一種鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列、分子探針和方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列、分子探針和方法。本發(fā)明鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。用于鑒別硬葉兜蘭的核苷酸分子探針上游YYF：如SEQIDNO.2所示；下游YYR：如SEQIDNO.3所示。運(yùn)用核苷酸分子探針YYF/YYR，通過(guò)常規(guī)PCR方法來(lái)鑒別硬葉兜蘭。本發(fā)明樣品用量少，僅需少量樣品就可以完成整個(gè)操作；準(zhǔn)確、靈敏度高，YYF/YYR為硬葉兜蘭專(zhuān)一性分子探針，若為其他兜蘭種類(lèi)，為陰性反應(yīng)；方法簡(jiǎn)單，采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，時(shí)間短，半日即可完成。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列、分子探針和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法鑒別硬葉兜蘭的【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種鑒別硬葉兜 蘭的核苷酸序列、分子探針和方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 硬葉兜蘭是蘭科（Orchidaceae)兜蘭屬 的植物，主要分布于我國(guó)云南、廣西、貴州等省區(qū)和越南北部。硬葉兜蘭 因花奇特，花姿優(yōu)美具有較高的觀賞價(jià)值，因而有"玉女蘭"之稱(chēng)，被譽(yù)為世界最美的花朵之 一。由于具有非常高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，人為過(guò)度采收和生境破壞嚴(yán)重，硬葉兜蘭野生 種群數(shù)量急劇下降，分布范圍逐步縮小，野生資源處于極度瀕危狀態(tài)，被《瀕危野生動(dòng)植物 物種國(guó)際貿(mào)易公約》列為一級(jí)保護(hù)植物。因此，為了有效保護(hù)和尋找新的硬葉兜蘭群體，建 立有效的鑒別硬葉兜蘭的方法是十分重要的。
[0003] 傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)研究方法不能從本質(zhì)上準(zhǔn)確反映物種的遺傳變異與材料間的遺傳 關(guān)系，單獨(dú)利用傳統(tǒng)的分類(lèi)方法難以對(duì)種質(zhì)資源的系統(tǒng)分類(lèi)做出準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。隨著生命科學(xué) 的不斷發(fā)展，分子標(biāo)記鑒定技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，應(yīng)用DNA分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)植物進(jìn)行鑒定取得了 快速發(fā)展。DNA分子標(biāo)記技術(shù)彌補(bǔ)和克服了傳統(tǒng)鑒別方法的一些缺陷和難題。本實(shí)驗(yàn)采用 目標(biāo)起始密碼子多態(tài)（start codon targeted Polymorphism, SCoT)分子標(biāo)記方法，對(duì)硬 葉兜蘭及其他一些兜蘭種類(lèi)的遺傳多樣性進(jìn)行研究，獲得了兜蘭SCoT指紋圖譜，從中篩選 出硬葉兜蘭特異性條帶，通過(guò)克隆、測(cè)序等，設(shè)計(jì)了特異性探針，應(yīng)用于硬葉兜蘭的鑒定，為 有效的鑒別和保護(hù)硬葉兜蘭資源提供有效的分子技術(shù)依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種鑒別硬葉兜蘭的核苷酸 序列。
[0005] 本發(fā)明用于鑒別硬葉兜蘭的特征性核苷酸序列來(lái)源于SCoT通用引物2 (5' -CAACAATGGCTACCACCC-3'）擴(kuò)增所得的硬葉兜蘭特異性核苷酸序列，具體序列為： CAACAATGGCTACCACCCCTTAGCCTAAGGAGCTCTAAAGCTAGGGGAGGCTCCAGACTAGCGTTCCCCACG GTCGTATCACCGTGGAGACCGCCGGAGCCTCCCGGAAATGAAACCGAAAGAAAGAGCAGCCGGTGGTGGAGATAGAG GCTTACCCATGGTCCGTCAGTCAGATAAGAAGGTCCCTCGAGCTTCCTGGAGATGAGACGGAGCTAACGGCACCGGC CGGTGGTTGCAAGGTGGCCGGAGTTGACGTAGTCGACGGTGGTCAGTAACTTGTAAAGAGAGATTTCGGTATCATCG GGTATCCGTTTTTCACGATTTTTGATTCTATGTCCTCTTGAGGGGAAGGAGAATAACTTCCTAGGAGGAAGGTTGAG CTAAGGAGGGCTCTATGGATGACTTTGGAGGCTATCAATAGGGATTTTTTTTTGAGCTCGGAGAAGGATGGTAGCAG CGGATTTAGAGGGGCCTAGCAGGGCGCTCGGGTGGACGTTCCTCACAAATTTTGGCTCTATATTCTACTGAAGGGAA GGATAACAACTTATTAGAAGGAAGGTTGAGCTAATTAGGGCTCTATGGAGGACTTTGGAGGCTATCAATATAGGGAT TCCTTGAGCTCAAAGGAGGGTGGTAGCCATTGTTG，如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供基于上述鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列設(shè)計(jì)的用于鑒 別硬葉兜蘭的核苷酸分子探針（YYF/YYR)，該核酸分子探針序列如下： 上游引物 YYF :5' -GAAATGAAACCGAAAGAAAG-3'，如 SEQ ID NO. 2 所示； 下游引物 YYR :5' -AATGGCTACCACCCTCCT-3'，如 SEQ ID NO. 3 所示。
[0007] 上述核苷酸分子探針（YYF/YYR)，具有極高的專(zhuān)一性，僅與硬葉兜蘭發(fā)生反應(yīng)，而 不與其他兜蘭種類(lèi)反應(yīng)。利用該探針通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增可以快速的對(duì)硬葉兜蘭進(jìn)行鑒別。
[0008] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述鑒別硬葉兜蘭的分子探針的方法。
[0009] 本發(fā)明采用上述核酸分子探針（YYF/YYR)作為特異性擴(kuò)增引物，以硬葉兜蘭基因 組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，獲得清晰的硬葉兜蘭特異性條帶，實(shí)現(xiàn)對(duì)硬葉兜蘭的 鑒別。
[0010] 本發(fā)明具有的有益效果： 1) 樣品用量少，只需少量樣品就可以完成整個(gè)操作； 2) 準(zhǔn)確、靈敏度高，YYF/YYR為硬葉兜蘭專(zhuān)一性分子探針，若為其他兜蘭種類(lèi)，為陰性 反應(yīng)； 3) 方法簡(jiǎn)單，采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，時(shí)間較短，半日就可以完成。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1是本發(fā)明所述的硬葉兜蘭的特異性核苷酸序列及對(duì)硬葉兜蘭專(zhuān)一性核酸分 子探針YYF和YYR的位置圖，左側(cè)為5'端，右側(cè)為3'端，其中黑色部分為專(zhuān)一性核苷酸分 子探針YYF和YYR擴(kuò)增的序列片段大小及位置； 圖2是采用SCoT引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增的電泳圖(箭頭所指的條帶是硬葉兜蘭特有的條 帶，分子量為646 bp);其中，1、麻栗坡兜蘭（云南麻栗坡)，2、麻栗坡兜蘭(浙江杭州），3、杏 黃兜蘭(云南麗江)，4、硬葉兜蘭(云南文山），5、卷萼兜蘭(廣西南寧)，6、亨利兜蘭(云南麻栗 坡)，7、帶葉兜蘭(廣西龍州)，8、紫紋兜蘭(廣東廣州），9、彩云兜蘭（云南文山），Μ為DNA分 子量標(biāo)準(zhǔn) marker DL2000 ; 圖3是采用硬葉兜蘭特異性核酸分子探針YYF/YYR對(duì)不同兜蘭樣品進(jìn)行檢測(cè)的PCR 擴(kuò)增電泳圖；1、麻栗坡兜蘭（云南麻栗坡)，2、麻栗坡兜蘭(浙江杭州)，3、杏黃兜蘭(云南麗 江)，4、硬葉兜蘭（云南文山），5、卷萼兜蘭(廣西南寧)，6、亨利兜蘭（云南麻栗坡)，7、帶葉 兜蘭(廣西龍州)，8、紫紋兜蘭(廣東廣州)，9、彩云兜蘭（云南文山），Μ為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) marker DL2000〇

【具體實(shí)施方式】
[0012] 本發(fā)明可以從分子水平上較為客觀準(zhǔn)確的鑒定硬葉兜蘭，具體包括：1.提供用于 硬葉兜蘭鑒定的DNA片段；2.提供來(lái)源于上述DNA片段的兜蘭專(zhuān)一性核酸分子探針；3. 提供上述核酸分子探針的應(yīng)用方法。
[0013] 在采用SCoT分子標(biāo)記研究兜蘭屬植物遺傳多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)，SCoT通用引物2 (5' -CAACAATGGCTACCACCC-3'）擴(kuò)增的指紋圖譜中，硬葉兜蘭有特異性條帶，能將其與其他 兜蘭種類(lèi)區(qū)別開(kāi)。因此，可根據(jù)此特異性條帶設(shè)計(jì)特異性的核酸分子探針，建立簡(jiǎn)便、快速、 準(zhǔn)確鑒定硬葉兜蘭的分子生物學(xué)方法。
[0014] 本發(fā)明提供的用于鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列來(lái)源于采用SCoT通用引物2 (5'-CAACAATGGCTACCACCC-3'）擴(kuò)增得到的硬葉兜蘭特異性序列，該序列如SEQ ID NO. 1所 /_J、1 ο
[0015] 本發(fā)明的硬葉兜蘭專(zhuān)一性核酸分子探針是以上述硬葉兜蘭核苷酸序列為基礎(chǔ)，利 用 Primer Primer 5. 0 軟件設(shè)計(jì)得到的。分子探針（YYF/YYR)如 SEQ ID NO. 2、SEQ ID Ν0. 3 所示。
[0016] 本發(fā)明所提供的硬葉兜蘭的鑒定方法，可采用PCR方法：以本發(fā)明的核酸分子探 針（YYF和YYR)為PCR引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。具體步驟和過(guò)程按常規(guī)PCR方法進(jìn)行，采用該 PCR方法可快速、準(zhǔn)確地鑒定硬葉兜蘭，且樣品用量少。
[0017] 通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明： 實(shí)施例1 :硬葉兜蘭特異性核苷酸序列的制備 1.基因組DNA的提取 剪取-80°C保存的兜蘭葉片0. 2 g放入研缽中，立即加入液氮研磨至粉末，然后使用 上海生工生物工程有限公司UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒提取兜蘭屬基因組 DNA，用1%瓊脂糖膠對(duì)所得DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，稀釋至 50ng/y 1〇
[0018] 2. SCoT-PCR反應(yīng)及電泳檢測(cè) 用SCoT通用引物2 (5' -CAACAATGGCTACCACCC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：2 μ 1 10XBuffer，2yl MgCl2 (25πιΜ)，0·8μ1 dNTPs (10πιΜ)，1μ1 SCoT 引物 2 (10μΜ)，1μ1 模板 DNA (50ng/ μ 1)，0· 5 μ 1 Taq 酶（2U/ μ 1)，12. 7 μ 1 ddH20。總體積為 20 μ 1。
[0019] PCR 程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性 4 min ;35 個(gè)循環(huán)（94°C變性 45 s，50°C退火 45 s，72°C 延伸2 min);最后于72°C下延伸10 min。
[0020] PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖2,箭頭標(biāo)的條帶(分子量為646 bp)，是采用SCoT引物2進(jìn) 行PCR擴(kuò)增時(shí)尋找到的硬葉兜蘭特有的條帶。如圖2 (圖中，通道1?9為不同兜蘭樣品， 具體見(jiàn)【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】；通道Μ為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)marker DL2000)所示，只有硬葉兜蘭(通道4) 在分子量536 bp有條帶出現(xiàn)，而其他兜蘭種類(lèi)在分子量536 bp沒(méi)有條帶出現(xiàn)。因此，此條 帶為硬葉兜蘭的特有條帶。
[0021] 3.序列測(cè)定 利用SCoT通用引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)只 在硬葉兜蘭中出現(xiàn)的特異SCoT片段（圖2中箭頭所指片段)進(jìn)行切膠，采用PCR產(chǎn)物純化試 劑盒(上海生工）回收純化所切片段。然后將所純化的DNA片段連接到PUCm-T載體(上海 生工）上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，然后送生物公司測(cè)序(上海生工)，得到如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸組成和排列。
[0022] 實(shí)施例2 :硬葉兜蘭特異性核苷酸分子探針YYF/YYR的制備，PCR反應(yīng)及電泳檢測(cè) 在獲得硬葉兜蘭特異性核苷酸序列的基礎(chǔ)上，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)得出 YYF/YYR的核苷酸序列（分別為SEQ ID N0. 2、SEQ ID N0. 3所示的)，引物由上海生工生物 工程有限公司合成。然后利用設(shè)計(jì)合成的引物YYF/YYR，對(duì)不同兜蘭樣品(具體見(jiàn)【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】） 進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。
[0023] PCR擴(kuò)增體系為 2μ 1 10 X Buffer，2μ 1 MgCl2 (25mM)，0· 8μ 1 dNTPs (10mM)， 1μ 1 引物 YYF (10μΜ)，1μ 1 引物 YYR(10yM)，ly 1 模板 DNA(50ng/y 1)，0· 5μ 1 Taq 酶 (2υ/μ1)，11·7μ1 ddH20?？傮w積為 20μ1。
[0024] 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性4 min ;35個(gè)循環(huán)（94°C變性45 s，57°C退火45 s，72°C延 伸2 min);最后于72°C下延伸10 min。
[0025] 用1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果，電泳圖如圖3所示，從圖3(圖中，通道 1?9為來(lái)自8種的9份兜蘭樣品，具體見(jiàn)【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】；通道Μ為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)marker DL2000)，可以看出，只有硬葉兜蘭(通道4)能擴(kuò)增出特異性片段，而其他兜蘭種類(lèi)沒(méi)有擴(kuò)增 出任何條帶，這表明本發(fā)明的核酸分子探針具有極高的專(zhuān)一性，因此可以用于快速的鑒別 硬葉兜蘭。將硬葉兜蘭的特異性片段送去測(cè)序，其序列如SEQ ID NO. 1的107?642位堿 基所示，其長(zhǎng)度為536 bp，具體序列信息見(jiàn)圖1。
【權(quán)利要求】
1. 一種鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列，其特征在于該核苷酸序列為： CAACAATGGCTACCACCCCTTAGCCTAAGGAGCTCTAAAGCTAGGGGAGGCTCCAGACTAGCGTTCCCCACG GTCGTATCACCGTGGAGACCGCCGGAGCCTCCCGGAAATGAAACCGAAAGAAAGAGCAGCCGGTGGTGGAGATAGAG GCTTACCCATGGTCCGTCAGTCAGATAAGAAGGTCCCTCGAGCTTCCTGGAGATGAGACGGAGCTAACGGCACCGGC CGGTGGTTGCAAGGTGGCCGGAGTTGACGTAGTCGACGGTGGTCAGTAACTTGTAAAGAGAGATTTCGGTATCATCG GGTATCCGTTTTTCACGATTTTTGATTCTATGTCCTCTTGAGGGGAAGGAGAATAACTTCCTAGGAGGAAGGTTGAG CTAAGGAGGGCTCTATGGATGACTTTGGAGGCTATCAATAGGGATTTTTTTTTGAGCTCGGAGAAGGATGGTAGCAG CGGATTTAGAGGGGCCTAGCAGGGCGCTCGGGTGGACGTTCCTCACAAATTTTGGCTCTATATTCTACTGAAGGGAA GGATAACAACTTATTAGAAGGAAGGTTGAGCTAATTAGGGCTCTATGGAGGACTTTGGAGGCTATCAATATAGGGAT TCCTTGAGCTCAAAGGAGGGTGGTAGCCATTGTTG，如 SEQ ID NO. 1 所示。
2. 基于如權(quán)利要求1所述的一種鑒別硬葉兜蘭的核苷酸序列設(shè)計(jì)的核苷酸分子探針 YYF/YYR，其特征在于該核酸分子探針序列如下： 上游引物 YYF :5' -GAAATGAAACCGAAAGAAAG-3'，如 SEQ ID NO. 2 所示； 下游引物 YYR :5' -AATGGCTACCACCCTCCT-3'，如 SEQ ID NO. 3 所示。
3. -種鑒別硬葉兜蘭的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求2所述的核苷酸分子探針 YYF/YYR作為PCR引物，利用PCR方法鑒定硬葉兜蘭，具體步驟按常規(guī)PCR方法進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104152565SQ201410409089
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】王慧中, 馮尚國(guó), 何仁鋒 申請(qǐng)人:杭州師范大學(xué)