一種生物指示劑中嗜熱脂肪芽孢桿菌的初始孢子數(shù)量測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物指示劑中嗜熱脂肪芽孢桿菌的初始孢子數(shù)量測定方法，包括以下步驟：取生物指示劑，加入無菌水得到一次稀釋液，分裝到多支無菌試管；水浴熱擊；取出并迅速冷卻至室溫，對每一支無菌試管進(jìn)行以下操作：采用10倍遞增稀釋法逐級稀釋至適宜梯度得到二次稀釋液，取二次稀釋液2份分別注入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)，再分別注入大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，凝固后培養(yǎng)；對所有無菌平皿內(nèi)嗜熱脂肪芽孢桿菌的初始孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，再將所有計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行平均計(jì)算并再除以上述適宜梯度對應(yīng)的稀釋級，得到初始孢子數(shù)量，完成測定。本發(fā)明所述方法經(jīng)過驗(yàn)證穩(wěn)定可行，解決了以前生物指示劑中嗜熱脂肪芽孢桿菌的初始孢子數(shù)量無法測定的問題，便于推廣應(yīng)用。
【專利說明】一種生物指示劑中嗜熱脂肪芽孢桿菌的初始孢子數(shù)量測定 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物指示劑中嗜熱脂肪芽孢桿菌的初始孢子數(shù)量測定方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 生物指示劑是一類特殊的活微生物制品，通常為細(xì)菌的孢子，因其對特定滅菌處 理有確定的抗力，可用于確認(rèn)滅菌設(shè)備的性能，滅菌工藝的驗(yàn)證，生產(chǎn)過程滅菌效果的監(jiān)控 等。生物指示劑的使用使得消毒滅菌監(jiān)測手段更加完善，滅菌效果更加直觀、有效，安全性 高更，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健產(chǎn)品、衛(wèi)生檢疫、制藥企業(yè)、醫(yī)院制劑生產(chǎn)、食品生產(chǎn)等各 行業(yè)，對各種無菌生產(chǎn)工藝、無菌產(chǎn)品、無菌包裝材料等滅菌效果的評估、驗(yàn)證。生物指示劑 中包含一定數(shù)量的細(xì)菌孢子，形式多樣，如芽孢懸液、芽孢條、自含式、工業(yè)生物指示劑等。 生物指示劑中芽孢含量是生物指示劑的重要質(zhì)量指標(biāo)。
[0003] 嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus)屬嗜熱性需氧芽孢桿菌，但 兼有厭氧的特性，細(xì)菌繁殖體G蘭氏染色陽性呈紫色，細(xì)菌芽胞孔雀綠著色。其細(xì)菌繁殖體 對培養(yǎng)基要求低，在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨瓊脂上生長良好，表面粗糙呈米黃色。其最低生 長溫度為28°C，最高生長溫度70?77°C。最適生長繁殖溫度為56?65°C，培養(yǎng)24h即可 形成菌落，37°C下24h看不到菌落。
[0004] 嗜熱脂肪芽孢桿菌作為生物指示劑中的一部分，其初始孢子數(shù)量到目前為止還沒 有一套行之有效的測定方法，用戶只能根據(jù)其出廠產(chǎn)品的標(biāo)示孢子數(shù)量了解，無法根據(jù)應(yīng) 用需求自主測定，尤其對于未知嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子數(shù)量的生物指示劑更是束手無策。 所以，市場需要能夠自主測定生物指示劑中嗜熱脂肪芽孢桿菌的初始孢子數(shù)量的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種生物指示劑中嗜熱脂肪芽孢 桿菌的初始孢子數(shù)量測定方法。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明所述生物指示劑中嗜熱脂肪芽孢桿菌的初始孢子數(shù)量測定方法，包括以下 步驟：
[0008] (1)取生物指示劑，加入無菌水并混合均勻后得到一次稀釋液，一次稀釋液中的生 物指示劑與無菌水之間的體積比為1 : (3-5)，將一次稀釋液分別按相同體積裝入多個(gè)無 菌試管，得到供試品，另取1支無菌試管裝入同體積的無菌水備用；
[0009] (2)將上述供試品和裝有無菌水的無菌試管共同進(jìn)行水浴熱擊，水浴溫度為 95-KKTC，水浴時(shí)間為10-20分鐘，在此過程中把溫度計(jì)插入裝有無菌水的無菌試管內(nèi)以 測定水浴溫度；
[0010] (3)水浴熱擊完成后取出供試品，迅速冷卻至室溫，對每一支裝有一次稀釋液的無 菌試管進(jìn)行以下操作：根據(jù)生物指示劑標(biāo)示初始孢子數(shù)量采用10倍遞增稀釋法，逐級稀釋 至適宜梯度得到二次稀釋液，該適宜梯度使其菌落數(shù)范圍為30?300cfu/ml，在該適宜梯 度對應(yīng)的稀釋級下，以無菌操作方法用滅菌吸管吸取二次稀釋液兩份，每份的體積為A ml， 分別注入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)，再分別向兩個(gè)無菌平皿內(nèi)注入體積為（15?20)A ml溫度不超 過450°C的溶化的大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻，待其凝固后將兩個(gè)無菌平皿倒置培 養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為55?60°C，培養(yǎng)時(shí)間為40-60小時(shí)；
[0011] (4)完成培養(yǎng)后，對所有的無菌平皿內(nèi)的嗜熱脂肪芽孢桿菌的初始孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)， 再將所有計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行平均計(jì)算，平均后的結(jié)果再除以步驟（3)中所述適宜梯度對應(yīng)的稀 釋級，得到最終的初始孢子數(shù)量，完成測定。
[0012] 作為優(yōu)選，所述步驟（1)中，一次稀釋液中的生物指示劑與無菌水之間的體積比 為1 : 4 ;所述步驟⑵中，水浴時(shí)間為15分鐘；所述步驟⑶中，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。
[0013] 所述步驟（1)中，每支所述無菌試管內(nèi)的一次稀釋液的體積為10ml，裝有所述稀 釋液的所述無菌試管的數(shù)量為12支；所述步驟（3)中，所述適宜梯度對應(yīng)的稀釋級為10Λ 分別注入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)的每份二次稀釋液的體積為lml，向每個(gè)無菌平皿內(nèi)注入的大豆 酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基的體積為15?20ml。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0015] 本發(fā)明所述方法經(jīng)過驗(yàn)證穩(wěn)定可行，解決了以前生物指示劑中嗜熱脂肪芽孢桿菌 的初始孢子數(shù)量無法測定的問題，便于用戶根據(jù)應(yīng)用需求自主測定生物指示劑中嗜熱脂肪 芽孢桿菌的初始孢子數(shù)量，尤其適用于未知嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子數(shù)量的生物指示劑的測 定，便于推廣應(yīng)用。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述：
[0017] 實(shí)施例1 :
[0018] 按以下步驟進(jìn)行試驗(yàn)：
[0019] (1)取生產(chǎn)批號為"VM328674"的德國默克的生物指示劑15支，每支2ml，采用漩渦 混合儀混合5min后，將15支生物指示劑放置于無菌藍(lán)蓋瓶中，用玻璃棒把指示劑的安瓿瓶 全部搗碎，加入無菌水120ml配成一次稀釋液，一次稀釋液中的生物指示劑與無菌水之間 的體積比為1 :4,邊加無菌水邊沖洗玻璃棒；待沖洗完成后，將無菌藍(lán)蓋瓶內(nèi)的一次稀釋液 采用漩渦混合儀混合5min后，取13支無菌試管，分別取無菌藍(lán)蓋瓶內(nèi)的IOml -次稀釋液 轉(zhuǎn)移至12無菌試管內(nèi)，分別標(biāo)為A1-A12,得到供試品A ;另外1支無菌試管（一般稱為"空 白對照管"）取IOml無菌水轉(zhuǎn)入，標(biāo)為1-0,做水浴熱擊時(shí)升溫計(jì)時(shí)用。
[0020] (2)將上述供試品A和裝有無菌水的無菌試管（即空白對照管）共同進(jìn)行水浴熱 擊，水浴溫度為95-KKTC，水浴時(shí)間為15分鐘，在此過程中把溫度計(jì)插入空白對照管內(nèi)以 測定水浴溫度；
[0021] (3)水浴熱擊完成后取出供試品A，迅速冷卻至室溫，對每一支裝有一次稀釋液的 無菌試管A1-A12進(jìn)行以下操作：根據(jù)生物指示劑標(biāo)示初始孢子數(shù)量采用10倍遞增稀釋法， 逐級稀釋至適宜梯度得到二次稀釋液，該適宜梯度使其菌落數(shù)范圍為30?300cfu/ml，本 例中的適宜梯度對應(yīng)的稀釋級為1〇_ 4,以無菌操作方法用滅菌吸管吸取二次稀釋液兩份， 每份的體積為lml，分別注入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)，再分別向兩個(gè)無菌平皿內(nèi)注入體積為15? 20ml溫度不超過450°C的溶化的大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻，待其凝固后將兩個(gè)無 菌平皿倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為55?60°C，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)；
[0022] (4)完成培養(yǎng)后，對所有的無菌平皿內(nèi)的嗜熱脂肪芽孢桿菌的初始孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)， 再將所有計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行平均計(jì)算，平均后的結(jié)果再除以步驟（3)中所述適宜梯度對應(yīng)的稀 釋級，得到最終的初始孢子數(shù)量，完成測定。
[0023] 完成測定后，按下面的公式計(jì)算初始孢子數(shù)量回收率：

【權(quán)利要求】
1. 一種生物指示劑中嗜熱脂肪芽孢桿菌的初始孢子數(shù)量測定方法，其特征在于：包括 以下步驟： (1) 取生物指示劑，加入無菌水并混合均勻后得到一次稀釋液，一次稀釋液中的生物 指示劑與無菌水之間的體積比為1 : (3-5)，將一次稀釋液分別按相同體積裝入多個(gè)無菌 試管，得到供試品，另取1支無菌試管裝入同體積的無菌水備用； (2) 將上述供試品和裝有無菌水的無菌試管共同進(jìn)行水浴熱擊，水浴溫度為 95-KKTC，水浴時(shí)間為10-20分鐘，在此過程中把溫度計(jì)插入裝有無菌水的無菌試管內(nèi)以 測定水浴溫度； (3) 水浴熱擊完成后取出供試品，迅速冷卻至室溫，對每一支裝有一次稀釋液的無菌 試管進(jìn)行以下操作：根據(jù)生物指示劑標(biāo)示初始孢子數(shù)量采用10倍遞增稀釋法，逐級稀釋至 適宜梯度得到二次稀釋液，該適宜梯度使其菌落數(shù)范圍為30?300cfu/ml，在該適宜梯度 對應(yīng)的稀釋級下，以無菌操作方法用滅菌吸管吸取二次稀釋液兩份，每份的體積為A ml，分 別注入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)，再分別向兩個(gè)無菌平皿內(nèi)注入體積為（15?20) A ml溫度不超過 450°C的溶化的大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻，待其凝固后將兩個(gè)無菌平皿倒置培養(yǎng)， 培養(yǎng)溫度為55飛(TC，培養(yǎng)時(shí)間為40-60小時(shí)； (4) 完成培養(yǎng)后，對所有的無菌平皿內(nèi)的嗜熱脂肪芽孢桿菌的初始孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，再 將所有計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行平均計(jì)算，平均后的結(jié)果再除以步驟（3)中所述適宜梯度對應(yīng)的稀釋 級，得到最終的初始孢子數(shù)量，完成測定。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物指示劑中嗜熱脂肪芽孢桿菌的初始孢子數(shù)量測定方法， 其特征在于：所述步驟（1)中，一次稀釋液中的生物指示劑與無菌水之間的體積比為1 : 4; 所述步驟（2)中，水浴時(shí)間為15分鐘；所述步驟（3)中，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物指示劑中嗜熱脂肪芽孢桿菌的初始孢子數(shù)量測定方 法，其特征在于：所述步驟（1)中，每支所述無菌試管內(nèi)的一次稀釋液的體積為l〇ml，裝有 所述稀釋液的所述無菌試管的數(shù)量為12支；所述步驟（3)中，所述適宜梯度對應(yīng)的稀釋級 為1〇_ 4,分別注入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)的每份二次稀釋液的體積為I ml，向每個(gè)無菌平皿內(nèi)注入 的大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基的體積為15?20 ml。
【文檔編號】C12Q1/06GK104212875SQ201410455570
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月9日
【發(fā)明者】鄧茂林, 伍丹, 譚鴻波, 吳小愚, 劉文軍, 羅成鑫, 劉思川, 程志鵬, 萬陽浴, 葛均友 申請人:四川科倫藥業(yè)股份有限公司