一種曲霉菌定量檢測熒光pcr試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種曲霉菌定量檢測熒光PCR試劑盒，包括陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品、陰性工作標(biāo)準(zhǔn)品、檢測反應(yīng)液、紅細(xì)胞裂解液、稀釋液及DNA聚合酶，在陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品、陰性工作標(biāo)準(zhǔn)品及檢測反應(yīng)液中均含有特異性引物與特異性探針，所述特異性引物正向序列為SQ1或其互補(bǔ)鏈，反向序列為SQ2或其互補(bǔ)鏈，特異性探針序列為SQ3或其互補(bǔ)鏈。本發(fā)明定量準(zhǔn)確，兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果直觀，檢測速度快，能直接檢測PCR過程中的變化，與普通PCR相比，其結(jié)果可實(shí)時(shí)觀察，產(chǎn)物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了污染。
【專利說明】—種曲霉菌定量檢測熒光PCR試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于體外核酸診斷試劑【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種曲霉菌定量檢測熒光PCR試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]曲霉菌是一種典型的絲狀菌，在環(huán)境中廣泛存在，主要通過呼吸道吸入霉菌孢子進(jìn)入人體，首先侵入感染肺部進(jìn)而引發(fā)肺曲霉菌病。在血液系統(tǒng)疾病、肺結(jié)核、慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、肺癌等免疫抑制患者中曲霉已成為僅次于白念珠菌的重要致病真菌。曲霉菌感染已成為最常見的、傳播最廣的條件致病菌之一，但早期診斷困難，常常導(dǎo)致治療時(shí)機(jī)延誤，病死率高達(dá)30%~50%。傳統(tǒng)的真菌分離、培養(yǎng)和組織病理鑒定等診斷方法敏感性低、陽性率低。早期、快速、簡便、敏感、特異的診斷方法是目前條件性曲霉菌感染實(shí)驗(yàn)診斷研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
[0003]熒光PCR技術(shù)在1995年由美國PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果直觀，能直接檢測PCR過程中的變化。與普通PCR相比，其結(jié)果可實(shí)時(shí)觀察，產(chǎn)物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了污染。
[0004]曲霉菌感染中最常見的是煙曲霉感染，但目前國內(nèi)并沒有檢測煙曲霉的熒光PCR產(chǎn)品，更沒有檢測更大范圍的多種曲霉菌熒光PCR檢測產(chǎn)品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提出一種曲霉菌定量檢測熒光PCR試劑盒。
[0006]本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一種曲霉菌定量檢測熒光PCR試劑盒，包括陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品、陰性工作標(biāo)準(zhǔn)品、檢測反應(yīng)液、紅細(xì)胞裂解液、稀釋液、DNA聚合酶，其特征在于:在陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品、陰性工作標(biāo)準(zhǔn)品及檢測反應(yīng)液中均含有特異性引物與特異性探針，所述特異性引物及特異性探針的DNA序列分別為:
[0008]特異性引物正向序列SQl:5’ -AAGCACGGCTTGTGTGTTGG-3’或其互補(bǔ)鏈；
[0009]特異性引物反向序列SQ2:5’ -AGCCCCATACGCTCGAGGA-3’或其互補(bǔ)鏈；
[0010]特異性探針序列SQ3:5’ -FAM-AAGGCAGCGGCGGCA-MGB-3’ 或其互補(bǔ)鏈。
[0011]而且，所述特異性引物與特異性探針根據(jù)曲霉菌ITS序列特性設(shè)計(jì)，針對曲霉菌ITS序列設(shè)計(jì)的引物和探針用于檢測曲霉菌。
[0012]而且，在所述陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品中含有插入煙曲霉特異DNA序列SQ4的pGM_T載體質(zhì)粒，所插入序列SQ4如下:
[0013]SQ4:Gaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgcccccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctgttctgaaagtatgcagtctgagttgattatcgtaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccctctcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacctgctctgtaggcc。
[0014]而且，所述陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品含有重組質(zhì)粒的濃度為1.0X 13~1.0X 107。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
[0016]1、本發(fā)明定量準(zhǔn)確，兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果直觀，能直接檢測PCR過程中的變化，與普通PCR相比，其結(jié)果可實(shí)時(shí)觀察，產(chǎn)物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了污染。
[0017]2、本發(fā)明靈敏度和特異性高，由于采取特異性引物和探針的雙保險(xiǎn)設(shè)計(jì)，靈敏度和特異性均有很大提高，能在臨床癥狀出現(xiàn)之前檢測到曲霉的感染。
[0018]3、本發(fā)明檢測速度快，加上樣本處理總共僅需2個小時(shí)，步驟簡單，可同時(shí)進(jìn)行高通量樣本檢測。
[0019]4、根據(jù)多種曲霉菌ITS序列特性設(shè)計(jì)的引物和探針可以檢出多種曲霉菌。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為曲霉菌陽性反應(yīng)液的熒光PCR擴(kuò)增曲線和陰性反應(yīng)液熒光PCR擴(kuò)增曲線；
[0021]圖2為曲霉菌臨床樣本的熒光PCR擴(kuò)增曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0022]以下結(jié)合附圖對本發(fā)明實(shí)施做進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0023]一種曲霉菌定量檢測熒光PCR試劑盒，包括陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品、陰性工作標(biāo)準(zhǔn)品、檢測反應(yīng)液、紅細(xì)胞裂解液、稀釋液、DNA聚合酶，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)是，在陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品、陰性工作標(biāo)準(zhǔn)品及檢測反應(yīng)液中均含有特異性引物與特異性探針，所述特異性引物與特異性探針根據(jù)曲霉菌ITS序列特性設(shè)計(jì)，針對曲霉菌ITS序列設(shè)計(jì)的引物和探針用于檢測曲霉菌。
[0024]其中，所述異性引物及特異性探針的DNA序列分別為:
[0025]特異性引物正向序列SQl:5’ -AAGCACGGCTTGTGTGTTGG-3’或其互補(bǔ)鏈；
[0026]特異性引物反向序列SQ2:5’ -AGCCCCATACGCTCGAGGA-3’或其互補(bǔ)鏈；
[0027]特異性探針序列SQ3:5’ -FAM-AAGGCAGCGGCGGCA-MGB-3’ 或其互補(bǔ)鏈。
[0028]在本發(fā)明的具體實(shí)施中，在所述陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品中含有插入煙曲霉特異DNA序列SQ4的pGM-T載體質(zhì)粒，所插入序列SQ4如下:
[0029]SQ4:Gaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgcccccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctgttctgaaagtatgcagtctgagttgattatcgtaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccctctcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacctgctctgtaggcc,
[0030]在本發(fā)明的具體實(shí)施中，所述陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品含有重組質(zhì)粒的濃度為1.0X 13~1.0XlO7O
[0031]應(yīng)當(dāng)理解，下面實(shí)施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法:如薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，或按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0032]實(shí)例:試劑盒的制備
[0033](I)引物和探針設(shè)計(jì)與合成
[0034]本實(shí)施例根據(jù)多種曲霉菌ITS序列的特性設(shè)計(jì)引物和探針，正向引物 5’ -AAGCACGGCTTGTGTGTTGG-3’，反向引物 5’ -AGCCCCATACGCTCGAGGA-3’，探針5’ -FAM-AAGGCAGCGGCGGCA-MGB-3’，其數(shù)據(jù)均來源于GenBank中的核糖體ITS序列，引物和探針由Iifetechnologies公司合成。
[0035](2)曲霉陽性模版的制備
[0036]本實(shí)例中含有曲霉核酸序列質(zhì)粒作為陽性模版用于制備陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品。
[0037]使用引物:5’ -GAAGGATCATTACCGAGTGAGGG-3 ’ 和引物:5’ -GGCCTACAGAGCAGGTGACAAAG-3’擴(kuò)增煙曲霉基因靶序列，將經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物連接到PGM-T載體上；然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過篩選構(gòu)建好的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)雙向DNA測序鑒定，提取質(zhì)粒，紫外分光光度計(jì)定量，并保存于-20。。。
[0038] (3)陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品與陰性工作標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0039]分別將103、104、105、106、107拷貝的陽性標(biāo)準(zhǔn)品加入到陽性反應(yīng)液中配制成陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品，將沒有重組的17拷貝的PGM-T質(zhì)粒加入到陰性反應(yīng)液中配制成陰性標(biāo)準(zhǔn)工作品O
[0040](4)熒光PCR反應(yīng)液組成
[0041]

【權(quán)利要求】
1.一種曲霉菌定量檢測熒光PCR試劑盒，包括陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品、陰性工作標(biāo)準(zhǔn)品、檢測反應(yīng)液、紅細(xì)胞裂解液、稀釋液及DNA聚合酶，其特征在于:在陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品、陰性工作標(biāo)準(zhǔn)品及檢測反應(yīng)液中均含有特異性引物與特異性探針，所述特異性引物及特異性探針的DNA序列分別為: 特異性引物正向序列SQl:5’ -AAGCACGGCTTGTGTGTTGG-3’或其互補(bǔ)鏈； 特異性引物反向序列SQ2:5’ -AGCCCCATACGCTCGAGGA-3’或其互補(bǔ)鏈； 特異性探針序列SQ3:5’ -FAM-AAGGCAGCGGCGGCA-MGB-3’或其互補(bǔ)鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的曲霉菌定量檢測熒光PCR試劑盒，其特征在于:所述特異性引物與特異性探針根據(jù)曲霉菌ITS序列特性設(shè)計(jì)，針對曲霉菌ITS序列設(shè)計(jì)的引物和探針用于檢測曲霉菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的曲霉菌定量檢測熒光PCR試劑盒，其特征在于:在所述陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品中含有插入煙曲霉特異DNA序列SQ4的pGM-T載體質(zhì)粒，所插入序列SQ4如下:
SQ4:Gaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgcccccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctgttctgaaagtatgcagtctgagttgattatcgtaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccctctcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacctgctctgtaggcc0
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的曲霉菌定量檢測熒光PCR試劑盒，其特征在于:所述陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品含有重組質(zhì)粒的濃度為1.0X 13~1.0X 107。
【文檔編號】C12Q1/68GK104164511SQ201410420833
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月25日
【發(fā)明者】何永勝, 楊希寅, 李可可, 藏丹戎, 辛鶴林, 苑慶華 申請人:天津喜諾生物醫(yī)藥有限公司