益生菌中黑芥子酶活性檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種益生菌中黑芥子酶活性檢測方法。針對黑芥子酶可能是誘導(dǎo)酶的情況，使用黑芥子酶的反應(yīng)底物黑芥子硫苷酸鉀對菌體進(jìn)行誘導(dǎo)，然后再測定黑芥子酶的活力。首先使用黑芥子硫苷酸鉀代替葡萄糖進(jìn)行初篩，初步判斷菌株有無分解黑芥子硫苷酸鉀的能力。再使用黑芥子硫苷酸鉀誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生黑芥子酶，使菌體產(chǎn)生黑芥子酶的代謝通路激活，然后將完整菌體加入到一定濃度黑芥子硫苷酸鉀溶液中進(jìn)行代謝，一定時(shí)間后離心去除菌體，測定上清液在340nm處的吸光度值，發(fā)現(xiàn)此時(shí)的吸光度值與不加入菌體的相同濃度的黑芥子硫苷酸鉀溶液的吸光度值相比變化顯著。因此，誘導(dǎo)菌體法測定益生菌中黑芥子酶活性的方法可行。該方法操作簡單，檢測周期短。
【專利說明】益生菌中黑芥子酶活性檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測益生菌黑芥子酶活性的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 黑芥子酶學(xué)名為0 -硫代葡萄糖苷酶，又被稱為0 -硫代葡萄糖苷水解酶，主要在 十字花科植物中被發(fā)現(xiàn)，是迄今為止大自然中唯一發(fā)現(xiàn)的硫葡萄糖苷水解酶。黑芥子 酶有多種同工酶，分別存在于不同十字花科植物組織中。從油菜和白芥中提純的黑芥子酶 是一個(gè)二聚體蛋白質(zhì)，其分子質(zhì)量約為135kD-150kD。黑芥子酶很少以游離狀態(tài)存在，而是 與諸如黑芥子酶結(jié)合蛋白或黑芥子酶協(xié)助蛋白一類的輔酶形成蛋白質(zhì)復(fù)合體。一般情況 下，十字花科植物中的黑芥子酶會與硫甙葡萄糖苷形成相對獨(dú)立的硫甙葡萄糖苷-黑芥子 酶體系，只有在植物組織受到破壞時(shí)兩者才能相互接觸發(fā)生反應(yīng)生成有毒的硫氰酸鹽、異 硫氰酸鹽和腈，其中異硫氰酸鹽對昆蟲有較高的毒性，可對植物起到一定的保護(hù)作用。黑芥 子酶活性易受外界環(huán)境的影響，像溫度和pH都能較大的影響反應(yīng)時(shí)的酶活性。此外，抗壞 血酸、Fe2+和Cu2+也產(chǎn)生一定影響。其中，抗壞血酸表現(xiàn)為低濃度激活酶活性，高濃度抑制 酶活性。一般認(rèn)為Fe2+為酶激活劑，Cu2+為酶抑制劑。
[0003] 黑芥子酶的活性一般通過測定產(chǎn)物葡萄糖的生成量或者底物硫甙葡萄糖苷濃度 的變化來確定。對于葡萄糖的生成量，可以使用葡萄糖試劑盒來測定，這也是黑芥子酶活性 測定時(shí)的經(jīng)常使用的方法。分光光度法也是可行的，如SandroPalmieri介紹的以黑芥子硫 苷酸鉀為酶解底物進(jìn)行一系列反應(yīng)，通過在340nm處檢測NADPH生成時(shí)吸光度值的變化來 測定十字花科蔬菜中黑芥子酶活性。另外氣相色譜內(nèi)標(biāo)法、pH值法和電極法都能測定蔬菜 中黑芥子酶活力。但這些方法易受樣品中含有雜質(zhì)葡萄糖以及黑芥子酶提取不純的干擾， 抑或存在實(shí)驗(yàn)要求條件較高、實(shí)驗(yàn)操作性不強(qiáng)等問題。硫甙葡萄糖苷濃度的變化也可以采 用分光光度法測定，張蕾等以黑芥子硫苷酸鉀為底物進(jìn)行酶解，通過檢測因黑芥子硫苷酸 鉀濃度降低而引起的吸光度減少的大小來測定擬南芥中黑芥子酶活性。該方法取樣量小， 適合于批量測定，但也存在酶活力較低時(shí)難以檢測或結(jié)果不明顯等問題。此外，高效液相 色譜（HPLC)法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS)法也是常用的測定十字花科蔬菜中 黑芥子酶活性的方法。
[0004] 國外的最新研究表明，硫甙葡萄糖苷能被腸道中的微生物水解。如在小鼠試驗(yàn)中 觀察到蘿卜苷被分解成異硫氰酸鹽。研究者使蘿卜苷和萊菔硫烷無損失的進(jìn)入小鼠盲腸， 使其被水解，在腸粘膜血清中檢測出了異硫氰酸鹽。LilaElfoul等將人體腸道內(nèi)的多形擬 桿菌移植到小鼠腸道，發(fā)現(xiàn)其能夠分解黑芥子硫苷酸鉀形成異硫氰酸鹽。而在體外實(shí)驗(yàn)中， 小鼠腸道菌群也能分解蘿卜苷產(chǎn)生低濃度的異硫氰酸鹽。D.-L.Cheng等在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā) 現(xiàn)，三種雙歧桿菌：假鏈雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和長雙歧桿菌在pH=7時(shí)水解硫甙葡萄糖 苷生成異硫氰酸鹽，而在pH降到5. 2時(shí)只生成了腈。上述研究表明，多形擬桿菌及雙歧桿 菌等桿菌類益生菌多具有黑芥子酶活性。但以上研究僅僅是通過測定分解產(chǎn)物異硫氰酸鹽 的生成來證明腸道微生物具有黑芥子酶活性，并未進(jìn)一步對黑芥子酶進(jìn)行提純分析或?qū)ζ?酶活力進(jìn)行測定，且以上研究多采用質(zhì)譜法或色譜法，對實(shí)驗(yàn)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)成本要求較高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種益生菌中黑芥子酶活性檢測方法，該方法采用酶解和超 聲菌體破碎相結(jié)合的方法對菌液中的酶活性進(jìn)行靈敏檢測。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 一、將待測益生菌于無菌條件下以2%接種量接種于改良MRS液體培養(yǎng)基中，于37°C恒 溫培養(yǎng)24h，如此反復(fù)活化2-3次即可使菌株恢復(fù)活力。
[0007] 本步驟中，所述益生菌為桿菌類益生菌(乳桿菌和雙歧桿菌)。
[0008] 本步驟中，所述改良MRS液體培養(yǎng)基的配制方法如下：蛋白胨10g、牛肉浸取物 l〇g、酵母提取物5. 0g、乙酸鈉5. 0g、檸檬酸鈉2. 0g、磷酸氫二鉀2. 0g、七水硫酸鎂0. 2g、 七水硫酸錳0.05g，溶于水，然后加lml吐溫80,用水調(diào)至1000ml。
[0009] 二、初篩：用含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養(yǎng)液5mL 培養(yǎng)待篩菌株，培養(yǎng)時(shí)間48h，培養(yǎng)溫度30°C，觀察菌株生長情況，能夠正常生長的菌株用 于下一步實(shí)驗(yàn)。
[0010] 本步驟中，所述含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養(yǎng)液 的配制方法如下：無菌100mm〇l/L黑芥子硫苷酸鉀與改良MRS液體培養(yǎng)基以1:20的體積 比混合。
[0011] 三、復(fù)篩：配置葡萄糖和黑芥子硫苷酸鉀濃度均為10mm〇l/L的改良MRS培養(yǎng)液， 將待篩選菌株按常規(guī)接種量接種到該改良MRS培養(yǎng)液30°C過夜培養(yǎng)12-18h，然后離心取 菌體，加入10mLMES緩沖液沖洗菌體，再次離心后將菌體重懸于3mLMES緩沖液中，將菌 懸液與10mmol/L黑芥子硫苷酸鉀的MES緩沖液按照1-1. 5:1的體積比混合，在30°C培養(yǎng) 24-48h，最后離心取上清液在340nm處測定吸光度，篩選出吸光度值差異在0. 2以上的菌 株。
[0012] 本步驟中，所述10mm〇l/L葡萄糖、10mm〇l/L黑芥子硫苷酸鉀改良MRS的配制 方法如下：①10mm〇l/L葡萄糖改良MRS的配制：蛋白胨10g、牛肉浸取物10g、酵母提取 物5. 0g、乙酸鈉5. 0g、檸檬酸鈉2. 0g、磷酸氫二鉀2. 0g、七水硫酸鎂0. 2g、七水硫酸錳 0. 05g，1.8g葡萄糖溶于水，然后加lml吐溫80,用水調(diào)至1000ml。②10mmol/L葡萄糖改 良MRS與無菌100mm〇l/L黑芥子硫苷酸鉀以20:1的體積比混合。
[0013] 本發(fā)明針對黑芥子酶可能是誘導(dǎo)酶的情況，使用黑芥子酶的反應(yīng)底物黑芥子硫苷 酸鉀對菌體進(jìn)行誘導(dǎo)，然后再測定黑芥子酶的活力。首先使用黑芥子硫苷酸鉀代替葡萄糖 進(jìn)行初篩，初步判斷菌株有無分解黑芥子硫苷酸鉀的能力。再使用黑芥子硫苷酸鉀誘導(dǎo)菌 體產(chǎn)生黑芥子酶，使菌體產(chǎn)生黑芥子酶的代謝通路激活，然后將完整菌體加入到一定濃度 黑芥子硫苷酸鉀溶液中進(jìn)行代謝，一定時(shí)間后離心去除菌體，測定上清液在340nm處的吸 光度值，發(fā)現(xiàn)此時(shí)的吸光度值與不加入菌體的相同濃度的黑芥子硫苷酸鉀溶液的吸光度值 相比變化顯著。因此，誘導(dǎo)菌體法測定益生菌中黑芥子酶活性的方法可行。
[0014] 本發(fā)明采用黑芥子硫苷酸鉀作為特異性底物以誘發(fā)菌株分泌高活性黑芥子酶，從 而大大提高了黑芥子酶檢測的靈敏度；此外，該方法操作簡單，檢測周期短。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術(shù) 方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明 的保護(hù)范圍中。
[0016] 本發(fā)明提供了一種利用黑芥子硫苷酸鉀誘導(dǎo)菌體法測定黑芥子酶活性的方法，其 具體步驟如下： 1、溶液配制 MES緩沖液：30mmol/LMES(30mol/L2-(N-嗎啡啉）乙磺酸溶液)，6mmol/LMgCl2， 2mmo1/],Vc，NaOH調(diào)節(jié)pH=6. 5,121°C高壓蒸汽滅菌 15min。
[0017] 2、實(shí)驗(yàn)步驟 (1)菌種復(fù)蘇：本實(shí)驗(yàn)所用待測菌株為乳桿菌和雙歧桿菌，包括：嗜酸乳桿菌、保加利 亞乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、棒狀乳桿菌、副干酪乳桿菌、 雙歧桿菌。將待測菌株于無菌條件下以2%接種量接種于改良MRS液體培養(yǎng)基中，于37°C恒 溫培養(yǎng)24h。如此反復(fù)活化2-3次即可使菌株恢復(fù)活力。
[0018] (2)初篩：用含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養(yǎng)液5mL 培養(yǎng)待篩菌株，培養(yǎng)時(shí)間48h，培養(yǎng)溫度30°C。觀察菌株生長情況(用一只空白試管對照觀 察)，如其能夠正常生長，則說明該菌株很可能利用黑芥子硫苷酸鉀來產(chǎn)生能源，即該菌株 可能具有黑芥子酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：植物乳桿菌和雙歧桿菌在黑芥子硫苷酸鉀濃度為5 mmol/L，不含葡萄糖的改良MRS培養(yǎng)液中均能正常生長，故可進(jìn)行下一步復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。
[0019] (3)復(fù)篩：在有葡萄糖時(shí)，待篩菌株會以葡萄糖作為能源物質(zhì)，在葡萄糖耗盡后， 黑芥子硫苷酸鉀可誘導(dǎo)待篩菌株對其進(jìn)行分解利用以獲取能量。
[0020] 配置葡萄糖和黑芥子硫苷酸鉀濃度均為10mm〇l/L的改良MRS培養(yǎng)液，分裝成10mL 每只試管。將待篩選菌株植物乳桿菌和雙歧桿菌接種到該改良MRS培養(yǎng)液30°C過夜培養(yǎng) (12-18h)，然后離心（4°C，10min，7000g)取菌體，加入10mLMES緩沖液沖洗菌體，再次離心 (4°C，10min，7000g)后將菌體重懸于3mLMES緩沖液中，取lmL菌懸液與lmL含10mmol/L 黑芥子硫苷酸鉀的MES緩沖液混合，一共取兩只管，在30°C分別培養(yǎng)24h和48h。最后離心 (4°C，10min，10000g)取上清液在340nm處測定吸光度（用含5mmol/L黑芥子硫苷酸鉀的 MES緩沖液調(diào)零）。同時(shí)測定反應(yīng)剛開始時(shí)的吸光度值，并計(jì)算兩者之間的差值，二者差值 越大，則表明黑芥子硫苷酸鉀被分解，說明待篩菌株黑芥子酶的活性越大。待篩菌株分解黑 芥子硫苷酸鉀的吸光度值變化如表2所示。
[0021] 表2待測菌株培養(yǎng)液上清吸光度值的變化（入=340nm)

【權(quán)利要求】
1. 一種益生菌中黑芥子酶活性檢測方法，其特征在于所述方法步驟如下： 一、 將待測益生菌于無菌條件下以2%接種量接種于改良MRS液體培養(yǎng)基中，于37°C恒 溫培養(yǎng)24h，如此反復(fù)活化2-3次即可使菌株恢復(fù)活力； 二、 初篩：用含黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養(yǎng)液5mL培 養(yǎng)待篩菌株，培養(yǎng)時(shí)間48h，培養(yǎng)溫度30°C，觀察菌株生長情況，能夠正常生長的菌株用于 下一步實(shí)驗(yàn)； 三、 復(fù)篩：配置葡萄糖和黑芥子硫苷酸鉀濃度均為10mm〇l/L的改良MRS培養(yǎng)液，將待 篩選菌株按常規(guī)接種量接種到該改良MRS培養(yǎng)液30°C過夜培養(yǎng)12-18h，然后離心取菌體， 加入lOmLMES緩沖液沖洗菌體，再次離心后將菌體重懸于3mLMES緩沖液中，將菌懸液與 10mmol/L黑芥子硫苷酸鉀的MES緩沖液按照1-1. 5:1的體積比混合，在30°C培養(yǎng)24-48h， 最后離心取上清液在340nm處測定吸光度，篩選出吸光度值差異在0. 2以上的菌株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的益生菌中黑芥子酶活性檢測方法，其特征在于所述益生菌為 桿菌類益生菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的益生菌中黑芥子酶活性檢測方法，其特征在于所述改良 MRS液體培養(yǎng)基的配制方法如下：蛋白胨10g、牛肉浸取物10g、酵母提取物5. 0g、乙酸鈉 5. 〇g、檸檬酸鈉2. 0g、磷酸氫二鉀2. 0g、七水硫酸鎂0. 2g、七水硫酸錳0. 05g，溶于水，然 后加lml吐溫80,用水調(diào)至1000ml。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的益生菌中黑芥子酶活性檢測方法，其特征在于所述含 黑芥子硫苷酸鉀濃度為5mmol/L、不含葡萄糖的改良MRS培養(yǎng)液的配制方法如下：無菌 100mm〇l/L黑芥子硫苷酸鉀與改良MRS液體培養(yǎng)基以1:20的體積比混合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的益生菌中黑芥子酶活性檢測方法，其特征在于所述10mm〇l/L 葡萄糖、lOmmol/L黑芥子硫苷酸鉀改良MRS的配制方法如下：①10mm〇l/L葡萄糖改良MRS 的配制：蛋白胨l〇g、牛肉浸取物l〇g、酵母提取物5. 0g、乙酸鈉5. 0g、檸檬酸鈉 2. 0g、磷 酸氫二鉀2.0g、七水硫酸鎂0. 2g、七水硫酸錳0.05g，1.8g葡萄糖溶于水，然后加lml吐 溫80,用水調(diào)至1000ml，②10mmol/L葡萄糖改良MRS與無菌100mmol/L黑芥子硫苷酸鉀以 20:1的體積比混合。
【文檔編號】C12Q1/34GK104342482SQ201410530104
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月10日
【發(fā)明者】單毓娟, 張?zhí)m威, 李寶龍, 任明華, 宋微, 雷鵬, 何燦霞, 田思聰 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)