步驟： 步驟一：土著菌菌源采集 取海上溢油區(qū)域海底受石油污染的沉積物作為石油降解土著菌菌源； 步驟二：嗜壓石油降解菌的篩選，具體步驟如下： (1)將從采樣點(diǎn)采集的沉積物2g加入盛有l(wèi)OOmL無(wú)菌海水配制的LB培養(yǎng)基（LB培養(yǎng) 基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaC15g，水lOOOmL，pH7. 0-7. 2,121°C滅菌20min)的錐形瓶中， 將其置于圖1所示〇. 3-0. 4MPa的加壓裝置中28°C培養(yǎng)，經(jīng)梯度馴化篩選得到嗜壓菌菌液。 ⑵取篩選得到的嗜壓菌菌液中取出5mL，加入盛有l(wèi)OOmL富集培養(yǎng)液A (75%LB培養(yǎng) 基+lg/L原油+海水定容至lOOmL)中，28°C，置于0. 3-0. 4MPa的加壓裝置中培養(yǎng)。 (3)待富集培養(yǎng)液A渾濁時(shí)，取5mL接至100mL富集培養(yǎng)液B (50% LB培養(yǎng)基+2g/L原 油+海水定容至l〇〇mL)中，28°C，置于0.3-0. 4MPa的加壓裝置中培養(yǎng)。 (4)待富集培養(yǎng)液B渾濁時(shí)，取5mL接至100mL富集培養(yǎng)液C(25% LB培養(yǎng)基+3g/L原 油+海水定容至l〇〇mL)中，28°C，置于0. 3-0. 4MPa的加壓裝置中培養(yǎng)。 (5) 待富集培養(yǎng)液C渾濁時(shí)，取5mL接至100mL富集培養(yǎng)液D(4g/L原油+海水定容至 100mL)中，28°C，置于0.3-0. 4MPa的加壓裝置中培養(yǎng)，得到以石油為唯一碳源的石油烴降 解嗜壓菌，保存至20%的甘油溶液中，-20°C保藏。 步驟三：載體載菌 (1)取步驟二中篩選得到的石油烴降解嗜壓菌菌液2mL，接至100mL的LB培養(yǎng)基中，把 滅菌的多孔氧化鋯投入，28°C，150rpm搖瓶培養(yǎng)； (2) 根據(jù)土著菌生長(zhǎng)曲線，石油烴降解嗜壓菌在26小時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此 時(shí)氧化鋯載體載菌過(guò)程結(jié)束，得到載菌活性最大時(shí)期的氧化鋯載體，載菌量約為 1. 1X108-1. 2X108cfu/個(gè)。 步驟四：石油降解嗜壓菌-多孔氧化鋯共載體的原油降解率測(cè)試 (1) 每個(gè)濃度梯度各取50ml的三角燒瓶14個(gè)，按照l(shuí)g/L，3g/L和5g/L濃度梯度分別 向無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中添加原油（原油已被消油劑溶解，消油劑用量為原油重量的25% )，配制 以不同原油濃度作為唯一碳源的母液，超聲使原油與無(wú)機(jī)鹽盡可能混合均勻，取不同濃度 梯度的原油溶液20ml分裝到50ml的三角燒瓶中，封口后進(jìn)行滅菌。 (2) 待溫度降到室溫之后，向每個(gè)實(shí)驗(yàn)三角燒瓶中各添加入1塊按照步驟三方法載菌 的多孔氧化鋯載體，三個(gè)不同濃度的對(duì)照三角燒瓶中各添加3塊已滅菌的未載菌的多孔氧 化鋯載體，置于〇. 3-0. 4MPa的加壓裝置中放入25°C人工氣候箱中進(jìn)行降解。 (3) 每隔5d從3個(gè)濃度梯度的實(shí)驗(yàn)三角燒瓶中每次取出兩只三角燒瓶連同燒瓶中的多 孔氧化鋯載體一起置于l〇〇ml的離心管中，在超凈工作臺(tái)中先用石油醚沖洗每支燒瓶上附 著的原油，盡量減少原油的附著，并將洗液倒入離心管中；向各離心管中分別加入石油醚至 50ml，萃取、超聲各30min，3500r/min離心10min，取各實(shí)驗(yàn)離心管中的上層液體。 (4) 將每個(gè)濃度梯度下實(shí)驗(yàn)離心管中的上層液體置于質(zhì)量已知的恒重小試管％中， 60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至石油醚完全揮發(fā)，取出小試管，室溫下稱其重量m2 ;同樣將對(duì)照組離心管中 的上層液體置于恒重小試管m3中，60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至石油醚完全揮發(fā)，取出小試管，室溫下稱 量小試管的重量m4，每個(gè)濃度梯度下的對(duì)照組有三支小試管，取3個(gè)小試管中蒸發(fā)前后重 量差的平均值，記為mQ。 原油降解率的計(jì)算公式如下：
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種處理深海溢油嗜壓菌的篩選方法，其特征在于：富集培 養(yǎng)液A、B、C和D所含LB培養(yǎng)基的比例分別為75%、50%、25%和0,對(duì)應(yīng)的原油濃度為lg/L、 2g/L、3g/L和4g/L，其中牛LB培養(yǎng)基的配方為牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaC15g，海水lOOOmL， pH7. 0-7. 2,121°C滅菌 20min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種處理深海溢油嗜壓菌的篩選方法，其特征在于：發(fā) 明所使用的恒溫加壓裝置是自主設(shè)計(jì)的，耐壓：〇.4MPa，可顯示溫度；充氣泵，最高氣壓： 0. 8MPa〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種處理深海溢油嗜壓菌的篩選方法，其特征在于：實(shí)驗(yàn)采 用的氧化鋯載體直徑為L(zhǎng)65-1. 75cm，高為1.35-1. 45cm，孔隙率為55-65%，體積密度為 2. 35-2. 45g/cm3,孔徑分布為微米級(jí)，載菌量約為1. 1X108-1. 2X108cfu/個(gè)。
【文檔編號(hào)】C12N1/00GK104403947SQ201410566883
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】楊玉楠, 王乾 申請(qǐng)人:北京航空航天大學(xué)