一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法包括以下步驟：先對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，再對(duì)培養(yǎng)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，然后制備菌懸液，離心，制備待測(cè)樣品溶液，再進(jìn)行DNA提取，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)，觀察檢測(cè)結(jié)果，若電泳檢測(cè)出現(xiàn)唯一一條PCR擴(kuò)增條帶，判斷為陽(yáng)性，若出現(xiàn)了該條帶的同時(shí)也出現(xiàn)了其他條帶，判斷為陰性，且繼續(xù)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行illuminagenomeanalyzer測(cè)序，測(cè)得序列登陸NCBI主頁(yè)進(jìn)行BLAST對(duì)比分析。本發(fā)明先行革蘭氏染色及生物顯微鏡觀察，可對(duì)樣品中乳酸菌進(jìn)行初步篩選與分離鑒定，再采用PCR擴(kuò)增及凝膠電泳從分子水平上對(duì)乳酸菌鑒定其種屬，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。
【專利說(shuō)明】 一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于食品檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0003]凡能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)物乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱為乳酸菌，乳酸菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，根據(jù)其種系進(jìn)化過(guò)程中形成的不同生化指標(biāo)可將其分為:低GC含量組，如乳酸桿菌屬、腸球菌屬及乳酸球菌屬等，高GC含量的雙歧桿菌，這些菌種形態(tài)結(jié)構(gòu)、代謝特征及生理學(xué)特點(diǎn)等均不這完全相同。人類及其他動(dòng)物體內(nèi)如腸道、陰道黏膜等部位均天然存在著乳酸菌。乳酸菌可幫助調(diào)節(jié)腸道微生物平衡，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收，可改善肝功能，防止乳糖不耐癥，還有抗癌及抗衰老等作用。將乳酸菌用于食品中，可提高食品附加值及保藏性。正因?yàn)槿樗峋纳鲜鰞?yōu)點(diǎn)，目前，乳酸菌已作為益生菌在乳制品中廣泛添加，同時(shí)，也廣泛用于藥品領(lǐng)域中。此外，乳酸菌在工業(yè)領(lǐng)域中也有廣泛應(yīng)用，如用其發(fā)酵產(chǎn)生蘋果酸及乳酸來(lái)釀造蘋果酒及葡萄酒。
[0004]雖然乳酸菌在生活各大領(lǐng)域中均有廣泛應(yīng)用，但隨著食物種類的增多，乳酸菌應(yīng)用也帶來(lái)了一系列的安全問(wèn)題，其質(zhì)量問(wèn)題也日益嚴(yán)重化與多樣化。目前，市場(chǎng)上發(fā)酵乳制品種類繁多，且均宣稱含有多種乳酸菌，給消費(fèi)者的選擇及相關(guān)部門的質(zhì)量監(jiān)督均帶來(lái)較大困難。因此，對(duì)食品尤其是發(fā)酵乳制品中的乳酸菌種類進(jìn)行定性檢測(cè)以更好的對(duì)發(fā)酵乳制品進(jìn)行質(zhì)量管理，保障消費(fèi)者的權(quán)利具有重要意義。
[0005]乳酸菌的傳統(tǒng)定性檢測(cè)方法采用生理生化反應(yīng)及選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)計(jì)數(shù)，但這些方法易受培養(yǎng)條件及菌種特性等多種主客觀因素的影響，檢測(cè)過(guò)程費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性及可靠性均較差，因此，將其用于市售發(fā)酵乳制品的大樣本隨機(jī)抽查具有較大的局限性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷提供一種一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
(1)細(xì)菌培養(yǎng):取5-10ml樣品加入10-20ml滅菌水中稀釋震蕩混勻，平板涂片于MRS培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)12-24h,取樣品菌落；
(2)取步驟(I)中取的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)；
(3)將步驟(I)中的菌落加入10-20mlPBS緩沖液中，制成菌懸液，將菌懸液取1.5ml加入離心管中，加入等體積的氯仿，混勻2-5min，離心，取上清液，加無(wú)菌水或TE緩沖液500-700ul混勻重懸，離心，取上清液作為待測(cè)樣品溶液； (4)DNA提取:取步驟(3)中制得的待測(cè)樣品溶液至另一離心管中，采用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍體積的醋酸鈉及I倍體積的異丙醇沉淀DNA，再采用體積濃度為70%-80%的乙醇溶液洗滌沉淀2次，自然干燥，加雙蒸水溶解，得樣品DNA模板；
(5)PCR擴(kuò)增:將步驟(4)中提取的DNA模板進(jìn)行DNA擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系各組分為: 模板 DNA2.0ul;
引物對(duì)2.5ul;
10 X Taq Buffer (Mg2+ plus)2.5ul;
Dntp Mixture2.0ul;
TaKaRa Taq(5U/UL)0.125ul
無(wú)菌離子水加至25ul;
PCR擴(kuò)增程序?yàn)?
94°C變性 5min，94°C 30s, 52°C 45s, 72°C 1.5min，循環(huán) 30 次，最后 72°C退火 1min ;
(6)對(duì)步驟(5)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，觀察檢測(cè)結(jié)果。
[0008]步驟(I)中MRS培養(yǎng)基的組分為:葡萄糖20g，牛肉膏20g，瓊脂15g，蛋白胨10g，酵母提取物5g、乙酸鈉5g、檸檬酸二銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸錳水合物0.8-lg，加蒸餾水至1L，加PH調(diào)節(jié)劑至PH為6.2-6.5，高壓滅菌備用。
[0009]優(yōu)選的，所述的硫酸錳水合物為硫酸錳的硫酸錳四水合物與硫酸錳七水合物的混合物。
[0010]優(yōu)選的，所述的硫酸錳四水合物與硫酸錳七水合物的質(zhì)量比為(0.8-1.2 ):(0.6-1.0)。
[0011]優(yōu)選的，所述的PH調(diào)節(jié)劑選自硫酸、鹽酸、氫氧化鈉或氫氧化鉀中的一種或多種。
[0012]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的恒溫培養(yǎng)溫度為35_40°C。
[0013]優(yōu)選的,步驟(3)中所述的離心速度為8000-10000r/min,離心時(shí)間為5-lOmin。
[0014]優(yōu)選的，步驟(4)中所述的DNA提取液PH為7.8-8.2，其組成為:80-100mol/L的Tris-HCl, 80-100mol/L 的 EDTA，80-1OOmmoI/L 的磷酸鈉，1.0-1.5mol/L 的氯化鈉，0.5-1%的 CTAB。
[0015]步驟(5 )中PCR擴(kuò)增采用的的引物對(duì)為:上下游引物:
F(WLABl):5’-TCCGGKTTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’ ；
R(WLAB2):5’-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3’。
[0016]步驟(2)中乳酸菌鏡下形態(tài)為桿狀或球狀，革蘭氏陽(yáng)性菌。
[0017]步驟(6)中的結(jié)果觀察具體為:電泳檢測(cè)出現(xiàn)唯一一條PCR擴(kuò)增條帶，判斷為陽(yáng)性，若出現(xiàn)了該條帶的同時(shí)也出現(xiàn)了其他條帶，判斷為陰性，此時(shí)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行iIlumina genome analyzer測(cè)序,測(cè)得序列登陸NCBI主頁(yè)進(jìn)行BLAST對(duì)比分析。
[0018]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果:
1.本發(fā)明先將樣品進(jìn)行稀釋后，平板涂片于MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)后的菌落進(jìn)行革蘭氏染色及生物顯微鏡觀察，以對(duì)樣品中乳酸菌進(jìn)行初步篩選與分離鑒定。
[0019]2.目前，國(guó)內(nèi)外允許食品中添加的乳酸菌為雙歧桿菌、乳桿菌、乳球菌等，本發(fā)明先采用細(xì)菌培養(yǎng)及顯微鏡觀察對(duì)樣品乳酸菌進(jìn)行初步篩選，再采用PCR擴(kuò)增及凝膠電泳從分子水平上對(duì)乳酸菌鑒定其種屬，從而判斷樣品中乳酸菌種屬是否為正常添加。
[0020]3.本發(fā)明在傳統(tǒng)的菌落特征等菌體自身特制備待測(cè)樣品溶液時(shí)，先制備菌懸液，經(jīng)多次離心、重懸，可將樣品中乳酸菌更好的提取，從而保證了后續(xù)DNA提取及PCR擴(kuò)增等操作的準(zhǔn)確性。

【具體實(shí)施方式】
[0021]本發(fā)明通過(guò)以下具體實(shí)施例更詳細(xì)的說(shuō)明本發(fā)明，可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面的了解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0022]實(shí)施例1
一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
(1)細(xì)菌培養(yǎng):取5ml樣品加入10-20ml滅菌水中稀釋震蕩混勻，平板涂片于MRS培養(yǎng)基中，35°C恒溫培養(yǎng)12h，取樣品菌落；
(2)取步驟(I)中取的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)；
(3)將步驟(I)中的菌落加入1mlPBS緩沖液中，制成菌懸液，將菌懸液取1.5ml加入離心管中，加入等體積的氯仿，混勻2min,離心，以8000r/min離心5min,取上清液，加無(wú)菌水或TE緩沖液500ul混勻重懸，離心，以8000r/min離心5min，取上清液作為待測(cè)樣品溶液；
(4)DNA提取:取步驟(3)中制得的待測(cè)樣品溶液至另一離心管中，采用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍體積的醋酸鈉及I倍體積的異丙醇沉淀DNA，再采用體積濃度為70%的乙醇溶液洗滌沉淀2次，自然干燥，加雙蒸水溶解，得樣品DNA模板；
(5)PCR擴(kuò)增:將步驟(4)中提取的DNA模板進(jìn)行DNA擴(kuò)增，采用的引物對(duì)為:上下游引物:
F(WLABl):5’-TCCGGKTTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’ ；
R(WLAB2):5’-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3’ ；
(6)對(duì)步驟(5)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，觀察檢測(cè)結(jié)果。
[0023]步驟(I)中MRS培養(yǎng)基的組分為:葡萄糖20g，牛肉膏20g，瓊脂15g，蛋白胨10g，酵母提取物5g、乙酸鈉5g、檸檬酸二銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸錳水合物0.8g，加蒸餾水至1L,加硫酸至PH為6.2，高壓滅菌備用。
[0024]所述的硫酸錳水合物為硫酸錳的硫酸錳四水合物與硫酸錳七水合物的混合物，所述的硫酸錳四水合物與硫酸錳七水合物的質(zhì)量比為0.8: 0.6。
[0025]步驟(4)中所述的DNA提取液PH為7.8-8.2，其組成為:80mol/L的Tris-HCl, 80mol/L 的 EDTA，80mmol/L 的磷酸鈉，1.0moI/L 的氯化鈉，0.5% 的 CTAB。
[0026]觀察步驟(6)中的電泳檢測(cè)結(jié)果。
[0027]實(shí)施例2
一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
(1)細(xì)菌培養(yǎng):取1ml樣品加入20ml滅菌水中稀釋震蕩混勻，平板涂片于MRS培養(yǎng)基中，40°C下恒溫培養(yǎng)24h，取樣品菌落；
(2)取步驟(I)中取的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)；
(3)將步驟(I)中的菌落加入20mlPBS緩沖液中，制成菌懸液，將菌懸液取1.5ml加入離心管中，加入等體積的氯仿，混勻5min，離心，離心速度為10000r/min，離心時(shí)間為lOmin，取上清液，加無(wú)菌水或TE緩沖液700ul混勻重懸，離心，離心速度為10000r/min，離心時(shí)間為lOmin，取上清液作為待測(cè)樣品溶液；
(4)DNA提取:取步驟(3)中制得的待測(cè)樣品溶液至另一離心管中，采用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍體積的醋酸鈉及I倍體積的異丙醇沉淀DNA，再采用體積濃度為80%的乙醇溶液洗滌沉淀2次，自然干燥，加雙蒸水溶解，得樣品DNA模板；
(5)PCR擴(kuò)增:將步驟(4)中提取的DNA模板進(jìn)行DNA擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增采用的的引物對(duì)為:上下游引物:
F(WLABl):5’-TCCGGKTTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’ ；
R(WLAB2):5’-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3’ ；
(6)對(duì)步驟(5)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，觀察檢測(cè)結(jié)果。
[0028]步驟(I)中MRS培養(yǎng)基的組分為:葡萄糖20g，牛肉膏20g，瓊脂15g，蛋白胨10g，酵母提取物5g、乙酸鈉5g、檸檬酸二銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸錳水合物0.8-lg，加蒸餾水至1L，加鹽酸調(diào)至PH為6.2-6.5，高壓滅菌備用。
[0029]步驟(4)中所述的DNA提取液PH為8.2，其組成為:100mol/L的Tris-HCl，10moI/L 的 EDTA，10mmoI/L 的磷酸鈉，1.5mol/L 的氯化鈉，1% 的 CTAB。
[0030]觀察步驟(6 )中的電泳檢測(cè)結(jié)果。
[0031]實(shí)施例3
一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
(1)細(xì)菌培養(yǎng):取8ml樣品加入15ml滅菌水中稀釋震蕩混勻，平板涂片于MRS培養(yǎng)基中，38°C下恒溫培養(yǎng)18h,取樣品菌落；
(2)取步驟(I)中取的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)；
(3)將步驟(I)中的菌落加入15mlPBS緩沖液中，制成菌懸液，將菌懸液取1.5ml加入離心管中，加入等體積的氯仿，混勻3min，離心，離心速度為9000r/min，離心時(shí)間為8min，取上清液，加無(wú)菌水或TE緩沖液600ul混勻重懸，離心，離心速度為9000r/min，離心時(shí)間為8min,取上清液作為待測(cè)樣品溶液；
(4)DNA提取:取步驟(3)中制得的待測(cè)樣品溶液至另一離心管中，采用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍體積的醋酸鈉及I倍體積的異丙醇沉淀DNA，再采用體積濃度為75%的乙醇溶液洗滌沉淀2次，自然干燥，加雙蒸水溶解，得樣品DNA模板；
(5 ) PCR擴(kuò)增:將步驟(4 )中提取的DNA模板進(jìn)行DNA擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增采用的的引物對(duì)為:上下游引物:
F(WLABl):5’-TCCGGKTTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’ ；
R(WLAB2):5’-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3’ ;
(6)對(duì)步驟(5)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，觀察檢測(cè)結(jié)果。
[0032]2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(I)中MRS培養(yǎng)基的組分為:葡萄糖20g，牛肉膏20g，瓊脂15g，蛋白胨10g，酵母提取物5g、乙酸鈉5g、檸檬酸二銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸錳水合物0.8-lg，加蒸餾水至1L，加氫氧化鈉至PH為6.2-6.5，高壓滅菌備用。
[0033]所述的硫酸錳水合物為硫酸錳的硫酸錳四水合物與硫酸錳七水合物的混合物，所述的硫酸錳四水合物與硫酸錳七水合物的質(zhì)量比為1.0:0.8。
[0034]步驟(4)中所述的DNA提取液PH為8.0，其組成為:90mol/L的Tris-HCl，90mol/L 的 EDTA,90mmol/L 的磷酸鈉，1.2mol/L 的氯化鈉，0.8% 的 CTAB0
[0035]觀察步驟(6)中的電泳檢測(cè)結(jié)果。
[0036]以上所述實(shí)施例只是本發(fā)明的較佳實(shí)例，并非來(lái)限制本發(fā)明實(shí)施范圍，故凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所述的構(gòu)造、特征及原理所做的等效變化或修飾，均應(yīng)包括本發(fā)明專利申請(qǐng)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)細(xì)菌培養(yǎng):取5-10ml樣品加入10-20ml滅菌水中稀釋震蕩混勻，平板涂片于MRS培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)12-24h,取樣品菌落； (2)取步驟(I)中取的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)； (3)將步驟(I)中的菌落加入10-20mlPBS緩沖液中，制成菌懸液，將菌懸液取1.5ml加入離心管中，加入等體積的氯仿，混勻2-5min，離心，取上清液，加無(wú)菌水或TE緩沖液500-700ul混勻重懸，離心，取上清液作為待測(cè)樣品溶液； (4)DNA提取:取步驟(3)中制得的待測(cè)樣品溶液至另一離心管中，采用酚氯仿抽提2次，加入0.1倍體積的醋酸鈉及I倍體積的異丙醇沉淀DNA，再采用體積濃度為70%-80%的乙醇溶液洗滌沉淀2次，自然干燥，加雙蒸水溶解，得樣品DNA模板； (5)PCR擴(kuò)增:將步驟(4)中提取的DNA模板進(jìn)行DNA擴(kuò)增； (6)對(duì)步驟(5)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，觀察檢測(cè)結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(I)中MRS培養(yǎng)基的組分為:葡萄糖20g，牛肉膏20g，瓊脂15g，蛋白胨10g，酵母提取物5g、乙酸鈉5g、檸檬酸二銨2g，磷酸氫二鉀2g，硫酸錳水合物0.8-lg，加蒸餾水至1L，加PH調(diào)節(jié)劑至PH為6.2-6.5，高壓滅菌備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的所述的一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的硫酸錳水合物為硫酸錳的硫酸錳四水合物與硫酸錳七水合物的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的所述的一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的硫酸錳四水合物與硫酸錳七水合物的質(zhì)量比為(0.8-1.2): (0.6-1.0)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的PH調(diào)節(jié)劑選自硫酸、鹽酸、氫氧化鈉或氫氧化鉀中的一種或多種。
6.據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(I)中所述的恒溫培養(yǎng)溫度為35-40°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)中所述的離心速度為8000-10000r/min,離心時(shí)間為5_10min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(4)中所述的DNA提取液PH為7.8-8.2，其組成為:80-100mol/L的Tris-HCl, 80-100mol/L 的 EDTA，80-1OOmmoI/L 的磷酸鈉，1.0-1.5mol/L 的氯化鈉，0.5-1%的 CTAB。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(5)中PCR擴(kuò)增采用的的引物對(duì)為:上下游引物:
F(WLABl):5’-TCCGGKTTTATTGGGCGTAAAGCGA-3’ ；
R(WLAB2):5’-TCGAATTAAACCACATGCTCCA-3’。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的一種發(fā)酵乳制品中乳酸菌的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(6)中的結(jié)果觀察具體為:電泳檢測(cè)出現(xiàn)唯一一條PCR擴(kuò)增條帶，判斷為陽(yáng)性，若出現(xiàn)了該條帶的同時(shí)也出現(xiàn)了其他條帶，判斷為陰性，此時(shí)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行illuminagenome analyzer
【文檔編號(hào)】C12R1/225GK104278086SQ201410481205
【公開(kāi)日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月20日
【發(fā)明者】郭狄 申請(qǐng)人:中山鼎晟生物科技有限公司