檢測(cè)Ppm1d基因多態(tài)突變位點(diǎn)的引物和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)癌癥患者，特別是檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤患者的 Ppm1d 基因第6號(hào)外顯子S421-S541段突變的引物和方法，其包括(i)擴(kuò)增 Ppm1d 基因第478位和525位氨基酸序列的引物；采用Sanger測(cè)序技術(shù)和測(cè)序引物。本發(fā)明可一次性快速地將癌癥患者體內(nèi) Ppm1d 基因突變熱點(diǎn)的第478位及第525位氨基酸所有的突變類(lèi)型檢測(cè)出來(lái)。利用本發(fā)明完成的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可以為放療和化療提供參考意見(jiàn)，減少病人的負(fù)擔(dān)。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)Ppmld基因多態(tài)突變位點(diǎn)的引物和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及檢測(cè)Ppmld基因多態(tài)突變熱點(diǎn)的引 物，采用普通PCR技術(shù)和Sanger測(cè)序，可用于快速檢測(cè)癌癥患者體內(nèi)Ppmld基因多態(tài)位點(diǎn) 的突變情況。

【背景技術(shù)】
[0002] Ppmld基因位于人類(lèi)第17號(hào)染色體上，總長(zhǎng)66097bp，共有6個(gè)外顯子。Ppmld基 因編碼的是一種稱為蛋白磷酸酶ID(PPMlD)的酶類(lèi)。PPMlD屬于PP2C家族，具有絲氨酸/ 蘇氨酸酶活性。PPMlD是DNA損傷應(yīng)答中的調(diào)控因子，對(duì)幾個(gè)重要的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)包括 ATM，CHK等有去磷酸化作用。因此PPMlD功能的行使對(duì)環(huán)境壓力誘導(dǎo)的凋亡起到重要的作 用。
[0003] 人的PPMlD蛋白主要有兩個(gè)主要區(qū)域：N端為高度保守的磷酸酶區(qū)，C端為無(wú)催化 區(qū)，但C端序列是蛋白質(zhì)和多肽的重要結(jié)構(gòu)與功能部位，對(duì)蛋白質(zhì)的生物功能甚至起決定 性作用。有研究報(bào)道，Ppmld的6號(hào)外顯子發(fā)生的截?cái)嗤蛔兙哂写龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。 這可能是由于6號(hào)外顯子的突變使PPMlD的C端部分缺失，從而使PPMlD蛋白的磷酸酶功 能高活性化，增強(qiáng)對(duì)DNA損傷檢驗(yàn)蛋白CHK2激活功能的抑制，阻礙癌細(xì)胞滅亡。中國(guó)每年 新增300多萬(wàn)癌癥患者，大多數(shù)采用放療和化療進(jìn)行治療，而部分患者對(duì)這種治療方案具 有抗性，這可能就與之前報(bào)道的Ppmld基因的截?cái)嗤蛔兿嚓P(guān)。當(dāng)基因發(fā)生這種突變的時(shí)候， 放療和化療不僅沒(méi)有好的治療效果，還增加病人的負(fù)擔(dān)。
[0004] 目前，發(fā)現(xiàn)的Ppmld突變中有功能性增強(qiáng)突變的多發(fā)生于PPMlD的C端，本發(fā)明中 所檢測(cè)的兩個(gè)熱點(diǎn)突變C478X(1434C>A)和E525X(1573G>T)均為6號(hào)外顯子上的截?cái)嗤?變，其中478位的突變與乳腺浸潤(rùn)性癌相關(guān)，而525位突變更是與多種癌癥相關(guān)，包括子宮 內(nèi)膜樣癌和腦膠質(zhì)瘤。
[0005] 分子檢測(cè)的樣本通常是血液樣本或用石蠟包埋的病理組織樣本。由于石蠟中的組 織經(jīng)過(guò)甲醛固定、酒精脫水等步驟后，組織中的DNA會(huì)出現(xiàn)不同程度的斷裂、降解，并且斷 裂和降解又是隨機(jī)的。因此針對(duì)石蠟包埋樣本的檢測(cè)時(shí)，引物的設(shè)計(jì)就比較重要，它會(huì)影響 石蠟組織中DNA的擴(kuò)增效果。
[0006] 目前檢測(cè)Ppmld基因突變的方法是：提取樣本中的RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄為CDNA后測(cè) 序。采用該檢測(cè)方法需進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，無(wú)法實(shí)現(xiàn)石蠟包埋樣本中的基因擴(kuò)增。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)Ppmld基因多態(tài)突變熱點(diǎn)的引物，采用PCR技術(shù)，可 用于快速檢測(cè)癌癥患者體內(nèi)Ppmld基因多態(tài)位點(diǎn)的突變情況。所述檢測(cè)Ppmld基因多態(tài)熱 點(diǎn)突變情況的引物，包括：
[0008] 擴(kuò)增Ppmld基因的引物，其喊基序列為：
[0009] PpmI d-6-1-F ：GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
[0010] PpmId-6-1-R ： GGCTGAGCACCACTACTTCG
[0011] 進(jìn)一步地，還包括測(cè)序引物，其喊基序列為：
[0012] 檢測(cè)Ppmld基因的測(cè)序引物喊基序列為：
[0013] PpmI d-6-1-F ： GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
[0014] PpmId-6-1-R ：GGCTGAGCACCACTACTTCG
[0015] 進(jìn)一步地，引物序列I Ppmld-6-l-F和Ppmld-6-l-R是擴(kuò)增Ppmld基因包含第478 位及525位氨基酸序列的引物。
[0016] 本發(fā)明還提供了檢測(cè)Ppmld基因多態(tài)熱點(diǎn)突變情況的方法，包括以下步驟：
[0017] 1.抽提血液/石蠟切片中的組織DNA ;
[0018] 2.用PCR擴(kuò)增步驟1中提取的DNA ;
[0019] 3.對(duì)步驟2中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；
[0020] 4.對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行判斷，確定Ppmld基因是否發(fā)生突變；
[0021] 其中PCR擴(kuò)增引物為：
[0022] 擴(kuò)增Ppmld基因的引物，其喊基序列為：
[0023] PpmI d-6-1-F ： GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
[0024] PpmI d-6-1-R ： GGCTGAGCACCACTACTTCG
[0025] 進(jìn)一步地，測(cè)序引物喊基序列為：
[0026] 檢測(cè)Ppmld基因的測(cè)序引物喊基序列為：
[0027] PpmI d-6-1-F ： GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
[0028] PpmI d-6-1-R ： GGCTGAGCACCACTACTTCG
[0029] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)Ppmld基因多態(tài)突變位點(diǎn)的試劑盒，包括：
[0030] ⑴組織DNA抽提試劑；
[0031] (ii)檢測(cè)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)液；
[0032] (iii)測(cè)序體系試劑；
[0033] 其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)液引物為：
[0034] ( i )擴(kuò)增Ppmld基因的引物，其喊基序列為：
[0035] PpmI d-6-1-F ： GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
[0036] PpmI d-6-1-R ： GGCTGAGCACCACTACTTCG
[0037] 進(jìn)一步地，測(cè)序引物喊基序列為：
[0038] PpmI d-6-1-F ： GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
[0039] PpmI d-6-1-R ： GGCTGAGCACCACTACTTCG
[0040] 有益效果：本發(fā)明設(shè)計(jì)了擴(kuò)增Ppmld第478位和525位氨基酸序列的引物。采用 PCR技術(shù)，構(gòu)建了穩(wěn)定的擴(kuò)增體系。通過(guò)調(diào)整引物濃度、退火溫度等反應(yīng)條件，可使擴(kuò)增效率 達(dá)到最佳。本發(fā)明利用測(cè)序技術(shù)檢測(cè)患者Ppmld突變熱點(diǎn)的方法，可以一次將Ppmld第478 位及第525位氨基酸所有的突變類(lèi)型檢測(cè)出來(lái)，相比較熒光定量PCR法降低了檢測(cè)的成本 和難度。熒光定量PCR法要針對(duì)不同的突變類(lèi)型設(shè)計(jì)2個(gè)探針，而且不能在同一管里檢測(cè)， 成本高，檢測(cè)難度大；相比較測(cè)序cDNA的方法，本發(fā)明介紹的方法無(wú)需進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明 充分考慮了石蠟包埋組織中DNA的斷裂問(wèn)題，設(shè)計(jì)出的引物其所擴(kuò)增的片段較短，提高了 石蠟包埋樣本DNA的擴(kuò)展率和檢出的準(zhǔn)確性。因此本發(fā)明不僅適用于血液樣本的Ppmld基 因突變的檢測(cè)，并且可以接受石蠟包埋樣本的檢測(cè)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖1為Ppmld基因在染色體上定位圖
[0042] 圖2為Ppmld-6-lF/R的電泳圖，M為Marker DL 2000,1-14為送檢的石蠟包埋樣 本1-14號(hào)，如圖2所示，引物Ppmld-6-lF/R擴(kuò)增有效，且條帶單一。
[0043] 圖3樣本A Ppmld第478位點(diǎn)野生型測(cè)序截圖。
[0044] 圖4樣本B Ppmld第478位點(diǎn)突變型測(cè)序截圖。
[0045] 圖5樣本C Ppmld第525位點(diǎn)野生型測(cè)序截圖。
[0046] 圖6樣本D Ppmld第525位點(diǎn)突變型測(cè)序截圖。
[0047] 圖7樣本E Ppmld第478位點(diǎn)突變型測(cè)序截圖。
[0048] 圖8樣本E Ppmld第525位點(diǎn)突變型測(cè)序截圖。
[0049] 圖9為Ppmld-6-lF/R的電泳圖，M為Marker DL 2000,1-14為送檢的血液樣本 1-14號(hào)，如圖9所示，引物Ppmld-6-lF/R擴(kuò)增有效，且條帶單一。

【具體實(shí)施方式】
[0050] 下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實(shí)施例中未說(shuō)明 的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編 的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0051] 實(shí)施例1
[0052] -種檢測(cè)Ppmld基因多態(tài)突變位點(diǎn)的引物，該引物的設(shè)計(jì)是針對(duì)Ppmld突變熱點(diǎn) 所設(shè)計(jì)的特異性擴(kuò)增引物，包括：
[0053] 擴(kuò)增Ppmld基因包含第478及525位氨基酸序列的引物，其堿基序列為：
[0054] Ppm I d-6-1-F ： GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
[0055] PpmI d-6-1-R ： GGCTGAGCACCACTACTTCG
[0056] -種檢測(cè)Ppmld基因多態(tài)突變位點(diǎn)的試劑盒，包括
[0057] ⑴組織DNA抽提試劑；
[0058] (ii)檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液；
[0059] (iii)測(cè)序體系試劑；
[0060] 其中，組織DNA抽提試劑可購(gòu)自天根DNA抽提試劑盒等商品化試劑。
[0061] 檢測(cè)體系 PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包括：2XPCR Buffer ;2mM dNTPs ;K0D FX DNA Polymer ase (IU/ μ I) ;Ppmld基因第478及525位氨基酸序列的上、下游引物Ppmld-6_1-F(10 μ M)、 P pmld-6-l-R(10yM)。
[0062] 測(cè)序體系試劑包括：測(cè)序純化液（Exol:0. 6U，CIP: I. 2U)、EDTA(125mmol)、無(wú)水乙 醇、75%乙醇、HIDI (高度去離子甲酰胺）、測(cè)序引物：檢測(cè)Ppmld基因第478位及525位氨基 酸序列的上、下游引物分別為 Ppmld-6_1-F(3. 2 μ m)、Ppmld-6_1-R(3· 2 μ m)，以及 Bigdye Termi nator V3. 1(購(gòu)買(mǎi)自美國(guó) Applied Biosystems 公司）。
[0063] 送檢樣本不僅有血液樣本，還有為石蠟樣本的可能性。本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物充分考 慮了石蠟樣本中DNA的特性，引物所擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為505bp，即能滿足血液樣本的檢測(cè)又 能滿足石蠟樣本的檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)時(shí)首先將上游引物設(shè)在6號(hào)外顯子編碼區(qū)前52bp處，是 考慮了測(cè)序引物后的20-30bp檢測(cè)是不穩(wěn)定的，這樣測(cè)序就可以從6號(hào)外顯子的編碼區(qū)開(kāi) 始一直測(cè)到突變位點(diǎn)，同樣下游引物離525位突變位點(diǎn)大概93bp也是基于這個(gè)考慮。
[0064] 實(shí)施例2
[0065] 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA抽提試劑盒（天根生物）的操作流程：
[0066] (1)抽提血液中的組織DNA : 1)抽取300 μ 1血液加入900 μ 1紅細(xì)胞裂解液，顛倒 混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒混勻幾次。12, OOOrpm離心lmin，吸去上清，留下白細(xì)胞 沉淀，加200μ 1緩沖液GA，振蕩至徹底混勻。2)加入20μ 1蛋白酶K溶液，混勻。3)加入 200 μ 1緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi) 壁的水珠。4)加入200 μ 1無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短 離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中 (吸附柱放入收集管中），12, OOOrpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。6) 向吸附柱CB3中加入500 μ 1緩沖液⑶（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12,OOOrprn 離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μ1漂洗 液PW(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12, OOOrpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱 CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500 μ 1漂洗液PW，12, OOOrpm離心30秒，倒掉 廢液。9)將吸附柱CB3放回收集管中，12, OOOrpm離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置 于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。10)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈 的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100 μ 1洗脫緩沖液ΤΕ，室溫放置2-5分鐘，12， OOOrpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。
[0067] (2)抽提石蠟樣本中的DNA:1)用刀片刮去樣本表層用于封閉的錯(cuò)，切3片 5-10 μ m厚的樣本，迅速將其放入I. 5ml離心管中，加 Iml二甲苯，蓋好管蓋，漩潤(rùn)攪拌10s。 室溫全速離心2min，吸去上清液，棄掉。2)加入Iml乙醇（96-100% )，漩渦混勻，室溫全速 離心2min。吸取上清液，棄去。打開(kāi)管蓋，在室溫（15-25°C)或37°C的條件下孵育IOmin 或直至殘留的乙醇蒸干。3)用180μ1緩沖液ATL重懸沉淀。加入20μ1蛋白酶K，漩渦 混勻。56°C孵育Ih(或至樣本完全溶解）。90°C孵育lh。短暫離心去除管壁上的液滴。 4)加入200 μ 1緩沖液AL，漩渦混勻。加入200 μ 1乙醇（96-100% )，漩渦混勻。5)短暫 離心去除蓋上的液滴，將全部的消化液移入QIAamp MinElute吸附柱中（放入2ml收集管 中），關(guān)上蓋子，8000rpm離心lmin。棄去收集管及管內(nèi)液體，將QIAamp MinElute吸附柱置 于新的收集管中。6)小心打開(kāi)QIAamp MinElute的蓋子，加入500μ1緩沖液AW1，關(guān)上蓋 子，8000rpm離心lmin。棄去收集管及管內(nèi)液體，將QIAamp MinElute吸附柱置于新的收集 管中。7)全速（13200rpm)離心3min使吸附膜完全干燥。棄去收集管及管內(nèi)液體。8)將 QIAamp MinElute放入新的I. 5ml離心管中，小心加入50 μ 1緩沖液ATE至濾膜中間。蓋上 管蓋，室溫（15-25°C )靜置lmin。全速（13200rpm)離心，收集溶液。
[0068] (3)試劑配置：按檢測(cè)人份數(shù)配置檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液各Χμ 1，每人份18μ 1分 裝：
[0069] X = 18 μ 1反應(yīng)液X (η份標(biāo)本+1份空白對(duì)照）
[0070] η為檢測(cè)標(biāo)本數(shù)。
[0071] (4)加樣：加入檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液中2 μ I DNA ;空白對(duì)照加2 μ 1生理鹽水或不 加任何物質(zhì)。
[0072] (5)擴(kuò)增：檢測(cè)在常規(guī)PCR儀上進(jìn)行，可用儀器包括ABI veriti (美國(guó)Applied Biosystems公司）等。反應(yīng)條件如下：
[0073]

【權(quán)利要求】
1. 檢測(cè)基因多態(tài)熱點(diǎn)突變情況的引物，其特征在于，包括： 擴(kuò)增基因的引物，其喊基序列為： Ppmld-6-l-F ： GCCTAATATCACATGCATAGATTTG Ppmld-6-l-R ： GGCTGAGCACCACTACTTCG. 〇
2. 如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，還包括測(cè)序引物，其堿基序列為： 檢測(cè)/^7?7?/基因的測(cè)序引物喊基序列為： Ppmld-6-l-F ： GCCTAATATCACATGCATAGATTTG Ppmld-6-l-R : GGCTGAGCACCACTACTTCG。
3. 如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，引物序列Ppmld-6-l-F和Ppmld-6-l-R是擴(kuò) 增基因包含第478位及525位氨基酸序列的引物。
4. 如權(quán)利要求2所述的引物，其特征在于，引物序列Ppmld-6-l-F和Ppmld-6-l-R是測(cè) 序基因擴(kuò)增產(chǎn)物包含第478位及525位氨基酸序列的引物。
5. 檢測(cè)基因多態(tài)熱點(diǎn)突變情況的方法，包括以下步驟： 1) 抽提血液或石蠟切片中的組織DNA ; 2) 用PCR擴(kuò)增步驟1中提取的DNA ; 3) 對(duì)步驟2中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序； 4) 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行判斷，確定基因是否發(fā)生突變； 其中PCR擴(kuò)增引物為： Ppmld-6-l-F ： GCCTAATATCACATGCATAGATTTG Ppmld-6-l-R : GGCTGAGCACCACTACTTCG。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，測(cè)序引物堿基序列為： Ppmld-6-l-F ： GCCTAATATCACATGCATAGATTTG Ppmld-6-l-R : GGCTGAGCACCACTACTTCG。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104293943SQ201410527595
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】林筱劍, 陳奕磊, 王淑一 申請(qǐng)人:武漢艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司