一種人工設(shè)計(jì)化學(xué)合成的基因及其表達(dá)的多肽產(chǎn)物的制備與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人工設(shè)計(jì)化學(xué)合成的基因artf2及其表達(dá)的多肽產(chǎn)物Artf2的制備與應(yīng)用。所述人工合成基因artf2具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。該基因artf2表達(dá)的多肽產(chǎn)物Artf2具有如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明所述的人工設(shè)計(jì)化學(xué)合成基因artf2的表達(dá)產(chǎn)物——多肽Artf2及其生物制品，無毒、環(huán)保，在促進(jìn)植物生長發(fā)育、增產(chǎn)、增強(qiáng)植物抗逆性及抗病驅(qū)蟲等方面應(yīng)用效果良好，前景廣闊。
【專利說明】一種人工設(shè)計(jì)化學(xué)合成的基因及其表達(dá)的多肽產(chǎn)物的制備 與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種人工設(shè)計(jì)化學(xué)合成的基因及 表達(dá)的多肽產(chǎn)物的制備，以及該基因和表達(dá)的多肽產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和植物改良等方面的應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 基因的研究是生物工程及醫(yī)學(xué)工程的重要課題?；虻膩碓捶譃樽匀淮嬖诤腿斯?合成。至今已有大量自然基因被分離，克隆，并申請了專利。但在2013年6月13日美國 最高法院裁定：人類自身的基因 DNA片段不得申請專利，但人工合成的基因，可受到專利保 護(hù)。
[0003] 人工合成基因發(fā)端于1952年核酸的化學(xué)合成，50年代中期，Khorana等建立并發(fā) 展了磷酸二酯合成法。從上世紀(jì)60年代，DNA連接酶，RNA連接酶等工具酶的發(fā)現(xiàn)，使核酸 人工合成除化學(xué)方法以外，又有了酶促方法。這種酶可以將寡核苷酸片段連接成很長的核 酸鏈，核酸合成的化學(xué)法和酶促法相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)較長核酸片段的人工合成。1972年， Khorana等人合成了相當(dāng)于酵母丙氨酸t(yī)RNA基因規(guī)模的DNA雙鏈，而在1979年首先完成了 包括啟動(dòng)和調(diào)節(jié)順序在內(nèi)的共有207個(gè)堿基對的大腸桿菌酪氨酸校正tRNA全基因序列。
[0004] DNA人工合成技術(shù)逐步成熟以后，很快就應(yīng)用在蛋白質(zhì)和多肽的基因人工合成方 面。自從1977年Itakura完成了人生長激素釋放抑制因子(一個(gè)十四肽的多肽激素）基因 的人工全合成和表達(dá)以后，一系列的蛋白質(zhì)和多肽的基因均相繼利用人工合成，以及半合 成的方法得到，并已獲表達(dá)。
[0005] 多肽是一大類由氨基酸殘基構(gòu)成的無高級結(jié)構(gòu)的生物活性物質(zhì)。它們與蛋白質(zhì)的 最根本區(qū)別不在于氨基酸數(shù)量的多少，而是多肽無高級結(jié)構(gòu)而蛋白質(zhì)有高級結(jié)構(gòu)。生物提 取的多肽具有很強(qiáng)的活性，也叫做活性肽。生物體中產(chǎn)生的多肽的種類成千上萬，如胰島 素，生長激素，干擾素，胸腺素 al，舒緩激肽，腦啡肽等人促紅細(xì)胞生成素，人促血小板生成 素，人神經(jīng)生長因子及白細(xì)胞介素1等，在生物的代謝方面起著重要的作用。人們已經(jīng)分離 出了許多活性多肽并在農(nóng)業(yè)，醫(yī)學(xué)診斷治療，保健方面發(fā)揮了很大的作用。昆蟲受到外界環(huán) 境刺激時(shí)產(chǎn)生大量的具有抗菌活性的陽離子多肽，人們已篩選出百余種抗菌肽，體內(nèi)外實(shí) 驗(yàn)證實(shí)，多個(gè)抗菌肽不僅有很強(qiáng)的殺菌能力還能殺死腫瘤細(xì)胞。蛇毒內(nèi)也存在多種活性多 肽，從蛇毒內(nèi)分離出一個(gè)13個(gè)氨基酸（INKAIAALAKKLL)小肽，其對G+及G-菌均有極強(qiáng)的 殺菌能力?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)中藥的很多有效成分是小分子多肽，比如我國科學(xué)家從大豆內(nèi)加工分 離出的活性多肽，可通過小腸直接吸收，能防治血栓，高血壓和高血脂，還能延緩變老，提高 肌體腫瘤力。從人參、茶葉、銀杏葉等植物內(nèi)也分離出很多用于心血管疾病的小肽。多肽在 診斷試劑中最主要的用途是用作抗原檢測病毒、細(xì)胞、支原體、螺旋體等微生物和囊蟲、錐 蟲等寄生蟲的抗體，多肽抗原比天然微生物或寄生蟲蛋白抗原的特異性強(qiáng)，且易于制備，因 此裝配的檢測試劑，其檢測抗體的假陰性率和本底反應(yīng)都很低，易于臨床應(yīng)用。現(xiàn)在用多肽 抗原裝配的抗體檢測試劑包括：甲、乙、丙、庚或肝病毒、艾滋病病毒、人巨細(xì)胞病毒、單純皰 疹病毒、風(fēng)疹病毒、梅毒螺旋體、囊蟲、錐蟲、萊姆病及類風(fēng)濕等。
[0006] 多肽在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上也有著很重要的作用。首先多肽類物質(zhì)在植物體內(nèi)有傳遞信號 的功能，多肽信號分子在植物的生長發(fā)育和生殖發(fā)育中有重要的調(diào)節(jié)作用。其次多肽可以 提高農(nóng)作物對病害、病毒病、部分蟲害以及不良環(huán)境包括干旱、水澇、冷凍等等的抵抗能力， 多肽的這種功能是通過提高農(nóng)作物自身的免疫能力實(shí)現(xiàn)的，從某種意義上來說，多肽類物 質(zhì)就像農(nóng)作物的保健品。農(nóng)作物在環(huán)境脅迫條件下，能通過調(diào)節(jié)不同基因進(jìn)行適應(yīng)。目前 多肽類產(chǎn)品已經(jīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，如多肽尿素、多肽有機(jī)復(fù)合肥等。這些產(chǎn)品中的多肽，都 是通過酶解的方式從植物蛋白或動(dòng)物蛋白中獲得。我們?nèi)斯ぴO(shè)計(jì)并化學(xué)合成了一個(gè)基因 ari/J?，并通過基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)到了 E. coli. JM109 (DE3)中，進(jìn)而培養(yǎng)、誘導(dǎo)得到了該基因 表達(dá)的多肽產(chǎn)物Artf 2。這種多肽產(chǎn)物可以做成新型生物肥料或生物農(nóng)藥，它對植物主要有 以下作用：（1)促進(jìn)植物的根系發(fā)育，使根系更為發(fā)達(dá)，從而提高植物對土壤中肥料的吸收 利用。（2)使植物葉片顏色加深，葉片變大變厚，能使植物的光合作用顯著加強(qiáng)。（3)可以 調(diào)高植物抗病、抗病毒、抗蟲以及對各種不良環(huán)境的抵抗能力。而且多肽Artf2無毒環(huán)保， 對環(huán)境友好，因此在經(jīng)濟(jì)作物和蔬菜等的綠色生產(chǎn)方面有廣泛的用途。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種人工合成的基因 artf2及其表達(dá)的多肽 Artf2,以及由上述多肽Artf2制得的生物制品在促進(jìn)植物的生長發(fā)育及增產(chǎn)、提高植物的 抗病性、增強(qiáng)植物的抗逆性及驅(qū)蟲性等方面的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明解決上述問題所采用的技術(shù)方案是： 一種人工合成基因 artf2,為下列序列之一 ：1)如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；2) 將SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代、缺失或添加，且與SEQ ID No. 1具有相同編碼產(chǎn)物的核苷酸序列。
[0009] 由上述人工合成基因編碼的多肽Artf2,具有下列氨基酸序列之一 ：1)如SEQ ID No. 2所示的由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列；2)將SEQ ID No. 2所示的 氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且與具有如SEQ ID No. 2所示 的氨基酸序列的多肽活性相同的由SEQ ID No. 2序列衍生的多肽。
[0010] 該人工合成基因 artf2可采用化學(xué)合成方法或PCR擴(kuò)增法制備。
[0011] 化學(xué)合成基于SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或用PCR方法獲得含有SEQ ID No. 1 所示的核苷酸序列或其衍生物，酶切連接該基因 artf2入原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體， 如pET28a或其他類型的表達(dá)載體中。轉(zhuǎn)化重組表達(dá)載體進(jìn)入宿主菌，如：大腸桿菌等，構(gòu)建 基因表達(dá)工程菌。也可將含有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列克隆至植物表達(dá)載體，在植 物中表達(dá)該含SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的多肽等。
[0012] 包含上述基因序列artf2 (S卩，SEQ ID No. 1所示序列）的重組質(zhì)粒。
[0013] 包含上述基因序列artf2 (S卩，SEQ ID No. 1所示序列）的工程菌。在本發(fā)明的一 個(gè)具體實(shí)施例中，提供了一種包含上述基因序列的大腸桿菌。
[0014] 本發(fā)明提供了一種由包含SEQ ID No. 1所示基因序列的工程菌通過發(fā)酵制得的多 肽Artf2。從生物體內(nèi)的器官或分泌物提取多肽的產(chǎn)率低，蛋白水解生產(chǎn)多肽的條件難以控 制，產(chǎn)品多種多樣。因此，本發(fā)明提供包括小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵和大規(guī)模的工業(yè)化發(fā)酵兩種 方式獲得含有SEQ ID No. 2所示序列的多肽Artf2,該方法產(chǎn)率高、獲得的產(chǎn)品純。
[0015] 上述人工合成基因 artf2編碼的多肽Artf2在制備生物制品方面的應(yīng)用。具體如 在制備生物農(nóng)藥、生物肥料等方面的應(yīng)用。在一個(gè)具體實(shí)施例中，通過發(fā)酵獲得具有如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的多肽Artf2或其衍生物，將該多肽Artf2稀釋或者是添加其他物 質(zhì)(如氨基酸、微量元素等，微量元素包括鐵、錳、鋅等）配制后，用作生物農(nóng)藥或生物肥料等 生物制品，通過噴灑、灌根、浸種等方式，促進(jìn)植物的生長發(fā)育、增產(chǎn)、提高植物抵抗病蟲害、 抗逆性等。
[0016] 上述生物制品在下述方面的應(yīng)用：1)促進(jìn)植物生長發(fā)育；2)促進(jìn)植物增產(chǎn)；3)提 高植物的抗病性，具體地，包括提高植物對細(xì)菌、真菌以及病毒的抗性；4)增強(qiáng)植物的抗逆 性，具體地，包括增強(qiáng)植物的抗干旱、抗凍、抗寒以及抗水澇等抗逆性；5)增強(qiáng)植物的驅(qū)蟲 性。包括但不限于使用以下方式對植物施以上述生物制品：噴灑、灌根、浸泡種子等方式。 所述生物制品適用于多種植物，包括但不限于以下植物：蔬菜、茶葉、果樹、花木、糧食等。
[0017] 一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，將上述基因序列artf2 (S卩，SEQ ID No. 1所示序列） 導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物。
[0018] 按照SEQ ID No. 1所示的基因 artf2的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對PCR擴(kuò)增引物，即： 上游引物 Pl :5' - TCGCGGATCCATGGGAGCTTCTCTGCAAAT -3' 下游引物 P2 :5' - CCGCAAGCTTTTAGCTGGAGAGCTTCTTCA -3' 其中，G/GATCC為引物的BamHl限制酶位切點(diǎn)，A/AGCTT為HindIII限制酶位切點(diǎn)。以 artf2為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95°C預(yù)變形2min30sec，再按照95°C 30sec，58°C 30sec，68°C lmin，程序擴(kuò)增共30個(gè)循環(huán)。
[0019] 本發(fā)明獲得的人工合成基因 artf2,具有SEQ ID No. 1所示序列，其編碼區(qū)共有 1029核苷酸（SEQ ID No. 1所示序列的最后3個(gè)核苷酸t(yī)aa，是終止密碼子，不能翻譯氨基 酸)，該基因編碼的多肽產(chǎn)物Artf2,無高級結(jié)構(gòu)，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，共有 343個(gè)氨基酸殘基，分子量為34. 3kda。本發(fā)明中將人工設(shè)計(jì)基因 artf2化學(xué)合成后，經(jīng)PCR 擴(kuò)增，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。將純化產(chǎn)物和經(jīng)限制性酶EcoRV消化處理的pEV 質(zhì)粒進(jìn)行連接，得到pEV-artf2重組質(zhì)粒。然后用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli DH5a， 在加有100mg/L氨芐青霉素（Amp)的LB固體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)生長，通過選擇壓篩選出 陽性克隆菌株E.coli DH5a-pEV-artf2。通過該菌株的培養(yǎng)可源源不斷地提取得到質(zhì)粒 pEV-artf2〇
[0020] 將質(zhì)粒pEV-artf2和pET28a質(zhì)粒用BamHl和HindIII雙酶切，把a(bǔ)rtf2基因克隆 到pET28a中，得到重組質(zhì)粒pET28a-artf2。再用這重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株E. coli JM109(DE3)。 用加有50mg/L卡那霉素（Km)的LB培養(yǎng)基篩選得到陽性克隆的表達(dá)工程菌株E. coli JM109 (DE3)-pET28a-artf2,即，含有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列的工程菌。
[0021] 通過實(shí)驗(yàn)室的小規(guī)模發(fā)酵（50-1000ml三角搖瓶）或者是工業(yè)化的大規(guī)模發(fā)酵(發(fā) 酵罐設(shè)備）制得含有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的多肽Artf2。在實(shí)驗(yàn)室用三角搖瓶 發(fā)酵培養(yǎng)工程菌株E. coli JM109 (DE3)-pET28a-artf2,誘導(dǎo)表達(dá)多肽產(chǎn)物Artf2,誘導(dǎo)劑 IPTG 終濃度 0· 2mM/L。
[0022] 工業(yè)化大規(guī)模制備用2噸發(fā)酵罐設(shè)備。通過供氣，補(bǔ)料，調(diào)酸堿發(fā)酵培養(yǎng)，用IPTG 終濃度0. 5mM/L誘導(dǎo)并制備多肽產(chǎn)物Artf2生物制品。
[0023] 綜上所述，本發(fā)明如SEQ ID No. 1所示的基因序列artf2及其編碼的如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的多肽Artf2,無毒、環(huán)保，在促進(jìn)植物生長發(fā)育、增產(chǎn)、提高植物抗 病性、抗逆性及驅(qū)蟲性等方面應(yīng)用效果良好，前景廣闊。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為多肽Artf2的電泳圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步地的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式 不限于此。
[0026] 本發(fā)明所用的質(zhì)粒和菌株都是商品化購得，其中， 大腸桿菌 E. coli JM109(DE3)，購自 Promega 公司； 大腸桿菌E. coli DH5a購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司； PEV質(zhì)粒由北京普爾普樂生物技術(shù)有限公司提供； pET28a質(zhì)粒購自Promega公司； 本申請發(fā)明人人工設(shè)計(jì)的基因 artf2 (如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列）由北京 普爾普樂生物技術(shù)有限公司用化學(xué)合成的方法合成，具體采用先進(jìn)的PCR的兩步DNA合 成法（PCR-based two-step DNA synthesis (PTDS))，該方法已在 A simple, rapid, high-fidelity and cost-effective PCR-based two-step DNA synthesis method for long gene sequences. Xiong AS et al. (2004a)文獻(xiàn)中有詳盡的描述，在此不再一一贊 述。該合成的基因 artf2經(jīng)ABI公司的3730XL測序儀測序，其核苷酸序列與SEQ ID No. 1 所示的序列相一致。
[0027] 實(shí)施例1 基因 artf2的PCR擴(kuò)增及純化 按照SEQ ID No. 1所示的基因 artf2的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對PCR擴(kuò)增引物，即： 上游引物 Pl :5' - TCGCGGATCCATGGGAGCTTCTCTGCAAAT -3' 下游引物 P2 :5' - CCGCAAGCTTTTAGCTGGAGAGCTTCTTCA -3' 其中，G/GATCC為引物的BamHl限制酶位切點(diǎn)，A/AGCTT為HindIII限制酶位切點(diǎn)。以 artf2為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95°C預(yù)變形2min30sec，再按照95°C 30sec，58°C 30sec，68°C lmin，程序擴(kuò)增共30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。
[0028] 實(shí)施例2 artf2基因克隆菌株的構(gòu)建 對實(shí)施例1中的PCR擴(kuò)增純化產(chǎn)物和經(jīng)限制性酶EcoRV消化的pEV克隆載體進(jìn)行連接， 得到pEV-artf2質(zhì)粒。然后用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli DH5a，通過在加有IOOmg/ L氨芐青霉素（Amp)的LB固體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)生長，通過選擇壓篩選出陽性克隆菌株 E. coli DH5a-pEV_artf2。通過該菌株的培養(yǎng)可源源不斷地提取得到質(zhì)粒pEV_artf2。
[0029] 實(shí)施例3 artf2基因表達(dá)工程菌株的構(gòu)建 將質(zhì)粒pEV-artf2和pET28a質(zhì)粒用BamHl和HindIII雙酶切，把a(bǔ)rtf2基因克隆到 pET28a中，得到重組質(zhì)粒pET28a-artf2。再用這重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coliJM109 (DE3)，用加 有50mg/L卡那霉素（Km)的LB培養(yǎng)基篩選得到陽性克隆的表達(dá)工程菌株E. coliJM109 (DE3) -pET28a-artf2〇
[0030] 實(shí)施例4 artf2基因的表達(dá)及多肽產(chǎn)物Artf2檢測 將表達(dá)工程菌株E. coli JM109 (DE3) -pET28a-artf2在加有Km 50mg/L的LB液體培 養(yǎng)基中37°C震動(dòng)培養(yǎng)至吸光值0D600=0. 7,加入誘導(dǎo)劑IPTG到終濃度0. 5mM，繼續(xù)培養(yǎng)4小 時(shí)。8000rpm離心5分鐘，收集菌體超聲波破碎，12% SDS_PAGE凝膠電泳。凝膠經(jīng)考馬斯亮 藍(lán)染色后，膠版的樣品泳道有一條顯著的34. 3kda條帶。如圖1所示為artf2基因表達(dá)產(chǎn) 物多肽Artf2的條帶，圖中： 泳道2 :標(biāo)準(zhǔn)蛋白，分子量從下往上依次為14. 4、20、31、43、66. 2、97. 2kda ; 泳道3 :標(biāo)準(zhǔn)蛋白，分子量為66. 2和97. 2kda ; 泳道1及泳道4-7 :不同稀釋度的多肽Artf2,以泳道7的發(fā)酵液為1個(gè)單位濃度，泳道 1為1/2濃度發(fā)酵液，泳道4為1/6濃度發(fā)酵液，泳道5為1/4濃度發(fā)酵液，泳道6為1/8濃 度發(fā)酵液。
[0031] 實(shí)施例5 多肽Artf2的發(fā)酵制備及純化 發(fā)酵制備可分為實(shí)驗(yàn)室小量發(fā)酵制備和工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵制備 5. 1實(shí)驗(yàn)室制備：將表達(dá)工程菌種E. coli JM109 (DE3) -pET28a-artf2平皿劃線培養(yǎng) 過夜，挑選生長良好的單菌落接種到50ml或IOOOml三角瓶的液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm 振蕩培養(yǎng)12h，加終濃度0. 2mM IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)。培養(yǎng)液經(jīng)8000rpm離心5min，收集沉淀 的菌體，加緩沖液超聲波破碎，再離心去細(xì)胞碎片，得到較高純度的多肽Artf2。
[0032] 5. 2工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵制備：采用二級或三級發(fā)酵程序，在發(fā)酵罐中加入70%體積 的發(fā)酵培養(yǎng)基：每升含葡萄糖15克，酵母和蛋白胨浸提物20克，硫酸鎂0. 5克，磷酸二氫 鉀1克，磷酸氫二鉀12克，PH7. 2,滅菌30分（120°C，I. IMPa)。按4%體積比接入菌種液， 37 °C發(fā)酵，溶氧（DO)控制在30%左右，氨水調(diào)節(jié)pH在7. 0左右。當(dāng)工程菌進(jìn)入對數(shù)生長后 期，加入誘導(dǎo)劑IPTG至0. 5mM，再誘導(dǎo)發(fā)酵4小時(shí)放罐。發(fā)酵液經(jīng)85°C 10分鐘滅活菌體， 快速降溫并用高壓均質(zhì)破碎機(jī)破碎，添加98%的非活性物質(zhì)(包括鐵、錳、鋅等微量元素以 及氨基酸)，制成多肽Artf 2生物制品。
[0033] 實(shí)施例6 多肽Artf2生物制品的使用方法及效果 上述實(shí)施例5制備的多肽Artf2生物制品可用于植物，尤其是農(nóng)林蔬果方面大面積使 用，使植物的生長發(fā)育、產(chǎn)量、抗病性、抗逆性、驅(qū)蟲性等方面均得到有效提高及增強(qiáng)。
[0034] 以下各項(xiàng)試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組（即采用了多肽Artf2生物制品或多肽Artf2生物制品的 稀釋液）提及的各項(xiàng)性能的提高均是相對于對照組而言，如無特別說明，對照組均是指的采 用與實(shí)驗(yàn)組相同的方法作用于植物，只是將多肽Artf2生物制品替換成清水。
[0035] 6. 1葉面噴灑：在作物生長期都可使用。將本多肽生物制品配成稀釋200-300倍 溶液（多肽Artf2含量約20-30 mg/L)，噴施葉面，每三周一次。可增加植物根莖葉產(chǎn)量 10-30%，提高產(chǎn)量10-25%。其中：大白菜經(jīng)3次噴灑后長勢良好，葉片肥嫩，增產(chǎn)30% ;玉米 幼苗在3片眞葉時(shí)噴灑，10天后，平均株高比對照組玉米幼苗高8-12厘米，產(chǎn)量高出16% ; 蠶豆幼苗噴施后，提前一周開花，座果率提高8-12%，且驅(qū)蚜蟲效果明顯；茶樹每2周噴施一 次，促使側(cè)芽大量萌發(fā)，提高了茶葉產(chǎn)量，增加茶葉的采收次數(shù)，另外噴施了本生物制品的 茶葉不長小葉螨，不僅增加了茶農(nóng)銷售茶葉的收入，而且減少了農(nóng)藥的使用，降低了生產(chǎn)成 本；桑樹每2周噴一次，桑葚肥大甜美，桑葉產(chǎn)量增加14% ;長滿蚜蟲、葉片不能正常展開的 花椒，在噴施本多肽制品的一周左右，蚜蟲絕大多數(shù)消失，葉片恢復(fù)生長；大棚里的蔬菜(西 紅柿和黃瓜）在噴施本品后，紅蜘蛛明顯減少，降低了病毒病的發(fā)生幾率。
[0036] 6. 2植物灌根：采用灌根效果明顯，使用濃度為將本生物制品稀釋200-300倍的溶 液。玉蘭，迎春等經(jīng)灌根后生長速度提高30%，不長蚜蟲，葉片大而厚，枝葉繁茂，開花期提 前，花期增長；大棗灌根后座果率增加，裂果減少，果實(shí)品質(zhì)大幅度提高；對發(fā)生早期炭疽 病的柑橘樹灌根后，控制了炭疽病的繼續(xù)蔓延，產(chǎn)量沒有受到影響；葡萄在發(fā)芽和結(jié)果的整 個(gè)生長期，灌根3-5次，除定期澆水外，不再進(jìn)行其他管理，葡萄產(chǎn)量不僅沒有低于正常管 理的對照組，而且葡萄的品質(zhì)提高，甜度增加；蘭棚里的盆栽蘭花每隔15-20天灌根一次， 莖腐病和軟腐病幾乎不會發(fā)生，且對介殼蟲的防治效果優(yōu)于某種觸殺性的化學(xué)農(nóng)藥。蘭花 葉色深綠，葉面油亮有光澤，商品性增強(qiáng)，大大地提高了養(yǎng)蘭者的經(jīng)濟(jì)效益。落地生根、矮牽 牛經(jīng)灌根，葉片明顯變大變厚，生長速度提高50%以上。
[0037] 6. 3浸種拌種：以本多肽生物制品100-200倍稀釋液浸種2-4小時(shí)。種子經(jīng)處理 后，出苗整齊、根好苗壯，抗病能力顯著增加。例如玉米種子經(jīng)多肽Artf2浸種，出芽率幾乎 達(dá)100%，而對照組的出芽率只有80%，而且幼苗的生長速度和成活率也明顯高于對照。
[0038] 6. 4植物抗干旱：將玉米種子發(fā)芽長出2片真葉，噴灑多肽生物制品200-300倍稀 釋液，2周后停止?jié)菜?0天后對照組(采用與實(shí)驗(yàn)組相同的方式，一組對照為采用清水噴 灑、一組對照為采用培養(yǎng)基噴灑）的植株萎蔫而實(shí)驗(yàn)組植株挺拔，繼續(xù)停止?jié)菜?，待?shí)驗(yàn)組 也發(fā)生萎蔫現(xiàn)象后，恢復(fù)澆水，實(shí)驗(yàn)組大部分植株由萎蔫變?yōu)橥Π?，恢?fù)生長，而兩組對照 組幾乎全部倒苗，表明該多肽制品抗干旱效果明顯。
[0039] 6. 5植物抗病毒：煙草幼苗噴灑3次生物制品200-300倍稀釋液，90%以上植株沒 感染花葉病毒，而對照組只有45%沒感染花葉病毒。
[0040] 6. 6提高植物抗逆性：植物噴施本多肽生物制品200-300倍稀釋液后，對不良環(huán)境 的抵抗能力顯著增強(qiáng)。例如噴施本多肽生物制品200-300倍稀釋液的小麥遭遇干熱風(fēng)后， 產(chǎn)量非但沒有減少反而增產(chǎn)8%左右；噴施本多肽生物制品200-300倍稀釋液的大豆被冰雹 砸壞后，不補(bǔ)苗，其產(chǎn)量和其他沒有施用該生物制品而補(bǔ)苗的大豆產(chǎn)量仍然不相上下。說明 多肽Artf2生物制品對提高植物的抗逆性有著良好的作用。
【權(quán)利要求】
1. 一種人工合成基因 artf2,為下列序列之一 ：1)如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列； 2)將SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)堿基的取代、缺失或添加，且與SEQ ID No. 1具有相同編碼產(chǎn)物的核苷酸序列。
2. 由權(quán)利要求1所述人工合成基因 artf2編碼的多肽Artf2,具有下列氨基酸序列之 一 ：1)如SEQ ID No. 2所示的由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列；2)將 SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且與具有 如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的多肽活性相同的由SEQ ID No. 2序列衍生的多肽。
3. 如權(quán)利要求1所述的人工合成基因 artf2在以下方面的應(yīng)用：1)促進(jìn)植物生長發(fā) 育；2)促進(jìn)植物增產(chǎn)；3)提高植物的抗病性；4)增強(qiáng)植物的抗逆性；5)增強(qiáng)植物的驅(qū)蟲性； 6)轉(zhuǎn)基因植物培育。
4. 包含權(quán)利要求1所述基因序列artf2的重組質(zhì)粒。
5. 包含權(quán)利要求1所述基因序列artf2的工程菌。
6. 如權(quán)利要求2所述的多肽Artf2在制備生物制品方面的應(yīng)用。
7. -種由權(quán)利要求2所述的多肽Artf2制得的生物制品。
8. 如權(quán)利要求7所述的生物制品在下述方面的應(yīng)用：1)促進(jìn)植物生長發(fā)育；2)促進(jìn)植 物增產(chǎn)；3)提高植物的抗病性；4)增強(qiáng)植物的抗逆性；5)增強(qiáng)植物的驅(qū)蟲性。
9. 一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，將如權(quán)利要求1所述基因序列導(dǎo)入目的 植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物。
【文檔編號】C12N15/11GK104212797SQ201410477638
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】張世瑜, 郭魯宏 申請人:張世瑜, 郭魯宏