專利名稱：一株嗜熱地芽孢桿菌utm01及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及ー種嗜熱地芽孢桿菌菌株UTMOl及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
堆肥化是有機固體廢棄物轉(zhuǎn)化為簡單的有機質(zhì)和氮等營養(yǎng)物質(zhì)的有效途徑，以其經(jīng)濟性和易操作性被廣泛關(guān)注，為堆肥的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了契機，但是堆肥エ廠化的發(fā)展一直受到因堆肥時間和場地帶來的成本問題的困擾。堆肥接種是從堆肥過程是微生物主導(dǎo)的有機物降解轉(zhuǎn)化的機理出發(fā)，從多祥化的環(huán)境或物料中分離馴化具有不同功能作用的優(yōu)勢微生物菌株，并通過培養(yǎng)發(fā)酵形成菌劑生 產(chǎn)，然后接種至堆肥中以強化這ー過程的，從而達到促進堆肥化的進程、縮短堆肥時間的目的。但目前堆肥接種劑大多以中溫菌為主，但隨著堆肥溫度的升高，微生物種群受到很大的抑制，表現(xiàn)為種類單一、數(shù)量減少，比中溫階段要少I 2個數(shù)量級，這無疑限制了有機物質(zhì)的快速降解；再者，堆肥高溫階段還是絕大部分的寄生蟲、蟲卵、孢子和病原菌等被殺死的重要階段，是保證堆肥無害化的最重要階段，由于微生物活性下降、有機物質(zhì)的降解受到限制，也在一定程度上影響了堆肥的無害化效果。地芽孢桿菌(Geobacillus sp.)是ー組在表型上相近和系統(tǒng)發(fā)育上一致的嗜熱菌群，大多數(shù)能夠在55°C以上生長。由于其具有嗜熱、兼性厭氧，降解和利用碳氫化合物、產(chǎn)生表面活性劑的特性，在環(huán)境治理等領(lǐng)域中有潛在應(yīng)用價值。將地芽孢桿菌作為接種劑應(yīng)用于堆肥，將有效解決以上問題，促進堆肥進程。但目前還未見到關(guān)于地芽孢桿菌作為接種劑應(yīng)用于高溫污泥堆肥的報告。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種嗜熱地芽孢桿菌(Geobacillus sp.)及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的菌株為嗜熱地芽孢桿菌(Geobacillus sp.)菌株，是從腐熟的高溫污泥堆肥樣品中在70°C下分離得到的，采用形態(tài)觀察法和16SrRNA序列測定相結(jié)合的方法，將該菌鑒定為地芽孢桿菌屬(Geobacillus sp.)，并將其命名為UTMOl。該菌株已于2011年12月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為 Geobacillus sp.，保藏號為 CGMCC No. 5641。嗜熱地芽孢桿菌菌株UTMOl在LB固體培養(yǎng)基平板上的培養(yǎng)I天后特征是單菌落為淡黃色，圓形，直徑約2mm，表面濕潤，中央扁平，邊緣完整。其溫度生長特性是在LB固體培養(yǎng)基平板上，挑取單菌落劃線在65-75°C下暗箱培養(yǎng)約12小時，便可形成明顯菌落。其菌體細胞特征是桿菌，長度約5 μ m。所述LB固體培養(yǎng)基的成分是胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，植物凝膠10g，蒸餾水1000ml, pH 7. 2-7. 4。本發(fā)明提供了含有嗜熱地芽孢桿菌UTM01的菌劑。
本發(fā)明提供了嗜熱地芽孢桿菌UTMOl或其發(fā)酵產(chǎn)物或上述菌劑在堆肥中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了嗜熱地芽孢桿菌UTMOl或其發(fā)酵產(chǎn)物或上述菌劑在制備堆肥接種劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種制備堆肥接種劑的方法，包括以下步驟I)活化培養(yǎng)取本發(fā)明嗜熱地芽孢桿菌菌株UTMOl的菌種，接種至新鮮LB固體試管斜面培養(yǎng)基上，在60-70°C下活化培養(yǎng)12-48h ；2)種子液制備按ー支試管斜面接種ー個錐形瓶，將活化菌種接種于LB培養(yǎng)液中，密封瓶ロ，在65-70°C下振蕩培養(yǎng)1-3天，振蕩頻率為160-200rpm;3)發(fā)酵菌液制備將步驟2)制得的種子液按3%-10%的體積比加入滅菌LB培養(yǎng)液中，控制溫度65°C _70°C，每隔4-6h，通氣10-30min，通氣量按體積比O. 8-1.5 : 1，每隔 12h 攪拌 10-20min, 160-180rpm 攪拌，培養(yǎng) 2-4 天；4)堆肥接種劑制備將麥麩與玉米面按重量比1-2 I混合后，然后分別添加硫酸銨、尿素和發(fā)酵菌液，再添加總重量O. I % -O. 5 %的糖類，混合均勻，使其含水率在45% -55%之間，用1% -2%石灰水調(diào)節(jié)pH為7. 0-7.4。其中所述步驟4)是分別按麥麩和玉米面的總重量O. 1% -1%添加硫酸銨，O. 1% -3%添加尿素，O. 5% -3%添加發(fā)酵菌液。本發(fā)明提供的制備堆肥接種劑的方法還包括以下步驟堆置15-25天后，期間翻堆1-2次，將堆體攤開陳化使其含水率下降至30%以下，即得固態(tài)堆肥接種劑。本發(fā)明提供了上述方法制備得到的堆肥接種劑。本發(fā)明還提供了上述堆肥接種劑在污泥堆肥中的應(yīng)用。堆肥接種劑的應(yīng)用方法是在堆肥物料添加輔料，使堆肥物料碳氮比為20-30 1，含水率50% -60%進行混合完畢后，按物料總干重的O. 1% -I. O %將堆肥接種劑添加到物料中，混合均勻。本發(fā)明提供的嗜熱地芽孢桿菌菌株UTMOl是ー種新發(fā)現(xiàn)的嗜熱地芽孢桿菌資源，最高生長溫度可達75°C，能在堆肥環(huán)境中尤其是堆肥高溫期迅速増殖，形成優(yōu)勢種群，降解有機物質(zhì)，促進堆肥進程；利用本發(fā)明菌株制備的堆肥接種劑為含水率在30%以下的小顆粒固體，可長期保存，且添加到堆肥時不會對堆體的含水率造成較大影響，是ー種優(yōu)良的堆肥調(diào)理劑。因此，本發(fā)明的嗜熱地芽孢桿菌菌株UTMOl具有重要的經(jīng)濟價值和應(yīng)用前景，適合大規(guī)模應(yīng)用于堆肥中，可在有機固體廢物處理中推廣使用。


圖I為顯微鏡下嗜熱地芽孢桿菌菌株UTMOl (1000X)。圖2為堆肥過程中溫度變化曲線。圖3為堆肥過程中揮發(fā)分的變化。圖4為堆肥過程中碳氮比的變化。圖5為堆肥過程中發(fā)芽指數(shù)的變化。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神、和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例I嗜熱地芽孢桿菌UTMOl的分離與鑒定在無菌的環(huán)境中，稱取IOg污泥腐熟堆肥樣品于裝有10粒玻璃珠的IOOml無菌水三角瓶中，用錫箔紙封ロ，置于搖床上160r/min振蕩30分鐘，使樣品充分散開，然后放置70°C下，靜置富集培養(yǎng)6-12天。
取出以上富集培養(yǎng)三角瓶，用無菌吸管吸取Iml上清液加到裝有9ml無菌水中即得(10_0稀釋液。依次類推，制得KT1至10_3稀釋液。取9個無菌平皿，用Iml無菌吸管分別吸取以上稀釋液O. 1ml，接入平板，每ー稀釋度設(shè)3個重復(fù)；將已融化并冷卻至約50°C的LB培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿約20ml，與菌液充分混勻，凝固后，在培養(yǎng)皿上作好稀釋度及日期標記。然后將各平板倒置于密閉箱中，將其置于干燥箱中70°C下暗箱培養(yǎng)2天，觀察各平板的生長情況，選擇菌落分散較好的平板上挑取菌落形態(tài)不同的單菌落進行劃線培養(yǎng)，如此至2代以后，將形態(tài)一致的菌落制片，進行簡單染色，在油鏡下觀察菌體形態(tài)，多視野下觀察菌體細胞形態(tài)，確認菌體形態(tài)一致后，用LB培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)至豐厚，于4°C冰箱中保存菌種，備用。上述LB培養(yǎng)基的成分為胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，植物凝膠 10g，蒸餾水 1000ml, pH 7. 2-7. 4。將本發(fā)明菌株菌落制片，用結(jié)晶紫染料進行簡單染色，油鏡下觀察菌體細胞形態(tài)，結(jié)果顯示均為桿狀菌，見圖I ;以本發(fā)明菌株的DNA為模板，PCR擴增其16S rRNA序列，引物為(27f) 5/ -AGA GTT TGA TCCTGG CTC AG-3'和(1492r) 5/ -GGT TAC CTT GTT ACGACT T-3'。PCR 反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性 5min，95°C變性 30s，53°C退火 45s，72°C延伸 90s，30個循環(huán)，72°C延伸lOmin。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測其純度后測序，測序結(jié)果見序列表SEQ IDNo. I 所不。將 16S rRNA 基因序列在 GenBank 中進行 Blast (http://blast, ncbi. nlm. nih.gov/Blast. cgi)比對，發(fā)現(xiàn)與Geobacillus sp. 083 (DQ642093. I)相似度最高,把該菌株鑒定為地芽孢桿菌屬(Geobacillus sp.)，命名為UTM01，并于2011年12月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為Geobacillus sp.，保藏號為CGMCCNo.5641。實施例2堆肥接種劑的制備(I)活化培養(yǎng)取本發(fā)明嗜熱地芽孢桿菌菌株UTM01的4°C保藏菌種，接種至新鮮LB固體培養(yǎng)基上，在60°C下活化培養(yǎng)48小時；(2)種子液制備按ー支試管斜面接種ー個錐形瓶，將活化培養(yǎng)得到菌種菌落全部接種至裝有LB培養(yǎng)液的錐形瓶中，密封瓶ロ，置于水浴恒溫振蕩器上，在65°C下振蕩培養(yǎng)2天,振蕩頻率為160rpm ；(3)發(fā)酵液制備搖瓶種子液按5% (v/v)接入裝有60L已滅菌LB培養(yǎng)液的100L容積的發(fā)酵罐中，控制溫度65°C，每隔6小時通氣20分鐘，通氣量按I : I (v/v)，每隔12小時攪拌15分鐘，160rpm攪拌，培養(yǎng)3天；(4)堆肥接種劑制備取麥麩與玉米面各40kg混合后，然后分別按總重量0. 3%和O. 2%添加硫酸銨和尿素，按總重量2. 5%接種發(fā)酵菌液，適當加水，混合均勻，使其含水率約45%，視情況，用I %石灰水調(diào)節(jié)pH為7. O，進行堆置，第7天翻堆，發(fā)酵至第11天后，再次進行翻堆，在第15天將堆體攤開陳化一段時間使其含水率下降至30%以下，即得固態(tài)堆肥接種劑。實施例3堆肥接種劑的制備(I)活化培養(yǎng)取本發(fā)明嗜熱地芽孢桿菌菌株UTMOl的4°C保藏菌種，接種至新鮮LB固體培養(yǎng)基上，在70°C下活化培養(yǎng)24小時；(2)種子液制備按ー支斜面試管接種ー個錐形瓶，將活化的菌種斜面接種至裝有已滅菌LB培養(yǎng)液的錐形瓶中，然后密封瓶ロ，置于水浴恒溫振蕩器上，在70°C下振蕩培養(yǎng)36小時，振蕩頻率為200rpm ；、
(3)發(fā)酵液制備搖瓶種子液按10% (v/v)接入裝有60L已滅菌LB培養(yǎng)液的100L容積的發(fā)酵罐中，控制溫度70°C，每隔4小時通氣30分鐘，通氣量按I. 5 I (v/v)，每隔12小時攪拌10分鐘，180rpm攪拌，培養(yǎng)2天；(4)堆肥接種劑制備取麥麩與玉米面分別為60kg和30kg混合后，然后分別按總重量1%和3%添加硫酸銨和尿素，按總重量I. 5%接種發(fā)酵液，適當加水，混合均勻，使其含水率在55%，視情況，用2%石灰水調(diào)節(jié)pH為7. 4，進行堆置，第8和16天翻堆，于第24天將堆體攤開放置一段時間使其含水率下降至30%以下，即得固態(tài)堆肥接種劑。實施例4堆肥接種劑的制備(I)活化培養(yǎng)取本發(fā)明嗜熱地芽孢桿菌菌株UTMOl的4°C保藏菌種，接種至新鮮LB固體培養(yǎng)基上，在65°C下活化培養(yǎng)28小時；(2)種子液制備按ー支斜面試管接種ー個錐形瓶，將活化的菌種斜面接種至裝有已滅菌LB培養(yǎng)液的錐形瓶中，然后密封瓶ロ，置于水浴恒溫振蕩器上，在68°C下振蕩培養(yǎng)2天,振蕩頻率為180rpm ；(3)發(fā)酵液制備搖瓶種子液按3% (v/v)接入裝有60L已滅菌LB培養(yǎng)液的100L容積的發(fā)酵罐中，控制溫度68°C，每隔5小時通氣10分鐘，通氣量按O. 8 I (v/v)，每隔12小時攪拌10分鐘，170rpm攪拌，培養(yǎng)3天；(4)堆肥接種劑制備取麥麩與玉米面分別為60kg和40kg混合后，然后分別按總重量O. 5%和2%添加硫酸銨和尿素，按總重量3%接種發(fā)酵菌液，適當加水，混合均勻，使其含水率在50%，視情況，用I. 5%石灰水調(diào)節(jié)pH為7. 2，進行堆置，第7、14天翻堆，再繼續(xù)發(fā)酵6天后，將堆體攤開陳化一段時間使其含水率下降至30%以下，即得固態(tài)堆肥接種劑。實施例5堆肥接種劑的應(yīng)用本例以污泥為堆肥主料，說明本發(fā)明堆肥接種劑的應(yīng)用。采集某污水廠污泥樣品，檢測其基本性質(zhì)為含水率79. 87%，含碳量22. 56%，含氮量2· O7 重金屬含量為 Cr 128mg/kg, Cu 62. 8mg/kg, Ni 43. 6mg/kg, Pb 68. Omg/kg, Zn422mg/kg, Cd I. 22mg/kg, Hg I. 46mg/kg, As 38. 8mg/kg,在城鎮(zhèn)污水廠污泥處置農(nóng)用泥質(zhì)標準(CJ/T309-2009)A級污泥限值以下。取中藥渣與花生殼粉作為輔料，調(diào)節(jié)物料的含水率與碳氮比，具體的，取污泥4噸、中藥渣和花生殼粉各I噸，進行混合，然后添加40kg實施例2制備的固態(tài)堆肥接種劑，充分混合均勻，進行堆置發(fā)酵10-15天后，再進行二次陳化，使含水率降至30%以下，陳化后的堆肥可作為土壤改良劑或進行深加工制備功能性商品有機肥料進行出售。按照上述同樣的方法，采用實施例3和4制備的固體堆肥接種劑進行堆肥應(yīng)用，也能得到上述相同的有機肥產(chǎn)品。實施例6堆肥接種劑的應(yīng)用效果下面以實施例5中的堆肥原料進行效果驗證試驗。具體的堆肥原料用量為污泥400kg、輔料選用中藥渣和花生殼粉各100kg，本固態(tài)堆肥接種劑400g，充分混合均勻，進行 堆置發(fā)酵。另以等量已滅活的本固態(tài)堆肥接種劑按相同方法進行堆肥，作為對照。堆肥周期為15天，每天10 00和16 00多點檢測堆肥溫度的大小，取兩者的平均值作為當天的堆肥溫度，分別于第0、3、6、9、12、15天在堆肥表層10_20cm處米樣,按5點米樣法的原則，充分混勻。取干樣和鮮樣各3份，干樣風(fēng)干備用，鮮樣儲存于4°C冰箱中待用。堆肥溫度變化見圖2。表I菌劑接種對堆肥溫度的影響分析
權(quán)利要求
1.一株嗜熱地芽孢桿菌(Geobacillus sp.)菌株UTM01，其保藏編號為CGMCCNo.5641。
2.含有權(quán)利要求I所述嗜熱地芽孢桿菌UTMOl的菌劑。
3.權(quán)利要求I所述的嗜熱地芽孢桿菌UTMOl或其發(fā)酵產(chǎn)物或權(quán)利要求2所述的菌劑在堆肥中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I所述的嗜熱地芽孢桿菌UTMOl或其發(fā)酵產(chǎn)物或權(quán)利要求2所述的菌劑在制備堆肥接種劑中的應(yīng)用。
5.一種制備堆肥接種劑的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)活化培養(yǎng)將權(quán)利要求I所述嗜熱地芽孢桿菌菌株UTMOl的菌種在60-70°C下活化培養(yǎng) 12-48h ； 2)種子液制備將活化菌種接種于LB培養(yǎng)液中，密封瓶ロ，在65-70°C下振蕩培養(yǎng)1_3天，振蕩頻率為160-200rpm ； 3)發(fā)酵菌液制備將步驟2)制得的種子液按3%-10%的體積比加入滅菌LB培養(yǎng)液中，控制溫度650C -700C，每隔4-6h，通氣10-30min,通氣量按體積比O. 8-1. 5:1，每隔12h攪拌 10-20min，160-180rpm 攪拌，培養(yǎng) 2-4 天； 4)堆肥接種劑制備將麥麩與玉米面按重量比1-2 I混合后，然后分別添加硫酸銨、尿素和發(fā)酵菌液，再添加總重量O. 1% -O. 5%的糖類，混合均勻，使其含水率在45% -55%之間，用1% -2%石灰水調(diào)節(jié)pH為7. 0-7.4。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟4)是分別按麥麩和玉米面的總重量的O. 1% -I%添加硫酸銨，O. 1% -3%添加尿素，O. 5% -3%添加發(fā)酵菌液。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，還包括以下步驟堆置15-25天后，期間翻堆1-2次，將堆體攤開陳化使其含水率下降至30%以下。
8.權(quán)利要求5-7任一所述方法制備得到的堆肥接種劑。
9.權(quán)利要求8所述的堆肥接種劑在污泥堆肥中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，在污泥中添加輔料，使碳氮比為20-30 1，含水率50% -60%;混合完畢后，按堆肥物料總干重的O. 1% -I. 0%將堆肥接種劑添加到污泥中，混合均勻；所述輔料為中藥渣和/或花生殼粉。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株嗜熱地芽孢桿菌(Geobacillus sp.)菌株UTM01，其保藏編號為CGMCC No.5641。本發(fā)明提供的菌株UTM01最高生長溫度達75℃，能在高溫堆肥環(huán)境迅速增殖，降解有機物質(zhì)，促進堆肥進程。本發(fā)明還提供了利用菌株UTM01制備的固態(tài)堆肥接種劑及其制備方法和應(yīng)用，該堆肥接種劑生產(chǎn)成本低，質(zhì)量穩(wěn)定，可應(yīng)用于高溫污泥堆肥，不會影響堆體的含水率，且綠色環(huán)保，無污染，性能優(yōu)良，具有較好的經(jīng)濟效益和社會效益。
文檔編號C12R1/01GK102660486SQ20121017659
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月21日
發(fā)明者劉永躍, 周順桂, 汪涌, 許宜北 申請人:大地綠源環(huán)?？萍?北京)有限公司