熒光定量pcr反應(yīng)液及試劑盒和熒光定量pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種熒光定量PCR反應(yīng)液及試劑盒和熒光定量PCR方法。所述熒光定量PCR反應(yīng)液，包括如下的原料制備而成：二甲亞砜，牛血清蛋白，DNTP，10×SYBR熒光染料，10×PCR buffer，溶質(zhì)體積百分?jǐn)?shù)為30％的甘油溶液和Ex-Taq酶。本發(fā)明優(yōu)化了PCR實驗的熒光定量PCR反應(yīng)液，特別是加入一定比例的甘油溶液，以保證Ex-Taq酶的活性，加入BSA與DMSO的組合保證了Tag酶的穩(wěn)定性及活性并減少引物二聚體的形成，減少熒光定量PCR反應(yīng)液配置時間，所得PCR反應(yīng)液可以長期保存在-20℃中，使用方便。
【專利說明】熒光定量PCR反應(yīng)液及試劑盒和熒光定量PCR方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種熒光定量PCR反應(yīng)液及試劑盒和熒光定 量PCR方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 突光定量 PCR(realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR)是 1996 年由美國Applied Biosystems公司推出的一種新定量試驗技術(shù)，它是通過突光染料或突光 標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件 可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。
[0003] SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA非特異性結(jié)合。 在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光增加1000 倍。所以，一個反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號與出線的雙鏈DNA量成比例，且會隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增 加而增加。
[0004] 雙鏈DNA結(jié)合染料的優(yōu)點：實驗設(shè)計簡單，僅需要2個引物，不需要設(shè)計探針，無需 設(shè)計多個探針即可以快速檢驗多個基因，且能夠進(jìn)行熔點曲線分析，檢驗擴(kuò)增反應(yīng)的特異 性，低的初始成本，通用性好，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。
[0005] 常規(guī)的熒光定量PCR擴(kuò)增體系配置，往往是將DNTP、Buffer、Ex_Taq酶等試劑單獨 保存，待要進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，將樣品分別加到同一 PCR管中，在操作過程中除了經(jīng)常忘記加 入個別試劑的缺點外，多次的取用會對試劑造成污染，影響后續(xù)使用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種減少熒光定量PCR反應(yīng)液配置時間的熒 光定量PCR反應(yīng)液及試劑盒和熒光定量PCR方法。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：提供一種熒光定量PCR反應(yīng) 液，包括如下的原料制備而成：二甲亞砜，牛血清蛋白，DNTP，10XSYBR熒光染料，10XPCR buffer，溶質(zhì)體積百分?jǐn)?shù)為30 %的甘油溶液和Ex-Taq酶。
[0008] 本發(fā)明的另一技術(shù)方案為提供一種突光定量PCR試劑盒，其包含上述的突光定量 PCR反應(yīng)液。
[0009] 本發(fā)明的又一技術(shù)方案為提供一種突光定量PCR方法，包含使用上述的突光定量 PCR反應(yīng)液的步驟。
[0010] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明優(yōu)化了 PCR實驗的熒光定量PCR反應(yīng)液，特別是 加入一定比例的甘油溶液，以保證Ex-Taq酶的活性，加入BSA與DMSO的組合保證了 Tag酶 的穩(wěn)定性及活性并減少引物二聚體的形成，減少熒光定量PCR反應(yīng)液配置時間，所得PCR反 應(yīng)液可以在_20°C下，保存時間可長達(dá)2年，現(xiàn)有的配置方法是將PCR反應(yīng)液所需要的藥品 如二甲亞砜，牛血清蛋白，DNTP，Ex-Taq酶等各自保存在其最適溫度中，等要配置熒光定量 PCR體系時在將其混合，每次配置體系時都是現(xiàn)配現(xiàn)用，相對麻煩。本發(fā)明通過研發(fā)一種可 以一次性配置熒光定量PCR反應(yīng)液的又不影響其擴(kuò)增效率的試劑盒。便于商業(yè)生產(chǎn)。實現(xiàn) 一次配置，隨時取用，大大減輕了熒光定量PCR的準(zhǔn)備時間。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1為AK109848基因擴(kuò)增曲線圖；
[0012] 圖2為AK109848基因擴(kuò)增溶解曲圖；
[0013] 圖3為AK070626基因熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

【具體實施方式】
[0014] 為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實施方式并配合附 圖予以說明。
[0015] 本發(fā)明最關(guān)鍵的構(gòu)思在于：本發(fā)明在熒光定量PCR反應(yīng)液中加入甘油、BSA與DMSO 保證Ex-Taq酶及其他組分的穩(wěn)定性及活性，使其可以長期保存在-20° C中，可隨時取用提 高PCR的擴(kuò)增效率。
[0016] 實施例1
[0017] -種突光定量PCR反應(yīng)液，包括如下的原料制備而成：5_10 μ 1二甲亞砜，5_10 μ 1 質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)為0.1%牛血清蛋白溶液，5-2(^11011110階13溶液，10-3(^110\5￥81? 熒光染料，10-30 μ I 10XPCR buffer，10-50 μ 1溶質(zhì)體積百分?jǐn)?shù)為30 %甘油溶液和3-6 μ 1 Ex-Taq 酶。
[0018] -種突光定量PCR反應(yīng)液，包括如下的原料混和而成：5_10μ 1二甲亞砜，5_10μ 1 質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)為0.1%牛血清蛋白溶液，5-2(^11011110階13溶液，10-3(^110\5￥81? 熒光染料，10-30 μ I 10XPCR buffer，10-50 μ 1溶質(zhì)體積百分?jǐn)?shù)為30 %甘油溶液和3-6 μ 1 Ex-Taq 酶。
[0019] -種突光定量PCR反應(yīng)液，包括如下的原料混合而成：5_10μ 1二甲亞砜，5_10μ 1 質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)為0.1%牛血清蛋白溶液，5-2(^11011110階13溶液，10-3(^110\5￥81? 熒光染料，10_30μ I 10XPCR buffer，10-50y 1溶質(zhì)體積百分?jǐn)?shù)為30%甘油溶液和3-6μ 1 Ex-Taq 酶。
[0020] 實施例2
[0021] -種突光定量PCR反應(yīng)液，由如下的原料混合而成：7. 5μ 1二甲亞砜，7. 5μ 1質(zhì)量 體積百分?jǐn)?shù)為〇.1%牛血清蛋白溶液，1(^11〇禮〇階？溶液，2(^110\5￥81?熒光染料， 20μ1 10XPCR buffer，30yl溶質(zhì)體積百分?jǐn)?shù)為30%甘油溶液和5μ1 Ex-Taq酶。將配 置好的溶液混勻后離心，存放于_20°C冰箱中。
[0022] 進(jìn)一步的，上述的熒光定量PCR反應(yīng)液中，所述10XPCR buffer包含50-200mM的 PH 為 8. 3 的 Tris-Hcl 緩沖液，200-800mM Kcl 和 10-20mM Mgcl2。
[0023] 實施例3本發(fā)明熒光定量PCR反應(yīng)液的使用
[0024] 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以水稻AK070626基因為模板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按以 下表1對AK070626基因進(jìn)行樣品稀釋。
[0025] 表 1
[0026]

【權(quán)利要求】
1. 一種熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于，包括如下的原料制備而成：二甲亞砜，牛血 清蛋白，DNTP，10 X SYBR熒光染料，10 X PCR buffer，溶質(zhì)體積百分?jǐn)?shù)為30 %的甘油溶液和 Ex-Taq 酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于，包括如下的原料制備而 成：5-10iil二甲亞砜，5-10iil質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)為0. 1%的牛血清蛋白溶液，5-20iill0mM DNTP 溶液，10-30 ii 110 X SYBR 熒光染料，10-30 ii 110 XPCR buffer，10-50 ii 1 溶質(zhì)體積百 分?jǐn)?shù)為30 %甘油溶液和3-6 ill Ex-Taq酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于，包括如下的原料制備而 成：7. 5iil二甲亞砜，7. 5iil質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)為0. 1%牛血清蛋白溶液，IOiillOmM DNTP溶 液，20iill0XSYBR熒光染料，20iill0XPCR buffer，30iil溶質(zhì)體積百分?jǐn)?shù)為30%甘油溶 液和 5 ii I Ex-Taq 酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于，所述10XPCR buffer包 含 50-200mM 的 PH 為 8. 3 的 Tris-Hcl 緩沖液，200-800mM Kcl 和 10-20mM Mgcl2。
5. -種突光定量PCR試劑盒，其特征在于，其包含權(quán)利要求1-4任一項所述的突光定量 PCR反應(yīng)液。
6. -種突光定量PCR方法，其特征在于，包含使用權(quán)利要求1-4任一項所述的突光定量 PCR反應(yīng)液的步驟。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313152SQ201410578009
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】王清水, 余彥 申請人:福建師范大學(xué)