擬莖點霉rna聚合酶(rpb1)基因擴增引物及其設計方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了擬莖點霉RNA聚合酶(RPB1)基因擴增引物及其設計方法和應用。本發(fā)明設計的是針對擬莖點霉屬真菌的通用引物。其上游引物PhR1-F有43個堿基：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACTGCAGCAAGGTGTTGGCTG，下游引物PhR1-R有43個堿基：AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGCGATGTCGTTGTCCATGTA。本發(fā)明設計的擬莖點霉RNA聚合酶基因擴增引物可以快速的對擬莖點霉屬真菌進行大規(guī)模的遺傳背景分析，為我國擬莖點霉的種類鑒定、地理種群鑒別或檢驗檢疫工作提供了重要的工具。
【專利說明】擬莖點霉RNA聚合酶（RPB1)基因擴增引物及其設計方法和 應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及擬莖點霉真菌鑒別【技術領域】，具體的說，涉及擬莖點霉RNA聚合酶 (RPB1)基因擴增引物及其設計方法和應用。

【背景技術】
[0002] 擬莖點霉屬（Phomopsis (Sacc. ) Bubak)是半知菌亞門（Deuteromycotina)、腔孢 綱（Coelomycetes)、球殼抱目（Sphaeropsidales)、球殼抱科（Sphaeropsidaceae)中的重 要真菌屬，其有性態(tài)為間座殼屬（Diaporthe)，含有400多個不同的種、呈世界性分布，主要 集中在熱帶和亞熱帶地區(qū)。擬莖點霉屬真菌是農業(yè)和林業(yè)上重要的病原菌，寄主植物共74 科，可引起多種植物病害，例如潰瘍、爛莖、果腐、葉枯、枝枯、根腐、樹皮壞死等。此外，該屬 的部分種類還是植物的重要內生菌和腐生菌，甚至可以危害人或其他哺乳動物，在生態(tài)系 統(tǒng)中占有重要的地位。
[0003] RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polymerases)在基因表達的過程中扮演著很 重要的角色。早在1984年以前，生物化學家就已經在真核生物中成功地分離出3種RNA 聚合酶。其中，RNA聚合酶II由12個亞基組成（RPB1-RPB12)，負責轉錄生成hnRNA和 mRNA。RPB1 (the largest RNA polymerase subunit)基因負責編碼 RNA 聚合酶 II 的大亞 基，具有單拷貝和進化速率慢的特點。
[0004] RPB1 基因片段與其他基因片段如 ITS (internal transcribed spacer)、RPB2、 EF(elong ation factor)等相結合，目前已廣泛地應用于真菌的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究。 RPB1基因適用于親緣關系較近、外形相似的真菌間的分析比較，在擬莖點霉真菌種類鑒定、 地理種群鑒別或口岸檢驗檢疫中具有重要應用。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一對可高效擴增擬莖點霉RPB1基因的擴增引物。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述引物的設計方法。
[0007] 本發(fā)明的進一步目的是提供上述引物在擬莖點霉種類鑒定、地理種群鑒別和檢驗 檢疫中的應用。
[0008] 本發(fā)明設計的擬莖點霉RPB1基因擴增引物其上游引物PhRl-F有43個堿基：CGC CAGGGITTTCCCAGTCACGACTGCAGCAAGGTGTTGGCTG，下游引物 PhRl-R 有 43 個堿基：AGCGGATAA CAATTTCACACAGGAGCGATGTCGTTGTCCATGTA。
[0009] 本發(fā)明的擬莖點霉RPB1基因擴增引物設計的步驟為：登陸GenBank搜索目前已 測定全序列的60種擬莖點霉RPB1基因，去掉不完全和部分的序列，尋找保守序列，設計出 擴增序列，并在5'端加入測序序列，從而獲得一對通用引物：其上游引物PhRl-F有43個堿 基：CGCCAGGGITTTCCCAGTCACGACTGCAGCAAGGTGTTGGCTG，下游引物 PhRl-R 有 43 個堿基：AGC GGATAACAATTTCACACAGGAGCGATGTCGTTGTCCATGTA。擴增片斷大小在 750bp 左右。
[0010] 可擴增擬莖點霉屬真菌RPB1基因的通用引物PCR反應體系和反應條件如下： PCR反應體系為25yL，內含2X Taq MasterMix、10yM的引物PhRl-F和引物 PhRl-R、含 50 ?150ng 的 DNA 模板溶液、ddH20。
[0011] 2 X Taq MasterMix 12. 5 μ L PhRl-F lyL PhRl-R lyL Template 1 μ L ddH20 9. 5 μ L 擴增條件為：94°C預變性3min，然后94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸60s，共35 個循環(huán)，最后在72°C充分延伸lOmin。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小、純度 及亮度。
[0012] 本發(fā)明所述的擬莖點霉RPB1基因擴增引物能擴增擬莖點霉RPB1基因，均能獲得 單一的目的DNA片段，產物大小為750bp左右，并對所有PCR擴增產物進行直接測序。其 步驟為：PCR擴增產物經初步定量后，濃度達lOOng/μΙ的樣品委托公司進行雙向直接測 序，測序引物為M13F-47(10yM)和RV-M(lOyM)，序列分析儀為ABI 3730型全自動DNA測 序儀。
[0013] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果： 本發(fā)明的擬莖點霉RPB1基因擴增引物對部分擬莖點霉RPB1基因進行擴增，均能獲得 單一的目的DNA片斷，特異性擴增產物大小為750bp左右，經測序及與GenBank上同源序 列的比較，證實為擬莖點霉RPB1基因的擴增產物。本發(fā)明設計的擬莖點霉RPB1基因擴增 引物可以快速地對多種擬莖點霉進行大規(guī)模的遺傳背景分析，準確鑒定某些難于鑒別的近 緣物種，為我國擬莖點霉種類鑒定、地理種群鑒別或檢驗檢疫工作提供了重要的工具。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1、圖2均為PhRl-F/PhRl-R擴增不同擬莖點霉RPB1基因的電泳圖譜。
[0015] 其中M :DNA分子量標準（lOObp DNA Ladder)，N :陰性對照，H20 :水對照，1 - 27 : 依次為扁桃擬莖點霉梨干枯擬莖點霉Λ/Α--')、 大豆擬莖點種腐病菌J7a )、蘋果擬莖點菌J7 )、芒果 微客存、霉 QPhotnopsis mangiferae)、外飛殊生微客存、霉 QPhomopsis phyl lanthicola\ 柿苗擬莖點霉ro)、茶潰瘍擬莖點霉iAeae )、莖生擬莖點霉 石槽干腐菌Fersofliaaa)、葡萄生擬莖點霉菌 (Miomopsis viticola)、蘆麥擬菩點、霉（Miomopsis asparagi )、綠擬菩點、霉（Miomopsis rhapic/is)、貓褐級撒吝點、霉 iPhomopsis vexans)> ? ^ M iPhomopsis cinnamom)、 蔓綠絨擬莖點霉)、花燭擬莖點霉a/? iAarii )、黃瓜 黑色根腐病菌5?6?το iioiofes )、栗擬莖點霉(/%ο〃?ο/7?·5· cas iaflea )、柿擬 莖點霉(/%〇?〇Asi5· i/iiosAF，)、茴香擬莖點霉/beflicWi)、十字花擬莖點霉 iPhomopsis cruciferae ) > ^β iPhomopsis amygdali ) > ]〇] j#?^M iPhomopsis 仙人掌擬莖點霉(/%ο?ο/7?·5· cacii)、橡膠擬莖點霉(/%ο?ο/7?·5· AeKeae)、小 麥擬莖點9 iPhomopsis con tro versa ) 〇

【具體實施方式】
[0016] 登陸GenBank搜索目前已測定線粒體DNA全序列的60種擬莖點霉RPB1基因，去 掉不完全和部分的序列，尋找保守序列，設計出擴增序列，并在5'端加入測序序列，從而獲 得一對針對擬莖點霉屬真菌RPB1基因的通用引物：其上游引物PhRl-F有43個堿基：CGCC AGGGITTTCCCAGTCACGACTGCAGCAAGGTGTTGGCTG，下游引物 PhRl-R 有 43 個堿基：AGCGGATAAC AATTTCACACAGGAGCGATGTCGTTGTCCATGTA。擴增片斷大小在 750bp 左右。
[0017] 可擴增擬莖點霉屬真菌RPB1基因的通用引物PCR反應體系和反應條件如下： PCR反應體系為25yL，內含2X Taq MasterMix、10yM的引物PhRl-F和引物 PhRl-R、含 50 ?150ng 的 DNA 模板溶液、ddH20。
[0018] 2 X Taq MasterMix 12. 5 μ L PhRl-F lyL PhRl-R lyL Template 1 μ L ddH20 9. 5 μ L 擴增條件為：94°C預變性3min，然后94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸60s，共35 個循環(huán)，最后在72°C充分延伸lOmin。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小、純度 及亮度。
[0019] 本發(fā)明所述的擬莖點霉RPB1基因增引物能擴增擬莖點霉RPB1基因，均能獲得單 一的目的DNA片段，產物大小為750bp左右，并對所有PCR擴增產物進行直接測序。其步驟 為：PCR擴增產物經初步定量后，濃度達lOOng/μ 1的樣品委托公司進行雙向直接測序， 測序引物為M13F-47(10yM)和RV-M(lOyM)，序列分析儀為ΑΒΙ 3730型全自動DNA測序 儀。
[0020] 本發(fā)明的擬莖點霉RPB1基因擴增引物對部分擬莖點霉RPB1基因進行擴增，均能 獲得單一的目的DNA片斷，特異性擴增產物大小為750bp左右，經測序及與GenBank上同 源序列的比較，證實為包含擬莖點霉RPB1基因的擴增產物。其主要擴增的擬莖點霉真菌包 括以下種類： 扁桃擬莖點霉（Phomopsis amygdaliana)、梨干枯擬莖點霉（Phomopsis fukushii)、 大豆擬莖點種腐病菌（Phomopsis longicolla)、蘋果擬莖點菌（Phomopsis mali)、芒果 擬莖點霉（Phomopsis mangiferae)、葉下珠生擬莖點霉（Phomopsis phyllanthicola)、 柿苗擬莖點霉（Phomopsis rojana)、茶潰瘍擬莖點霉（Phomopsis theae)、莖生擬莖點霉 (Phomopsis truncicolaMiura)、石槽干腐菌（Phomopsis versoniana)、葡萄生擬莖點霉菌 (Phomopsis viticola)、蘆輿擬莖點霉（Phomopsis asparagi)、綜竹擬莖點霉（Phomopsis rhapidis)、爺褐紋擬莖點霉（Phomopsis vexans)、樟擬莖點霉（Phomopsis cinnamom)、 蔓綠絨擬莖點霉（Phomopsis philodendri)、花燭擬莖點霉（Phomopsis anthurii)、黃瓜 黑色根腐病菌（Phomopsis sclerotioides)、栗擬莖點霉（Phomopsis castanea)、柿擬 莖點霉（Phomopsis diospyr)、茴香擬莖點霉（Phomopsis foeniculi)、十字花擬莖點霉 (Phomopsis cruciferae)、杏擬莖點霉（Phomopsis amygdali )、苘麻擬莖點霉(Phomopsis abutilonis)、仙人掌擬莖點霉（Phomopsis cacti)、橡膠擬莖點霉（Phomopsis heveae)、小 麥擬莖點霉（Phomopsis controversa)。其電泳圖譜如圖1、圖2所示，從而可對擬莖點霉 真菌進行分析鑒別。
【權利要求】
1. 擬莖點霉RNA聚合酶（RPB1)基因擴增引物，其特征是將測序序列和擴增序列結合在 一起，是一對針對擬莖點霉屬真菌的通用引物，其上游引物PhRl-F有43個堿基：CGCCAGGG ITTTCCCAGTCACGACTGCAGCAAGGTGTTGGCTG ;下游引物 PhRl-R 有 43 個堿基：AGCGGATAACAATT TCACACAGGAGCGATGTCGTTGTCCATGTA。
2. 權利要求1所述擴增引物的設計方法，其特征包括如下步驟： 找出已測定全序列的60種擬莖點霉RPB1基因，去掉不完全和部分序列，進行同源性比 較，尋找保守序列，選取擴增序列，并在5'端加入測序序列，從而獲得一對通用引物。
3. 權利要求1中所述擬莖點霉RNA聚合酶（RPB1)基因擴增引物在種類鑒定、地理種群 鑒別或口岸檢驗檢疫中的應用。
【文檔編號】C12R1/645GK104195262SQ201410491821
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月24日 優(yōu)先權日:2014年9月24日
【發(fā)明者】胡佳續(xù), 郭京澤, 劉鵬, 王金成, 羅加鳳, 廖芳, 黃國明 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心