熒光定量pcr檢測豬主要病毒的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明利用探針熒光定量PCR技術(shù)，分2個體系能從臨床樣品中快速獲取并檢測出多種引起豬繁殖障礙和腹瀉疾病的病毒，A體系檢測豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細(xì)小病毒(PPV)、偽狂犬病病毒(PRV)；B體系檢測豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)。該檢測試劑盒設(shè)計合理，使用方法簡單，快速，準(zhǔn)確，靈敏度高，適合于口岸檢驗檢疫、畜牧業(yè)養(yǎng)殖、動物保護等部門使用，同時具有廣泛的科研價值和商業(yè)前景。
【專利說明】熒光定量PCR檢測豬主要病毒的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種多重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒。
技術(shù)背景
[0002]每年的5月份至10月份，都會爆發(fā)一種以高熱，呼吸困難，食欲下降，部分母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)為特征的豬繁殖障礙性病。該病可傳染各年齡段的豬，發(fā)病率高，死亡率隨病程、繼發(fā)感染發(fā)熱嚴(yán)重程度不同而異，據(jù)估計，嚴(yán)重發(fā)病率群死亡率可達50%。該病來勢兇猛，無特異防治方法，容易繼發(fā)或并發(fā)其他病原微生物導(dǎo)致死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus, PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine productiveand respiratory syndrome virus, PRRSV)、偽狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus, PRV)、豬痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus, PCV)是與豬繁殖障礙密切相關(guān)的5種傳染病病原菌。并且常?；旌细腥?，有時又伴有細(xì)菌(如鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌)和血液原蟲(如附紅細(xì)胞體、弓形體)的并發(fā)或繼發(fā)感染。還會導(dǎo)致腹瀉等情況的發(fā)生。
[0003]豬圓環(huán)病毒(PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是目前已知的最小的動物病毒。PCV分兩個亞型，PCV-1型無致病性，PCV-2型感染主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)。PCV-2 感染與豬群中發(fā)生的許多新傳染病密切相關(guān)，包括豬間質(zhì)性肺炎、豬皮炎腎病綜合征、母豬繁殖障礙以及仔豬先天性顫抖等，這些病總稱為豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirus associated diseases,PCVAD)。PCVAD作為一種新的病毒病在許多國家廣泛流行，僅PMWS每年對歐洲養(yǎng)豬業(yè)造成的損失高達6億歐元。目前，PCV-2感染在我國豬群中普遍存在，能夠引起免疫抑制、混合感染和繼發(fā)感染，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。
[0004]豬細(xì)小病毒(PPV)屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬成員，是引起母豬繁殖障礙性疾病的主要病原之一。PPV在世界各地普遍存在，可引起懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、胎兒木乃伊化等，我國于20世紀(jì)80年代初在不同區(qū)分離得到了豬細(xì)小病毒，調(diào)查顯示，絕大多數(shù)豬場均存在PPV的感染。近地年來，PPV感染呈擴大上升趨勢，并呈現(xiàn)出許多新的流行特點，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。研究發(fā)現(xiàn)，該病毒除了能直接導(dǎo)致豬生殖缺陷外，還可在豬圓環(huán)病毒2型引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)的臨床感染中扮演重要角色。
[0005]偽狂犬病病毒(PRV)屬于皰疫病毒科α皰疫病毒亞科，可以感染多種家畜和野生動物。豬是PRV的天然宿主，感染后可引發(fā)母豬繁殖障礙，仔豬大量死亡，公豬失去種用能力等。根據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界己有40多個國家和地區(qū)報道發(fā)生過本病，我國自1947年首次報道以來，現(xiàn)己擴展到全國二十幾個省市，給我國畜牧業(yè)特別是養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，目前本病己成為當(dāng)前我國乃至世界各國豬病研究和防制的重點之一。
[0006]豬瘟病毒(CSFV)是豬瘟的病原，屬于黃病毒科瘟病毒屬成員。豬瘟是遍布于全世界性范圍內(nèi)的一種高度接觸性傳染病，早在19世紀(jì)初期就有關(guān)于豬瘟的報道，世界各國在對該病的防控上做出了巨大的努力，而且在北美、澳洲和北歐的一些地區(qū)曾成功地消滅了豬瘟，我國自20世紀(jì)20年代發(fā)生第I例豬瘟后，由于豬瘟兔化弱毒疫苗的廣泛應(yīng)用，已多年未大面積暴發(fā)豬瘟。但近年來，原已宣布消滅了豬瘟的歐洲一些國家又相繼復(fù)發(fā)豬瘟，我國豬瘟的發(fā)病率亦呈上升趨勢，且流行和發(fā)病特點發(fā)生了很大變化，呈非典型化態(tài)勢，臨床上主要表現(xiàn)為隱性帶毒和慢性感染，成為影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的一大隱患，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。
[0007]豬藍耳病，又稱“豬繁殖與呼吸綜合癥”(PRRS)是由PRRSV引起的以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸哀竭為主要癥狀的傳染病，該病自20世紀(jì)80年代末期開始流行，遍布世界各個養(yǎng)豬國家，造成極大的經(jīng)濟損失。該病在我國普遍存在，且近年來呈流行態(tài)勢。
[0008]以上5種病原均可不同程度地引起豬繁殖性障礙，并且常?；旌细腥?。僅憑臨床癥狀、病理變化、流行病學(xué)調(diào)查很難作出準(zhǔn)確診斷，尤其是在發(fā)病的早期或潛伏期診斷更加困難，而且上述疾病的發(fā)生使對其它疾病如豬流行性腹瀉的診斷變得復(fù)雜和困難。豬流行性腹灣(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹?寫病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV)引起豬的一種以嘔吐、腹灣和脫水為主要特征的腸道傳染病。該病以7日齡以內(nèi)仔豬發(fā)病為主，病程短、傳播迅速、仔豬死亡率極高，可達100%。1978年，比利時和英國首次報道PEDV疫情，1984年，我國證實該病的存在。在2010-2012年中國不同地區(qū)均有PEDV大暴發(fā)的報道，造成哺乳仔豬大量死亡，嚴(yán)重影響了我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。因此，建立一種特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、能同時檢測多種病原的檢測方法和檢測試劑盒對豬呼吸和繁殖障礙疾病的診斷和防治具有重要意義。國內(nèi)外獸醫(yī)工作者建立了許多用于檢測豬病原的方法，其中包括:電子顯微鏡技術(shù)、病毒分離培養(yǎng)試驗、動物接種試驗、免疫熒光試驗、間接免疫熒光試驗、各種免疫組織化學(xué)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法、血清學(xué)診斷方法及原位雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain react1n, PCR)分子生物學(xué)方法等。對一個病原使用所有的診斷方法是不可行的，不同的病原需要使用最合適的診斷方法。但總的來說，上述這些方法都存在許多明顯的不足之處，病毒分離耗時長，熒光抗體檢測靈敏度不是很高，ELISA和血清學(xué)方法只能檢測抗體，不適合早期診斷。實時熒光定量PCR (Real time fluorescent quantitative PCR, Real-time QPCR)技術(shù)自誕生之日起，就以其操作簡單、快速方便、靈敏度高、重復(fù)性好、污染率低等眾多優(yōu)點，而被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、藥物研發(fā)、臨床診斷、轉(zhuǎn)基因研究、基因檢測等各個領(lǐng)域研究當(dāng)中，已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的一項常規(guī)技術(shù)。因此，基于多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)建立起特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、能檢測這6種病原的檢測方法和檢測試劑盒對豬繁殖障礙和腹瀉疾病的診斷和防治具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能快速，準(zhǔn)確性高，靈敏，經(jīng)濟的檢測豬細(xì)小病毒PPV、豬流行性腹瀉病毒PEDV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV、偽狂犬病病毒PRV、豬瘟病毒CSFV、豬圓環(huán)病毒PCV等6種引起豬繁殖障礙或腹瀉疾病的病毒的檢測試劑盒。
[0010]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明針對各國的養(yǎng)豬業(yè)病毒感染的檢測問題，提供了相應(yīng)的檢測試劑盒，包括能擴增100-200bp片段的引物，帶有不同熒光基團的探針，A和B兩個多重?zé)晒釺aqMan探針PCR擴增體系反應(yīng)液，豬細(xì)小病毒PPV標(biāo)準(zhǔn)品、豬流行性腹瀉病毒PEDV標(biāo)準(zhǔn)品、豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV標(biāo)準(zhǔn)品、偽狂犬病病毒PRV標(biāo)準(zhǔn)品、豬瘟病毒CSFV標(biāo)準(zhǔn)品、豬圓環(huán)病毒PCV標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照品。
[0011]具體而言，本發(fā)明提供了熒光定量PCR檢測豬主要病毒的試劑盒，包括如下2套體系:
[0012]體系A(chǔ)，包括如下3對引物和如下對應(yīng)的3條探針:
[0013]一、
[0014]上游引物PCV 病毒一PR: 5’ -CAGCACCCTGTAACGTTTGTC-3’
[0015]下游引物PCV 病毒一PR: 5’ -TTAGTCTTCCAATCACGCTTCTG-3，
[0016]特異性PCV 病毒 TaqMan 熒光探針一P:5’-HEX-TTTCCCGCTCACGTTCAAAAGTTCAG-BHQ1-3，；
[0017]二、
[0018]上游引物PRV 病毒一PR: 5’ -CACGCCGATGTGGTGGA-3’
[0019]下游引物PRV 病毒一PR: 5’ -GGTACTGGCCCTCGTTGAA-3’
[0020]特異性PRV 病毒 TaqMan 熒光探針一P:5，-ROX-ACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAG-BHQ2-3，；
[0021]三、
[0022]上游引物PPV 病毒一PR: 5’ -GCTTTAGCCTTGGAGCCGT-3’
[0023]下游引物PPV 病毒一PR: 5’ -AAGCAGGCTCTTATGTCGGTT-3’
[0024]特異性PPV 病毒 TaqMan 熒光探針一 P: 5 ’ -FAM-TGGAGCGAGCCAACAACACCAACTT -BHQ1-3，；
[0025]體系B，包括如下3對引物和如下對應(yīng)的3條探針:
[0026]一、
[0027]上游引物CSFV 病毒一PR: 5’ -GCTCCCTGGGTGGTCTAAG-3’
[0028]下游引物CSFV 病毒一PR: 5’ -CTCGTCCACATAGCATCTCG-3’
[0029]特異性CSFV 病毒 TaqMan 熒光探針一P:5，-FAM-CCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCG-BHQ1-3，；
[0030]二、
[0031]上游引物PRRSV 病毒一PR: 5’ -TCAGCCATAGAAACCTGGAAAT-3’
[0032]下游引物PRRSV 病毒一PR: 5’ -ACGACAAATGCGTGGTTATCA-3’
[0033]特異性PRRSV 病毒 TaqMan 熒光探針一P: 5 ’ -HEX-ACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGC-BHQ1-3，；
[0034]三、
[0035]上游引物PEDV 病毒一PR: 5’ -TGGCATTTCTACTACCTCG-3’
[0036]下游引物PEDV 病毒一PR: 5’ -AGTGGGTTCAGTCTTTGC-3’
[0037]特異性PEDV 病毒 TaqMan 熒光探針一P:5’ -ROX-CGAGTCCTATAACGGAGGTCGGCG -BHQ2-3，。
[0038]作為本發(fā)明的熒光定量PCR檢測豬主要病毒的試劑盒的改進:
[0039]試劑盒還包括A和B兩個多重突光TaqMan探針PCR擴增體系反應(yīng)液,豬細(xì)小病毒PPV標(biāo)準(zhǔn)品、豬流行性腹瀉病毒PEDV標(biāo)準(zhǔn)品、豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV標(biāo)準(zhǔn)品、偽狂犬病病毒PRV標(biāo)準(zhǔn)品、豬瘟病毒CSFV標(biāo)準(zhǔn)品、豬圓環(huán)病毒PCV標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對照品、陰性對照品。
[0040]作為本發(fā)明的熒光定量PCR檢測豬主要病毒的試劑盒的進一步改進:
[0041 ] 多重?zé)晒馓结楶CR擴增體系反應(yīng)液A含有PCR反應(yīng)緩沖液，病毒PCV2、PPV、PRV的特異性引物，病毒PCV2、PPV、PRV的TaqMan熒光探針；
[0042]多重?zé)晒馓结楶CR擴增體系反應(yīng)液B含有PCR反應(yīng)緩沖液，病毒CSFV、PRRSV、PEDV的特異性引物，和病毒CSFV、PRRSV, PEDV的TaqMan熒光探針。
[0043]作為本發(fā)明的熒光定量PCR檢測豬主要病毒的試劑盒的進一步改進:
[0044]PCV(PCV2)的標(biāo)準(zhǔn)品序列:GAGCACCCTGTAACGTTTGTCAGATTTCCCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGAGCGGGAAAATGCAGAAGCGTGATTGGAAGACTAA ；
[0045]PPV 的標(biāo)準(zhǔn)品序列:GCTTTAGCCTTGGAGCCGTGGAGCGAGCCAACAACACCAACTTTCACCAACCTGCACTTAACTCCAACACCGCCAGATTCAGCAATACGGACACCAAGTCCAACTTGGTCAGAAATAGAAACCGACATAAGAGCCTGCTT ；
[0046]PRV 的標(biāo)準(zhǔn)序列:CACGCCGATGTGGTGGACCCCGTCCGCGGACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAGCTGGGGCTGCTCATGGTGGCCCCGGGGCGGTTCAACGAGGGCCAGTACC ；
[0047]CSFV 的標(biāo)準(zhǔn)序列:GCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAG ；
[0048]PRRSV 的標(biāo)準(zhǔn)序列:TCAGCCATAGAAACCTGGAAATTCATCACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCGTGCCCACCACGTTGAAAGTGCCGCAGGCTTTCATCCGATTGCGGCAAATGATAACCACGCATTTGTCGT ；
[0049]PEDV 的標(biāo)準(zhǔn)序列:TGGCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGCCGACCTCCGTTATAGGACTCGTACTGAGGGTGTTTTCTGGGTTGCTAAAGAAGGCGCAAAGACTGAACCCACT。
[0050]作為本發(fā)明的熒光定量PCR檢測豬主要病毒的試劑盒的進一步改進:所述陰性對照為高溫高壓滅菌的焦碳酸二乙酯處理水，陽性對照為PCV2、PPV、PRV、PRRSV, CSFV, PEDV的陽性質(zhì)粒樣品。
[0051]陰性對照為高溫高壓滅菌的焦碳酸二乙酯處理水，陽性對照為PCV2、PPV、PRRSV,CSFV的陽性質(zhì)粒樣品。
[0052]備注說明:陽性對照為PCV2、PPV、PRV、PRRSV, CSFV, PEDV的陽性質(zhì)粒樣品保存于-20度，盡量減少反復(fù)凍融。即，本發(fā)明的試劑盒，保存于-20度，盡量減少反復(fù)凍融。
[0053]本發(fā)明還同時提供了上述試劑盒在檢測PCV2、PPV、PRV、PRRSV、CSFV、PEDV中的應(yīng)用。
[0054]本發(fā)明進一步具體而言:
[0055]I)多重?zé)晒馓结楶CR擴增體系反應(yīng)液A含有PCR反應(yīng)緩沖液、病毒PCV，PPV, PRV的特異性引物、病毒PCV，PPV, PRV的TaqMan熒光探針組成；多重?zé)晒馓结楶CR擴增體系反應(yīng)液B含有PCR反應(yīng)緩沖液、病毒CSFV，PRRSV, PEDV的特異性引物和TaqMan熒光探針組成。
[0056]2) PCR緩沖液包括Tris-HCl緩沖液、MgCl2, dNTPs和耐熱TaqDNA聚合酶。
[0057]3)、多重?zé)晒舛縍T-PCR檢測用上游引物和下游引物以及相應(yīng)的特異性TaqMan突光探針序列，如上所述。
[0058]本發(fā)明的檢測試劑盒的使用方法:
[0059]每次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照。標(biāo)準(zhǔn)品用無菌雙蒸水稀釋為I X 12?I X 16Copies/ μ L。
[0060]RNA/DNA病毒樣品提取:根據(jù)產(chǎn)品使用說明書，用病毒RNA/DNA抽提試劑盒Ezol (TAKARA)從細(xì)胞株、新鮮或冷凍的樣本提取病毒核酸。
[0061]反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):在無RNase的0.2ml PCR管中依次加入上一步驟制備的總RNA/DNA模板0.5 μ L和1.75 μ L DEPC-H2O, 70°C變性5min，冰上放置3min，加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(即，加入終濃度為IXM-MuLV緩沖液，dNTPs 0.1mM, M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶50U，RNase抑制劑10U，隨機引物0.5uM)，補水至總體積5μ L?；靹蚝箅x心在42°C下反應(yīng)60min，70°C反應(yīng)lOmin，待反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，所得反應(yīng)液即為cDNA/DNA模板。
[0062]核酸的檢測例如為:取4 μ L已抽提的待測樣品核酸cDNA/DNA為模板分別進行A和B多重?zé)晒釶CR反應(yīng)，其中A多重?zé)晒釶CR體系1XPCR buffer 5μ L,25mM MgCl25 μ L,2.5mM dNTPl.5μ L,即 PCV、PPV 和 PRV 上下游引物各 2 μ L(濃度均為 10 μ Μ)，PCV、PPV和PRV三種探針各I μ L (濃度均為10 μ Μ)，Taq DNA Polymerase 2U，加ddH20至反應(yīng)體系總體積為 50 μ L ;B 多重?zé)晒?PCR 體系 10XPCR buffer 5 μ L, 25mM MgCl25 μ L, 2.5mMdNTP1.5 μ L,CSFV,PEDV 和 PRRSV 上下游引物各 2 μ L(濃度均為 10 μ Μ) ,CSFV,PEDV 和 PRRSV 三種探針各I μ L (濃度均為10 μ Μ)，Taq DNA Polymerase 2U，加ddH20至反應(yīng)體系總體積為50 μ L ;反應(yīng)參數(shù)為:95°C 3min ；95°C 15s，60°C lmin，共 40 個循環(huán)。
[0063]多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系A(chǔ) (總反應(yīng)體積50 μ L):cDNA/DNA模板4 μ L ; 10 XPCRbuffer5 μ L, 25mM MgCl25 μ L, dNTP (25mM) 1.5 μ L，Taq DNA Polymerase 2U, PCV2、PPV 和PRV 引物(10 μ M)各 2yL，相應(yīng) 3 種探針(10mM/L)各 lyL，#Sdd H2O 至 50 μ L。
[0064]反應(yīng)在ABI7300熒光定量儀上進行，擴增程序為95°C 5min ；40個循環(huán):95°C 30s，56°C 30s, 72°C 31s。
[0065]多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系B (總反應(yīng)體積50 μ L):cDNA/DNA模板4 μ L ; 10 XPCRbuffer5 μ L, 25mM MgCl25 μ L, dNTP (1mM) 1.5 μ L，Taq DNA Polymerase 2U, CSFV、PRRSV和 PEDV 引物(10 μ M)各 2yL，相應(yīng) 3 種探針(10mM/L)各 lyL，#Sdd H2O 至 50 μ L。
[0066]反應(yīng)在ABI7300熒光定量儀上進行，擴增程序為95°C 5min ；40個循環(huán):95°C 30s，56°C 30s, 72°C 31s。
[0067]突光定量結(jié)果報告:
[0068]I) PCV、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV 和 PRV 的擴增曲線 Ct (threshold cycle，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到所設(shè)的閾值時所經(jīng)歷的擴增循環(huán)數(shù))均等于40.0，則判為陰性標(biāo)本。
[0069]2)如果其中PCV、PPV、PRRSV, CSFV, PEDV和PRV相應(yīng)擴增曲線的Ct值彡35的標(biāo)本，則檢測結(jié)果對應(yīng)于該種病毒為陽性，即待測樣品攜帶相應(yīng)病毒；
[0070]3) Ct值在35?40區(qū)間為灰色區(qū)域，重做后大于37，則判為陰性。
[0071]4)如果檢測結(jié)果為陽性，根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測樣品CT值，計算待測標(biāo)本病毒 copies/ μ L。
[0072]采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明的試劑盒的技術(shù)進步在于:(1)設(shè)計出了能檢測豬6種重要病毒的多重實時熒光PCR檢測的探針，克服了現(xiàn)有的分子檢測方法操作復(fù)雜，靈敏度不高，特異性不強，重復(fù)性不好等缺點。(2)本發(fā)明的多重實時熒光PCR檢測方法能通過同時檢測豬6種重要病毒病原，并且能夠進行大量的樣品檢測。(3)本發(fā)明不僅可以定性檢測PCV, PPV, PRV, PRRSV, PEDV和CSFV，還可以通過分析標(biāo)準(zhǔn)曲線來判斷各種病毒在樣品中的含量。(4)本發(fā)明具有很高的靈敏度，可以檢測出樣本中10個拷貝數(shù)的相關(guān)病毒。(5)本發(fā)明檢測快速，特異性強，除了探針，其余試劑均是國內(nèi)生物公司的普通PCR產(chǎn)品，在提高豬病毒檢測技術(shù)水平的同時,也大大節(jié)約了成本。
[0073]綜上所述，本發(fā)明具體利用探針熒光定量PCR技術(shù)，分2個體系能從臨床樣品中快速獲取并檢測出多種引起豬繁殖障礙和腹瀉疾病的病毒的應(yīng)用試劑盒，A體系檢測豬圓環(huán)病毒 2 型(Porcine circovirus type 2, PCV2)、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus, PPV)、偽狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus, PRV) ;B體系檢測豬流行性腹?寫病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine productive and respiratorysyndrome virus, PRRSV)、豬痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)。該檢測試劑盒設(shè)計合理具有方法簡單，快速，準(zhǔn)確，靈敏度高，適合于口岸檢驗檢疫、畜牧業(yè)養(yǎng)殖、動物保護等部門使用，同時具有廣泛的科研價值和商業(yè)前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0074]圖1是試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。
[0075]圖2a和圖2b是兩個多重?zé)晒舛縋CR體系檢測的實例。
[0076]圖3?圖8分別豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒的靈敏度。
[0077]從左至右分別是16、ΙΟ5、ΙΟ4、103、12、1copies/ μ L。

【具體實施方式】
[0078]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行進一步說明，但對本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。
[0079]實施例1
[0080]參見圖1，多重實時熒光定量PCR檢測試劑盒，由定量PCR反應(yīng)液1，豬圓環(huán)病毒2型PCV2標(biāo)準(zhǔn)品2、偽狂犬病毒PRV標(biāo)準(zhǔn)品3、豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV標(biāo)準(zhǔn)品4、豬瘟病毒CSFV標(biāo)準(zhǔn)品5、豬細(xì)小病毒PPV標(biāo)準(zhǔn)品6、豬流行性腹瀉病毒PEDV標(biāo)準(zhǔn)品7、陽性對照品8、陰性對照品9、盒體10組成。
[0081]盒體10設(shè)有容器孔，分別放置定量PCR反應(yīng)液1，豬圓環(huán)病毒2型PCV2標(biāo)準(zhǔn)品2、偽狂犬病毒PRV標(biāo)準(zhǔn)品3、豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV標(biāo)準(zhǔn)品4、豬瘟病毒CSFV標(biāo)準(zhǔn)品5、豬細(xì)小病毒PPV標(biāo)準(zhǔn)品6、豬流行性腹瀉病毒PEDV標(biāo)準(zhǔn)品7、陽性對照品8、陰性對照品9 ;其中定量PCR反應(yīng)液A和B單管分裝，矩陣排列，熒光定量PCR反應(yīng)液A含有PCR反應(yīng)緩沖液(含氯化錳和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物，耐熱TaqDNA聚合酶等)4管(標(biāo)記為★)、熒光定量PCR反應(yīng)A的三種病毒的特異性引物(上下游引物同管裝)為4管(標(biāo)記為?)、相應(yīng)的三種熒光探針為4管(標(biāo)記為▲);熒光定量PCR反應(yīng)液B含有PCR反應(yīng)緩沖液(含氯化錳和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物，耐熱TaqDNA聚合酶等)4管(標(biāo)記為☆)熒光定量PCR反應(yīng)B的三種病毒的特異性引物(上下游引物同管裝)為4管(標(biāo)記為O )、相應(yīng)的三種熒光探針為4管(標(biāo)記為Λ)。
[0082]實施例2
[0083]I試驗材料與方法
[0084]1.1毒株豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒各一株。
[0085]1.2待檢樣品60份血清和13份糞便樣品分別采集自福建、上海、浙江等地的豬場；
[0086]1.3引物與探針
[0087]從美國的NCBI基因庫上下載了世界各地的豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒基因序列。對其進行了同源性比較，在對應(yīng)病毒基因組的保守基因區(qū)設(shè)計特異性引物與TaqMan探針，序列如下:
[0088]上游引物PCV 病毒一PR: 5’ -CAGCACCCTGTAACGTTTGTC-3’
[0089]下游引物PCV 病毒一PR: 5，-TTAGTCTTCCAATCACGCTTCTG-3，
[0090]特異性PCV 病毒 TaqMan 熒光探針一P:5’ -HEX-TTTCCCGCTCACGTTCAAAAGTTCAG-BHQ1-3，；
[0091]上游引物PRV 病毒一PR: 5’ -CACGCCGATGTGGTGGA-3’
[0092]下游引物PRV 病毒一PR: 5’ -GGTACTGGCCCTCGTTGAA-3’
[0093]特異性PRV 病毒 TaqMan 熒光探針一P:5，-ROX-ACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAG-BHQ2-3，；
[0094]上游引物PPV 病毒一PR: 5’ -GCTTTAGCCTTGGAGCCGT-3’
[0095]下游引物PPV 病毒一PR: 5’ -AAGCAGGCTCTTATGTCGGTT-3’
[0096]特異性PPV 病毒 TaqMan 熒光探針一P: 5 ’ -FAM-TGGAGCGAGCCAACAACACCAACTT -BHQ1-3，
[0097]上游引物CSFV 病毒一PR: 5’ -GCTCCCTGGGTGGTCTAAG-3’
[0098]下游引物CSFV 病毒一PR: 5’ -CTCGTCCACATAGCATCTCG-3’
[0099]特異性CSFV 病毒 TaqMan 熒光探針一P:5，-FAM-CCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCG-BHQ1-3，；
[0100]上游引物PRRSV 病毒一PR: 5’ -TCAGCCATAGAAACCTGGAAAT-3’
[0101]下游引物PRRSV 病毒一PR: 5’ -ACGACAAATGCGTGGTTATCA-3’
[0102]特異性PRRSV 病毒 TaqMan 熒光探針一P: 5 ’ -HEX-ACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGC-BHQ1-3，；
[0103]上游引物PEDV 病毒一PR: 5’ -TGGCATTTCTACTACCTCG-3’
[0104]下游引物PEDV 病毒一PR: 5’ -AGTGGGTTCAGTCTTTGC-3’
[0105]特異性PEDV 病毒 TaqMan 熒光探針一P:5’ -ROX-CGAGTCCTATAACGGAGGTCGGCG -BHQ2-3，。
[0106]引物和探針委托生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0107]1.4病毒核酸的提取:
[0108]RNA/DNA病毒樣品提取:根據(jù)產(chǎn)品使用說明書，用病毒RNA/DNA抽提試劑盒Ezol (TAKARA)從細(xì)胞株、新鮮或冷凍的樣本提取病毒核酸。
[0109]反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):在無RNase的0.2ml PCR管中依次加入上一步驟制備的總RNA/DNA模板0.5 μ L和1.75 μ L DEPC-H2O, 70°C變性5min，冰上放置3min，加入終濃度為IxM-MuLV緩沖液，dNTPs 0.1mM, M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶50U，RNase抑制劑10U，隨機引物0.5uM，補水至總體積5yL?；靹蚝箅x心在42°C下反應(yīng)60min，70°C反應(yīng)lOmin，待反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，所得反應(yīng)液即為cDNA/DNA模板。
[0110]1.5熒光PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化:
[0111]試劑盒:
[0112]多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系A(chǔ) (總反應(yīng)體積50 μ L):cDNA/DNA模板4 μ L ; 10 XPCRbuffer5 μ L, 25mM MgCl25 μ L, dNTP (25mM) 1.5 μ L，Taq DNA Polymerase 2U, PCV2、PPV 和PRV 引物(10 μ M)各 2yL，相應(yīng) 3 種探針(10mM/L)各 lyL，#Sdd H2O 至 50 μ L。
[0113]同時設(shè)一陰性對照。S卩，以高溫高壓滅菌的焦碳酸二乙酯處理水替代上述cDNA模板，體積量不變。
[0114]反應(yīng)在ABI7300熒光定量儀上進行，擴增程序為95°C 5min ；40個循環(huán):95°C 30s，56°C 30s, 72°C 31s。
[0115]多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系B (總反應(yīng)體積50 μ L):cDNA/DNA模板4 μ L ; 10 XPCRbuffer5 μ L, 25mM MgCl25 μ L, dNTP (1mM) 1.5 μ L，Taq DNA Polymerase 2U, CSFV、PRRSV和 PEDV 引物(10 μ M)各 2yL，相應(yīng) 3 種探針(10mM/L)各 lyL，#Sdd H2O 至 50 μ L。
[0116]同時設(shè)一陰性對照。S卩，以高溫高壓滅菌的焦碳酸二乙酯處理水替代上述cDNA模板，體積量不變。
[0117]反應(yīng)在ABI7300熒光定量儀上進行，擴增程序為95°C 5min ；40個循環(huán):95°C 30s，56°C 30s, 72°C 31s。
[0118]結(jié)果判斷:選擇熒光檢測模式FAM、HEX、R0X、熒光基線調(diào)整取3_15個循環(huán)的熒光信號平均值，閾值設(shè)定以閾值線剛好超過正常陰性對照品的最高點，樣本呈典型的擴增曲線，判斷為陽性。無典型的擴增曲線，判斷為陰性。體系的優(yōu)化實驗，以相同濃度陽性核酸為模板反應(yīng)體系中，引物濃度從0.1?1.00μΜ,探針濃度從0.1?0.50μΜ,采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，根據(jù)最低Ct值和最高熒光強度增加值(ARn)選擇最佳引物和探針濃度。
[0119]1.6熒光PCR特異性、靈敏度和重復(fù)性試驗
[0120]選擇豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)品和采集的豬臨床樣品，對上述臨床樣本提取核酸，分別用多重?zé)晒舛縋CR A和B進行檢測，驗證方法的特異性；對已標(biāo)定拷貝數(shù)的豬圓環(huán)病毒2型(I X 16Copies/μ L)，偽狂犬病毒(I X 16Copies/μ L)，豬流行性腹瀉病毒(I X 16Copies/μ L)，豬細(xì)小病毒(I X 16Copies/μ L)，豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒(I X 16Copies/μ L)和豬瘟病毒(I X 16Copies/μ L)分別稀釋后，平行進行熒光PCR反應(yīng)，比較其靈敏度。此外，對每個濃度的病毒核酸稀釋液作3次重復(fù)檢測，得到的Ct值計算標(biāo)準(zhǔn)差，驗證方法的重復(fù)性。
[0121]2 結(jié)果
[0122]2.1
[0123]特異性試驗
[0124]本發(fā)明建立的多重?zé)晒釶CR反應(yīng)A方法對豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒具有較好的特異性，采集的樣本也檢測出陽性反應(yīng)。而與豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒等均無交叉反應(yīng)。具體如圖2a所示，圖2中A為豬圓環(huán)病毒2型的擴增曲線、B為豬細(xì)小病毒的擴增曲線、C為偽狂犬病毒；而豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和陰性對照均無明顯擴增曲線。
[0125]多重?zé)晒釶CR反應(yīng)B方法對具有較好的特異性，采集的樣本也檢測出陽性反應(yīng)。而與其他病毒如豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒、豬傳染性胃腸炎病毒等均無交叉反應(yīng)。結(jié)果參見圖2b，D為豬瘟病毒的擴增曲線、E為豬繁殖與呼吸綜合征病毒的擴增曲線、F為豬流行性腹瀉病毒。而豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和陰性對照均無明顯擴增所得曲線。
[0126]2.2靈敏度試驗
[0127]分別將豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒稀釋后，用熒光PCR方法進行檢測，結(jié)果熒光PCR方法檢測靈敏度均達到 1copies/μ L (見圖 3、4、5、6、7、8)。
[0128]2.3重復(fù)性試驗
[0129]分別取對豬圓環(huán)病毒2型(I X 16Copies/μ L)，豬細(xì)小病毒(I X 16Copies/μ L)，偽狂犬病毒(I X 16Copies/μ L)，豬流行性腹瀉病毒(I X 16Copies/μ L)，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(I X 16COpies/ μ L),豬痕病毒(I X 16Copies/ μ L)稀釋混合后按10倍稀釋成3個不同的濃度，對每個濃度的樣本做3個批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)，結(jié)果不同核酸濃度各種的檢測變異系數(shù)均小于5%，具有較好的重復(fù)性。
[0130]2.4臨床樣本檢測
[0131]由采集自浙江、福建、河南、天津、廣東等地的60份豬血清和13份糞便樣品，提取出核酸，用本發(fā)明的熒光PCR方法檢測病毒，同時采用常規(guī)PCR方法檢測作平行試驗。普通PCR法檢測與熒光定量PCR方法檢測結(jié)果如下:PCV2普通PCR檢測出陽性11份，本發(fā)明檢測出陽性13份；PPV普通PCR檢測出陽性O(shè)份，本發(fā)明檢測出陽性O(shè)份；PRV普通PCR檢測出陽性I份，本發(fā)明檢測出陽性I份；PRRSV普通PCR檢測出陽性17份，本發(fā)明檢測出陽性18份；CSFV普通PCR檢測出陽性3份，本發(fā)明檢測出陽性3份；PEDV普通PCR檢測出陽性I份，本發(fā)明檢測出陽性I份；其中CSFV和PRRSV混合感染I份，PRRSV和PCV2混合感染8份。本發(fā)明的PCR熒光方法用于樣本檢測的比常規(guī)方法獲得陽性率高，且能檢測多重感染，操作簡單，安全自動化程度高，檢測速度快，加上核酸的提取和逆轉(zhuǎn)錄，共僅需3-4個小時，優(yōu)勢明顯。
[0132]備注說明:采用目前本行業(yè)所公認(rèn)的精確度最高的單重實時熒光定量PCR進行檢測，其結(jié)果同本發(fā)明。
[0133]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.熒光定量PCR檢測豬主要病毒的試劑盒，其特征是包括如下2套體系: 體系A(chǔ)，包括如下3對引物和如下對應(yīng)的3條探針: 上游引物 PCV 病毒一PR: 5’ -CAGCACCCTGTAACGTTTGTC-3’ 下游引物 PCV 病毒一PR: 5’ -TTAGTCTTCCAATCACGCTTCTG-3’ 特異性 PCV 病毒 TaqMan 熒光探針一P:5’ -HEX-TTTCCCGCTCACGTTCAAAAGTTCAG-BHQ1-3，；
--、
上游弓 I 物 PRV 病毒一PR: 5 ’ -CACGCCGATGTGGTGGA-3， 下游引物 PRV 病毒一PR: 5 ’ -GGTACTGGCCCTCGTTGAA-3， 特異性 PRV 病毒 TaqMan 熒光探針一P:5’ -ROX-ACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAG-BHQ2-3，；
__、 上游引物 PPV 病毒一PR: 5’ -GCTTTAGCCTTGGAGCCGT-3’ 下游引物 PPV 病毒一PR: 5 ’ -AAGCAGGCTCTTATGTCGGTT-3， 特異性 PPV 病毒 TaqMan 熒光探針一P:5’ -FAM-TGGAGCGAGCCAACAACACCAACTT -BHQ1-3，； 體系B，包括如下3對引物和如下對應(yīng)的3條探針: 上游引物 CSFV 病毒一PR: 5’ -GCTCCCTGGGTGGTCTAAG-3’ 下游引物 CSFV 病毒一PR: 5’ -CTCGTCCACATAGCATCTCG-3’ 特異性 CSFV 病毒 TaqMan 熒光探針一P:5’ -FAM-CCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCG-BHQ1-3，；
--、
上游弓 I 物 PRRSV 病毒一PR: 5 ’ -TCAGCCATAGAAACCTGGAAAT-3 ’ 下游引物 PRRSV 病毒一PR: 5 ’ -ACGACAAATGCGTGGTTATCA-3， 特異性 PRRSV 病毒 TaqMan 熒光探針一P:5’ -HEX-ACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGC-BHQ1-3，；
__、 上游引物 PEDV 病毒一PR: 5’ -TGGCATTTCTACTACCTCG-3’ 下游引物 PEDV 病毒一PR: 5’ -AGTGGGTTCAGTCTTTGC-3’ 特異性 PEDV 病毒 TaqMan 熒光探針一P:5’ -ROX-CGAGTCCTATAACGGAGGTCGGCG -BHQ2-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR檢測豬主要病毒的試劑盒，其特征是: 所述試劑盒還包括A和B兩個多重?zé)晒釺aqMan探針PCR擴增體系反應(yīng)液，豬細(xì)小病毒PPV標(biāo)準(zhǔn)品、豬流行性腹瀉病毒PEDV標(biāo)準(zhǔn)品、豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV標(biāo)準(zhǔn)品、偽狂犬病病毒PRV標(biāo)準(zhǔn)品、豬瘟病毒CSFV標(biāo)準(zhǔn)品、豬圓環(huán)病毒PCV標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對照品、陰性對照品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的熒光定量PCR檢測豬主要病毒的試劑盒，其特征是: 多重?zé)晒馓结楶CR擴增體系反應(yīng)液A含有PCR反應(yīng)緩沖液，病毒PCV2、PPV、PRV的特異性引物，病毒PCV2、PPV、PRV的TaqMan熒光探針； 多重?zé)晒馓结楶CR擴增體系反應(yīng)液B含有PCR反應(yīng)緩沖液，病毒CSFV、PRRSV, PEDV的特異性引物，和病毒CSFV、PRRSV, PEDV的TaqMan熒光探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的熒光定量PCR檢測豬主要病毒的試劑盒，其特征是: PCV 的標(biāo)準(zhǔn)品序列:GAGCACCCTGTAACGITTGTCAGAITTCCCCGCGGGCTGGCTGAACITTTGAAAGTGAGCGGGAAAATGCAGAAGCGTGATTGGAAGACTAA ； PPV 的標(biāo)準(zhǔn)品序列:GCTTTAGCCTTGGAGCCGTGGAGCGAGCCAACAACACCAACTTTCACCAACCTGCACTTAACTCCAACACCGCCAGATTCAGCAATACGGACACCAAGTCCAACTTGGTCAGAAATAGAAACCGACATAAGAGCCTGCTT ； PRV 的標(biāo)準(zhǔn)序列:CACGCCGATGTGGTGGACCCCGTCCGCGGACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAGCTGGGGCTGCTCATGGTGGCCCCGGGGCGGTTCAACGAGGGCCAGTACC ； CSFV 的標(biāo)準(zhǔn)序列:GCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAG ； PRRSV 的標(biāo)準(zhǔn)序列:TCAGCCATAGAAACCTGGAAATTCATCACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCGTGCCCACCACGTTGAAAGTGCCGCAGGCTTTCATCCGATTGCGGCAAATGATAACCACGCATTTGTCGT ； PEDV 的標(biāo)準(zhǔn)序列:TGGCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGCCGACCTCCGTTATAGGACTCGTACTGAGGGTGTTTTCTGGGTTGCTAAAGAAGGCGCAAAGACTGAACCCACTo
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的熒光定量PCR檢測豬主要病毒的試劑盒，其特征是: 所述陰性對照為高溫高壓滅菌的焦碳酸二乙酯處理水，陽性對照為PCV2、PPV、PRV,PRRSV, CSFV, PEDV的陽性質(zhì)粒樣品。
6.如權(quán)利要求1?5任一所述的試劑盒在檢測PCV2、PPV、PRV、PRRSV,CSFV, PEDV中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104263853SQ201410466604
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】姜永厚, 吳海港, 饒品彬 申請人:浙江理工大學(xué)