四翅濱藜糖原合成酶激酶3基因克隆及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】四翅濱藜糖原合成酶激酶3基因克隆及其應(yīng)用屬植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，一種植物抗逆相關(guān)蛋白AcGSK3，由序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；所述植物抗逆性相關(guān)蛋白AcGSK3的編碼基因AcGSK3的編碼序列為下列之一:1)編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1的5’端第346-684位脫氧核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID NO:2蛋白質(zhì)序列的核苷酸分子；一種重組表達載體，含有植物抗逆性相關(guān)蛋白AcGSK3的編碼基因AcGSK3；一種重組菌，含有植物抗逆性相關(guān)蛋白AcGSK3的編碼基因AcGSK3；在本源植物四翅濱藜中通過qRT-PCR檢測，該基因在NaCl和PEG脅迫下上調(diào)表達。同時，將AcGSK3導(dǎo)入釀酒酵母得到轉(zhuǎn)基因釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，進行脅迫處理，結(jié)果亦可表明AcGSK3可以提升酵母耐干旱(山梨醇)和耐鹽(NaCl)的能力。
【專利說明】四翅濱藜糖原合成酶激酶3基因克隆及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及使用釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVScl菌株表達與植物抗逆（具體為鹽和干旱）相關(guān)的蛋白AcGSK3,同時采 用實時熒光定量PCR(實時PCR，Real-Time-PCR，）的方法來研究該基因?qū)Ψ巧锩{迫NaCl 和PEG的功能。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中逆境脅迫是影響糧食產(chǎn)量最重要的因素和挑戰(zhàn)之一。農(nóng)作物在整 個生長季節(jié)中，會受到各種逆境因素的影響，如生物脅迫的病蟲害等，及非生物脅迫的鹽、 堿、高溫、低溫、干旱等，這些脅迫限制了植物的生長發(fā)育，最終會導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低，品質(zhì) 下降，直接影響甚至威脅到糧食安全，在這些嚴重影響作物生產(chǎn)的逆境因子中，極端溫度、 干旱、高鹽、營養(yǎng)失調(diào)（包括礦物質(zhì)中毒和礦物質(zhì)缺乏）是影響作物產(chǎn)量的主要限制因子， 每年直接從鹽、堿、干旱、低溫脅迫等逆境造成的農(nóng)作物減產(chǎn)仍然超過總產(chǎn)量的20%，而干 旱和鹽脅迫是最主要的制約因素。因此，研究與非生物脅迫有關(guān)的基因，并將其導(dǎo)入作物 進行分子育種，引起了科研工作者的廣泛興趣，而通過基因工程的方法進行逆境相關(guān)基因 的克隆及其功能的解析，能夠為植物抗逆育種提供有價值的信息和材料。然而，從直接解決 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中關(guān)鍵問題的角度來看，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上能起顯著作用的轉(zhuǎn)基因作物種類還不多， 人類對植物逆境適應(yīng)性分子機理的研究還遠遠不夠，遠不能滿足植物分子育種的需求，同 世界發(fā)達國家相比，我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)和具有重要利用價值的基因相對較少。同時，目 前的研究也主要集中在草本植物，而對木本植物及其耐鹽和干旱的分子遺傳研究也相對較 少。然而，草本和木本植物在結(jié)構(gòu)、生長、發(fā)育、生理，及在應(yīng)對生物和非生物脅迫等方面存 在較大的差異性。所以，從木本植物中尋找抗逆相關(guān)的基因并進行研究，能夠為通過基因工 程提高作物的生物和非生物脅迫耐受性這種手段提供更多的候選基因。
[0003] 四翅濱藜（Atriplex canescens [Pursh]Nute)是一種鹽生灌木，在分類上為藜科， 濱藜屬，普遍存在于干旱、半干旱地區(qū)，具有較強的耐干旱、抗鹽堿、耐寒冷和耐重金屬的特 性，尤其是耐干旱和鹽的特性。四翅濱藜在每年降雨量最低為180_的干旱半干旱地區(qū)，年 平均氣溫僅為5°C左右的低溫地區(qū)，甚至在極端低溫為-40°C地區(qū)以及鹽堿地等惡劣環(huán)境 下依然生長良好，同時在海拔2000米左右的地區(qū)也適合生長，根據(jù)已有報道，四翅濱藜被 有些國家稱為"生物脫鹽器"，它一年時間就可以從6. 07畝的土地上吸收到1噸以上的鹽 分，灌木生物量也能達到15t/hm2,枝葉中的粗蛋白含量在12%以上，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、富含營養(yǎng)， 相關(guān)科學(xué)家們認為，四翅濱藜有及其豐富的營養(yǎng)價值和可觀的飼料用途，因此成為了荒漠、 半荒漠干旱地區(qū)非常有價值的優(yōu)良飼料灌木樹種。同時，四翅濱藜還具有積累硒的能力，因 此在美國也廣泛用于水土保持和路坡固定，但牧場改良仍然是其主要用途。近年來，四翅濱 藜先后在中國的新疆，甘肅，寧夏，青海和其它地方種植，通過大量研究，充分體現(xiàn)了四翅濱 藜較強的抗鹽，堿，干旱，低溫，貧瘠等優(yōu)良特性，漸漸成為綠化和水土保持的優(yōu)良樹種。
[0004] 釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)具有典型的真核系統(tǒng)，是二倍體，它在 蛋白翻譯后加工過程中能形成二硫鍵，具有糖基化以及蛋白折疊等特征，使得其基因表達 模式更加接近于真核植物中的表達模式，它還具有生長快速、遺傳操作簡便和易于培養(yǎng)等 的優(yōu)點，所以在對植物功能基因的相關(guān)研究中，用酵母表達系統(tǒng)篩選具有原核表達系統(tǒng)不 可替代的優(yōu)勢性。釀酒酵母菌株INVScl (基因型為MATa his3Dlleu2trpl-289ura3-52)是 經(jīng)過人工改造后的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株，該菌株的酵母轉(zhuǎn)化子運用SC-U缺培養(yǎng)基篩選 時，假陽性低，轉(zhuǎn)化效率高，因此是理想的酵母表達菌株。利用酵母營養(yǎng)缺陷型菌株對植物 cDNA文庫的研究和挖掘，在植物中受到越來越多關(guān)注。Frommer等和Hsu等（1993年）在篩 選擬南芥cDNA文庫中克隆到氨基酸透過酶的NAT2/AAP1基因，該基因可以互補酵母的氨基 酸轉(zhuǎn)運缺陷突變體；酵母系統(tǒng)研究植物耐鹽性表達基因的功能研究也被廣泛應(yīng)用，Yamada 等（2002年）就利用酵母轉(zhuǎn)化子來驗證丙二烯環(huán)化氧化酶（AOC)基因可以大大提高抗鹽 性，進一步推測到AOC基因在植物中也可能具有抗鹽功能。唐玉林等（2007年）利用酵母 研究了大豆SALI3-2蛋白可以使酵母轉(zhuǎn)化子的耐鹽能力得到顯著提高，從而推測SALI3-2 基因所具有的抗逆能力。由此可見，利用酵母表達外源蛋白并研究其功能已經(jīng)受到廣泛應(yīng) 用。
[0005] Real-Time PCR(RT-PCR)是一種目前應(yīng)用普遍的檢測基因表達的技術(shù)，它通過 添加熒光基團，并利用熒光信號累積來實時監(jiān)測整個PCR的進程，最后通過標準曲線對未 知模板進行定量分析，該方法能夠避免傳統(tǒng)PCR定量終產(chǎn)物時產(chǎn)生的偏差，從而使實驗的 重復(fù)性得到提高，該技術(shù)現(xiàn)已被廣泛用于監(jiān)測細胞mRNA的表達量變化。SYBR green是 Real-time PCR的常用方法之一，該法靈敏度高，通用性好，方法簡單等優(yōu)點而被國內(nèi)外科 研中普遍使用。
[0006] 蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)屬于多功能絲氨酸和蘇氨酸激酶，是G蛋白 偶聯(lián)受體系統(tǒng)中的效應(yīng)物，PKC在非活性狀態(tài)下是水溶性的，主要分布在細胞質(zhì)中，因此是 一種細胞質(zhì)酶。在未受刺激的細胞中，呈非活性構(gòu)象。一旦有第二信使的存在，PKC將成為 膜結(jié)合的酶，它能激活細胞質(zhì)中的酶，參與生化反應(yīng)的調(diào)控，同時也能作用于細胞核中的轉(zhuǎn) 錄因子，參與基因表達的調(diào)控，是一種多功能的酶。糖原合成酶激酶3 (glycogen synthase kinase3, GSK3)是最先在1980年從動物細胞中得到的一類PKC，李建莎等（2006)提到它 僅僅是一個調(diào)節(jié)糖原代謝的蛋白激酶。GSK3在多種細胞功能活動的調(diào)節(jié)中扮演著重要的 角色，包括調(diào)節(jié)細胞的結(jié)構(gòu)、細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)、細胞的分裂、凋亡、微管運動及參與決定胚 胎發(fā)育過程中細胞的命運。在植物中，通常又稱為shaggy-related protein kinase (SGG) (Dornelas et al.1999)。Khan等（2013)在酵母雙雜交實驗中發(fā)現(xiàn)，SGG/GSK3也可以在 油菜素內(nèi)酯介導(dǎo)的信號途徑中與BZRl互作，從而促進BZRl在原生質(zhì)體中的磷酸化。同時， SGG/GSK3基因的表達受NaCl和ABA誘導(dǎo)，但不受KCl誘導(dǎo)，因此該基因可能參與響應(yīng)非生 物脅迫（Piao等，2001)。然而在目前的眾多研究中，還無有關(guān)四翅濱藜AcGSK3基因在抗逆 等生理功能方面的研究報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明通過構(gòu)建四翅濱藜（Atriplex canescens)的低溫（-10 °C )及鹽脅迫 (400mM NaCl)全長cDNA文庫，并利用Gateway技術(shù)將cDNA文庫LR重組到酵母表達載 體（PYES-DEST52)中，混合質(zhì)粒載體經(jīng)轉(zhuǎn)化到酵母菌株INVScl中，并通過模擬逆境脅迫 (NaCl、山梨醇）篩選出與逆境脅迫相關(guān)的基因-糖原合成酶激酶3基因（AcGSK3)，同時利 用RT-PCR技術(shù)檢測該基因在逆境脅迫（NaCl，PEG6000)條件下的表達量變化，以初步研究 該基因在四翅濱藜中逆境脅迫的相應(yīng)作用。本發(fā)明不僅對四翅濱藜的耐干旱和耐鹽分子機 制的研究提供新的依據(jù)，同時為獲得具有抗逆能力的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物和林木（耐鹽、干旱）奠 定基礎(chǔ)。本發(fā)明中，轉(zhuǎn)pYES-AcGSK3的重組酵母轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出了明顯的抗干旱和抗鹽脅迫 的能力。同時在本源植物四翅濱藜中，AcGSK3基因的表達也對鹽脅迫和旱脅迫表現(xiàn)出了明 顯的響應(yīng)。
[0008] 本發(fā)明提供了四翅濱藜中一種含GSK3功能域的與植物抗逆（鹽和旱）相關(guān)的蛋 白及其編碼基因序列，通過利用酵母系統(tǒng)進行功能驗證，并在本源植物中通過RT-PCR檢測 的方法對該基因進行進一步解析及其在植物抗逆中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明提供的糖原合成酶激酶3基因，名稱為AcGSK3,為序列表中SEQ ID NO :1所 示的核苷酸序列。通過四翅濱藜全長cDNA文庫測序得到AcGSK3基因。該基因共由1101 個堿基組成，完整的開放閱讀框含有339bp，同時還含有5'非翻譯區(qū)和3'非翻譯區(qū)序列，開 放閱讀框的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。
[0010] 本發(fā)明所提供的蛋白耐干旱和鹽脅迫，名稱為AcGSK3(糖原合成酶激酶3)，來源 于鹽生灌木四翅濱藜，植物抗逆相關(guān)蛋白AcGSK3,由序列表中序列2所示的氨基酸序列組 成的蛋白質(zhì)。
[0011] 所述植物抗逆性相關(guān)蛋白ACGSK3的編碼基因 AcGSK3的編碼序列為下列之一：
[0012] 1)編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1的5'端第346-684位脫氧核 苷酸；
[0013] 2)編碼序列表中SEQ ID NO:2蛋白質(zhì)序列的核苷酸分子。
[0014] 一種重組表達載體，含有植物抗逆性相關(guān)蛋白AcGSK3的編碼基因 AcGSK3。
[0015] 一種重組菌，含有植物抗逆性相關(guān)蛋白AcGSK3的編碼基因 AcGSK3。
[0016] 序列表中的序列2共由113個氨基酸殘基所組成，根據(jù)DNAMN分析等電點9. 69， 一般情況下，蛋白帶正電荷，蛋白二級結(jié)構(gòu)含57個卷曲，56個螺旋，不含折疊，有6個抗 原肽段，蛋白含40個親水氨基酸，73個疏水氨基酸，根據(jù)Expasy protscale的Hphob/ Kyte&Doolittle分析到球蛋白可能的表面區(qū)域為中部及C端。PSORT Prediction預(yù)測蛋 白可能性定位大小依次為細胞質(zhì)、微體。
[0017] 本發(fā)明涉及的酵母表達載體pYES-DEST52(購自Invitrogen公司）與AcGSK3基因 重組為pYES-AcGSK3,且該重組酵母表達載體轉(zhuǎn)化的宿主感受態(tài)細胞為釀酒酵母INVScl。 該酵母表達載體除了含有AcGSK3的編碼DNA序列外，還攜帶有GALl啟動子、T7啟動子、 URA3基因、氨芐青霉素抗性標記基因、CYCl終止轉(zhuǎn)錄信號、LR重組位點attRl和attR2、用 于逆向篩選的致死基因 ccdB，蛋白純化的6xHisTag，蛋白表達檢測的V5epitope等外源基 因蛋白在酵母中高效表達所需的各種調(diào)控元件。
[0018] 本發(fā)明通過RT-PCR方法，檢測了該基因在對于干旱和鹽脅迫的響應(yīng)（PEG，NaCl處 理），基因在兩種脅迫處理下表現(xiàn)出了基因上調(diào)，進一步推測該基因在植物參與逆境響應(yīng)， 尤其是干旱和鹽脅迫中起重要作用，該基因的上調(diào)表達有助于提高四翅濱藜的抗干旱和抗 鹽的能力。
[0019] 本發(fā)明在通過酵母（NaCl，山梨醇）及RT-PCR(NaCl，PEG)關(guān)于干旱和鹽的研究后， 結(jié)果表明AcGSK3基因在逆境方面的應(yīng)用：該基因過量表達可能提高植物的抗逆性，所述植 物抗逆性具體可分為對非生物脅迫和生物脅迫的抗逆性，非生物脅迫如干旱、極端溫度、鹽 堿等，特別是植物的抗干旱和鹽脅迫的能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為四翅濱藜總RNA提取圖片
[0021] 圖 2 為 IKb Plus DNA Ladder
[0022] 圖3為cDNA文庫插入片段長度PCR檢測圖片
[0023] 圖4為cDNA文庫插入片段長度PCR檢測圖片
[0024] 圖 5 為 IKb Plus DNA Ladder
[0025] 圖6為pYES-AcGSK3重組質(zhì)粒PCR擴增凝膠電泳圖
[0026] M :DL2000DNA Marker ;M :2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ;1，2 :擴增 片段
[0027] 圖7為AcGSK3在NCBI中功能域比對分析結(jié)果
[0028] 圖8為AcGSK3與其它物種的同源蛋白系統(tǒng)進化分析
[0029] 圖9為pYES-AcGSK3陽性重組酵母轉(zhuǎn)化子PCR凝膠電泳圖
[0030] M :DL2000DNA Marker ;M :2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ;1 :陽
[0031] 性酵母轉(zhuǎn)化子PCR鑒定
[0032] 圖10為重組酵母pYES-AcGSK3和pYES-DEST52非脅迫下的結(jié)果
[0033] 圖11為重組酵母pYES-AcGSK3和pYES-DEST52在3M山梨醇脅迫下的結(jié)果
[0034] 圖12為重組酵母pYES-AcGSK3和pYES-DEST52在2M NaCl脅迫下的結(jié)果
[0035] 圖10-12中：pYES-AcGSK3酵母轉(zhuǎn)化在對2MNaCl和3M山梨醇的抗逆能力明顯強 于空載體PYES-DEST52酵母轉(zhuǎn)化子。
[0036] 圖13為AcGSK3基因在400mM NaCl脅迫處理后的表達量變化圖
[0037] 圖14為AcGSK3基因在20% PEG6000脅迫處理后的表達量變化圖
[0038] 圖13和14中：AcGSK3基因在NaCl處理6h后開始上調(diào)表達；同時，在PEG處理 24h后該基因開始上調(diào)表達。

【具體實施方式】
[0039] 實施例一：AcGKS3基因全長cDNA的獲得及序列分析
[0040] 1.脅迫處理四翅濱藜：
[0041] -KTC條件下生長三個月的四翅濱藜植株，移栽到人工氣候培養(yǎng)箱，正常培養(yǎng)10 天后，待植株復(fù)蘇存活，發(fā)出新葉，生長健壯。將植株轉(zhuǎn)移到含有營養(yǎng)的水培條件下，正常生 長兩天后，用500mL的含NaC1400mM的鹽液水培處理四翅濱藜植株，脅迫處理4天后，采摘 葉片，嫩莖部和幼根清洗干凈并液氮速凍，_80°C凍存，以備建庫。
[0042] 2.構(gòu)建 cDNA 文庫：
[0043] 將NaCl處理4天后的四翅濱藜樣品（葉片、嫩莖和幼根）提取總RNA (圖1、圖2)， 然后使用Invitrogen公司的'cap antibody module'將含有完整帽子結(jié)構(gòu)的單鏈cDNA進 行富集，并按照Superscript lvFull-Length cDNA Library Construction Kit 試劑盒構(gòu)建 全長cDNA文庫，并通過Gateway技術(shù)將該cDNA文庫LR重組到酵母表達載體pYES-DEST52 中，隨機對cDNA文庫進行PCR檢測（圖3、圖4、圖5)，將長度500bp以上的片段進行測序， 利用NCBI的BlastX進行功能域的比對及相關(guān)生物信息學(xué)分析，獲得了四翅濱藜鹽脅迫的 表達序列標簽（ESTs)。
[0044] 2. 1四翅濱藜總RNA提取的方法：
[0045] 2. I. 1取IOOmg植物樣品，在預(yù)冷的研缽中用液氮迅速研成粉末，快速轉(zhuǎn)移到遇冷 的2mL離心管中。（保證全過程在通風廚中，防止RNA降解。）
[0046] 2. 1. 2加入ImlTrizol試劑，劇烈振蕩混勻15s，靜置IOmin充分裂解細胞。
[0047] 2. 1.3加入0.2mL氯仿（三氯甲烷），迅速震蕩混勻15s，靜置5min。
[0048] 2. 1. 4 高速低溫（12, OOOrpm，4°C )離心 15min。
[0049] 2. I. 5將上清小心轉(zhuǎn)移到新的I. 5mL離心管，加0.5mL異丙醇，顛倒混勻，靜置 IOmin0
[0050] 2. 1. 6 再次高速低溫（12, OOOrpm，4°C )離心 lOmin。
[0051] 2. 1. 7去除上清，加0. 5IHL751%的乙醇，7, 500rpm低溫離心5min以洗漆沉淀。
[0052] 2. 1. 8重復(fù)步驟2. 1. 7 -次，進一步洗漆沉淀，去除離子。
[0053] 2. 1. 9小心吸取上清，并通風廚中干燥RNA沉淀，并用50 μ L的DEPC水溶解RNA。
[0054] 3.篩選AcGSK3基因片段的克?。?br> [0055] 根據(jù)測序分析，獲得四翅濱藜ESTs，從中獲得了一個編碼GSK3的cDNA全序 列AcGSK3,將LR重組得到的酵母表達載體pYES-AcGSK3轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中 (DH5 α )，過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落，并于LB (含100mg/L的Amp)液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，通過 質(zhì)粒提取試劑盒（鼎國公司）提取質(zhì)粒。并根據(jù)載體上的通用序列PCR引物，并進行質(zhì)粒 PCR擴增驗證，以鑒定獲得的cDNA序列。
[0056] 上游（T7) :5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3'
[0057] 下游（R) :5' -AGGGTTAGGGATAGGCTTACCTTC-3'
[0058] PCR 反應(yīng)體系（25 μ L) :Buffer2. 5 μ L、上下游引物（T7、R)各 0· 5 μ L、Tag 酶 0· 5 μ UdNTPO. 5 μ L、模板 0· 2 μ L、ddH2020. 8 μ L。PCR 反應(yīng)的條件：在 94°C預(yù)變性 5 分鐘； 94 °C變性30秒；迅速冷卻至58 °C退火30秒；72 °C延伸2分鐘，30個循環(huán)；72 °C延伸10分 鐘；4°C冷卻保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在大約IlOObp的位置上有特異 性的目的條帶（圖6)。
[0059] 實施例二：AcGSK3基因的序列分析
[0060] 經(jīng)測序分析后，AcGSK3基因的全長cDNA序列l(wèi)lOlbp，包含339bp的開放閱讀框， 共編碼113氨基酸殘基，根據(jù)DNAMN分析等電點9. 69, 一般情況下，蛋白帶正電荷，蛋白二 級結(jié)構(gòu)含57個卷曲，56個螺旋，不含折疊，有6個抗原肽段，蛋白含40個親水氨基酸，73個 疏水氨基酸，根據(jù)Expasy protscale的Hphob/Kyte&Doolittle分析到球蛋白可能的表面 區(qū)域為中部及C端。PSORT Prediction預(yù)測蛋白可能性定位大小依次為細胞質(zhì)、微體。這 是GSK3家族蛋白的主要特征。通過分析表明，獲得了 AcGSK3基因的全長cDNA序列，并且 在GenBank上的登錄號為KJ027006。
[0061] 利用 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)對該編 碼基因進行保守區(qū)域分析（圖7)，該基因編碼的蛋白屬于GSK3家族蛋白。通過NCBI對 AcGSK3基因編碼的氨基酸序列進行BLASTX，通過與已確定功能的其它物種的氨基酸序列 進行同源性分析和系統(tǒng)進化分析，利用MEGA4軟件進行進化樹分析，結(jié)果表明：AcGSK3與葡 萄和蓖麻等木本植物中的GSK3編碼的氨基酸進化關(guān)系更近（圖8)。
[0062] 實施例三：重組酵母的轉(zhuǎn)化及檢測
[0063] 釀酒酵母菌株INVScl為尿氨酸營養(yǎng)缺陷型（UraO的模式菌株，在缺乏尿氨酸 的酵母基本培養(yǎng)基（SC-UraO上，該酵母菌株幾乎不能生長和繁殖。而酵母表達載體 (PYES2-DEST52)上含有URA3基因，且該基因的表達可以使酵母轉(zhuǎn)化子在SC-Ura-培養(yǎng)基 上正常生長。因此，SC-Urf選擇培養(yǎng)基可以進行陽性和非陽性酵母轉(zhuǎn)化子的篩選。通過醋 酸鋰法將載體質(zhì)粒pYES-AcGSK3和pYES-DEST52分別轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)菌株INVScl中，將 轉(zhuǎn)化酵母菌液涂在SC-Urf固體選擇培養(yǎng)基上，以未轉(zhuǎn)化的酵母做對照，進行培養(yǎng)，2d后除 了空酵母完全不長外，轉(zhuǎn)化兩種質(zhì)粒的酵母均可以生長并有菌落長出，說明酵母轉(zhuǎn)化成功， 挑取酵母單菌落，過夜培養(yǎng)后進行破除細胞壁，并通過菌液PCR方法進行陽性轉(zhuǎn)化子的進 一步鑒定。
[0064] 1.運用醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVScl，其具體轉(zhuǎn)化步驟：
[0065] I. 1將一個酵母菌株單克?。↖NVScl)加入到IOmLYH)液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm 過夜搖培。
[0066] 1. 2檢測酵母菌液的0D_值，利用50mL YH)液體培養(yǎng)基，將過夜培養(yǎng)的酵母菌液 稀釋至 OD6tltl 為 0. 4, 30°C，200rpm 繼續(xù)搖培 2-4h。
[0067] 1. 3低溫離心（4°C，2500rpm)5min后，去除上清收集菌體，用40mLlxTE緩沖液重懸 菌體。
[0068] L 4再次低溫離心（4°C，2500rpm)5min后，收集菌體，用2mLlxLiAc/0. 5xTE緩沖液 重懸菌體。
[0069] 1. 5將獲得的重懸菌體按照每管100 μ L的體系，分裝到I. 5mL離心管。
[0070] 1. 6將分裝的酵母細胞置于室溫孵育lOmin。
[0071] 1. 7在每個轉(zhuǎn)化體系（100 μ L)中，加入Iyg質(zhì)粒DNA，IOOyg變性鮭魚精DNA，混 勻。
[0072] 1. 8 每個體系中加入 700μ Llx LiAc/40% PEG-3350/lx ΤΕ，混勻。
[0073] I. 930°C孵育步驟1. 8中的混合液30min。
[0074] I. 10在每個體系中再加入88μ L的DMSO,混勻后，42°C條件下水浴熱擊7min。
[0075] I. 115000rpm低溫離心lmin，去除上清。
[0076] 1. 12用備好的ImLlxTE的緩沖液重懸菌體，5000rpm低溫離心Imin,進一步去除上 清。
[0077] 1. 13用IOOyLlxTE的緩沖液將菌體重懸，并涂于酵母選擇培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng) 24h。
[0078] 2.陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定
[0079] 從酵母選擇培養(yǎng)基上隨機挑取5個酵母轉(zhuǎn)化子（pYES2_AcGSK3)的單菌落，30°C振 蕩培養(yǎng)過夜（200rpm)，收集過夜培養(yǎng)菌體，沸水煮5min，迅速置于冰上5min以破碎細胞， 重復(fù)幾次，以細胞破碎液離心濃縮樣品作為模板進行菌液PCR，以引物T7和R進行PCR擴 增，PCR 反應(yīng)體系為（25μ L) :Buffer2. 5μ L、上下游引物（T7、R)各 0. 5μ UTag 酶 0. 5μ L、 dNTPO. 5 μ L、模板 5 μ L、ddH2015. 5 μ L。
[0080] PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，擴增片段大小為llOObp，與目標長度吻 合（圖9)。證明重組質(zhì)粒pYES2-AcGSK3已經(jīng)轉(zhuǎn)化到酵母菌株中。
[0081] 實施例四：陽性轉(zhuǎn)化酵母逆境脅迫處理
[0082] 1.逆境脅迫處理前準備
[0083] 取適量陽性酵母轉(zhuǎn)化子（pYES-DEST52，pYES2-AcGSK3)菌液，接種到含2%葡萄糖 的SC-U液體培養(yǎng)基中，30°C條件下200rpm振蕩培養(yǎng)24h，測OD 6c?值，并用SC-U液體培養(yǎng)基 (2 %葡萄糖）將菌液OD6tltl統(tǒng)一調(diào)整為0. 4,總體積5mL，8000rpm離心lmin，吸取上清液，力口 2mL含2%半乳糖的酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸菌體，以1:50的比例接到5mL的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中擴 大培養(yǎng)，30°C振蕩培養(yǎng) 24h，檢測酵母 INVScl(pYES-DEST52)和 INVScl(pYES2-AcGSK3)的 0D_值，并統(tǒng)一調(diào)整到0D_值為2,備用。對這兩種酵母轉(zhuǎn)化子進行不同的非生物脅迫處 理，比較兩種酵母轉(zhuǎn)化子抗鹽和干旱脅迫能力，實驗重復(fù)3次。
[0084] 2.模擬逆境脅迫處理
[0085] 存在于自然界中的植物面對各種生物和非生物逆境，非生物脅迫中最主要的是鹽 脅迫（NaCl、KCl等）和干旱脅迫。
[0086] 在實驗室條件下進行鹽和干旱的模擬，用2MNaCl模擬鹽脅迫，3M的山梨醇模擬干 旱脅迫。運用以上兩種模擬條件處理酵母轉(zhuǎn)化子，通過酵母的生長情況對比，從而評價該 基因在酵母中誘導(dǎo)表達后對酵母抗逆性的影響，以對該基因在酵母中的抗逆功能進行初探 (圖 10、圖 11、圖 12)。
[0087] 2. INaCl處理：將上述備用菌體分別以不稀釋和稀釋10、100、1000、10000倍的菌 體，吸取2 μ L菌液接種到含2%半乳糖的SC-U固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)兩天后，比較兩種酵 母轉(zhuǎn)化菌的菌落生長狀態(tài)。
[0088] 2. 23M山梨醇干旱模擬處理：將上述備用菌體分別以不稀釋和稀釋10、100、1000、 10000倍的菌體，吸取2 μ L菌液接種到含2%半乳糖的SC-U固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)兩天 后，比較兩種酵母轉(zhuǎn)化菌的菌落生長狀態(tài)。
[0089] 實施例五：AcGSK3基因在四翅濱藜PEG和NaCl脅迫下的應(yīng)答
[0090] 1.四翅濱藜脅迫處理：
[0091] 將四翅濱藜種子種在營養(yǎng)土中，正常條件生長50天后，選取生長良好的四翅濱 藜，轉(zhuǎn)移到MS營養(yǎng)液中進行水培，每天更換營養(yǎng)液，水培3天待四翅濱藜生長健壯后，分別 用400mM NaCl和20% PEG6000處理，并在0、6、12、24、48h后取根莖葉，液氮速凍，-80°C保 存。
[0092] 2. RNA提取及反轉(zhuǎn)錄：
[0093] 采用Trizol法提取總RNA (如實施例一，2. 1)，利用Takara公司的PrimeScripP RT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄以制備 cDNA，用 于 quantity Real-time PCR 分析。
[0094] 3.熒光定量PCR分析：
[0095] 利用SYBR:?Grecn Reagent試劑盒，使用7500熒光定量系統(tǒng)檢測AcGSK3基因 (F: CGTCCATTGCCACCTCTCTT ; R: TACTGTCGCCTCACATGCTC)在不同處理下隨時間變化的表達 量差異。真核延伸生長因子（EFl-α)作為內(nèi)參基因（F:5' -CCCCAGTTCTCGACTGTCAC-3' ； R5' -TGGTGGGAACCATCTTCACG-3'）。反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性 30 秒；95°C變性 5 秒，60°C退 火延伸34秒，進行40個循環(huán)；95°C變性15秒，60°C退火延伸1分鐘，95°C變性15秒；60°C 延伸15秒。采用法分析表達量差異（圖13、圖14)。
【權(quán)利要求】
1. 一種植物抗逆相關(guān)蛋白AcGSK3,其特征在于由序列表中SEQ ID NO: 2所示的氨基酸 序列組成的蛋白質(zhì)。
2. 按權(quán)利要求1所述植物抗逆性相關(guān)蛋白AcGSK3的編碼基因AcGSK3,其特征在于所 述編碼基因AcGSK3的編碼序列為下列之一： 1) 編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1的5'端第346-684位脫氧核苷酸； 2) 編碼序列表中SEQ ID NO:2蛋白質(zhì)序列的核苷酸分子。
3. -種重組表達載體，其特征在于含有權(quán)利要求2所述植物抗逆性相關(guān)蛋白AcGSK3的 編碼基因AcGSK3。
4. 一種重組菌，其特征在于含有權(quán)利要求2所述植物抗逆性相關(guān)蛋白AcGSK3的編碼基 因 AcGSK3。
【文檔編號】C12N9/12GK104371986SQ201410497562
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】潘洪玉, 李敬濤, 余剛, 孫新華, 劉金亮, 劉言志, 張祥輝, 賈承國 申請人:吉林大學(xué)