一種枯草芽孢桿菌b33及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌B33，其分類命名為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）B33，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為：CGMCCNo.7540，保藏日期為2013年04月28日。所述的枯草芽孢桿菌主要用于小麥霉病的生物防治。本發(fā)明枯草芽孢桿菌B33對小麥赤霉病菌和鐵皮石斛根腐病，草莓灰霉病等多種病原真菌具有很好的抑制作用，該拮抗細(xì)菌對其他植物病害也有很好的防治效果；具有繁殖速度快；能夠人工培養(yǎng)，易于操作，便于生產(chǎn)應(yīng)用；抗逆能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，尤其是對真菌引起的小麥赤霉病的防治具有重要意義；培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
【專利說明】一種枯草芽孢桿菌B33及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物保護(hù)領(lǐng)域，尤其涉及一種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B33 及其在防治小麥霉病中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著公眾對食品和環(huán)境中化學(xué)農(nóng)藥安全性的普遍關(guān)注，以及一些危險性 化學(xué)農(nóng)藥的禁用，促使人們尋求安全有效的植物病害控制新途徑，利用有益微生物防治植 物病害日趨受到重視。它是向被打破了的植物自然生態(tài)系中引入對植物有益的外源拮抗 菌、或通過調(diào)節(jié)環(huán)境促使自然的有益微生物群體增長，并表現(xiàn)出生防活性，通過微生物之間 的相互作用達(dá)到防病目的。目前，植物病害的生防已成為各國研究重點(diǎn)。
[0003] 自然界潛在的微生物資源種類豐富，在微生物農(nóng)藥的產(chǎn)品開發(fā)方面有明顯優(yōu)勢， 因此世界各國都投入大量的人力和財力，研究、開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型微生物農(nóng)藥， 并以此帶動其他高科技產(chǎn)業(yè)的全面發(fā)展。我國也把微生物農(nóng)藥的研制和開發(fā)列為國家重點(diǎn) 科技攻關(guān)和高新技術(shù)發(fā)展計劃，江蘇省政府也把微生物農(nóng)藥創(chuàng)制作為生物農(nóng)業(yè)的一個重要 組成部分。
[0004] 生物農(nóng)藥（biopesticides)，按照Copping和Menn的定義包含了活體微生物（真 菌、細(xì)菌和病毒），昆蟲植病線蟲，植物源農(nóng)藥，微生物農(nóng)藥，微生物次生代謝物（抗生素） 等，用于防治各種昆蟲和病害；生物農(nóng)藥（特別是微生物農(nóng)藥）具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)是對人類健 康威脅小，對環(huán)境較安全，這正是全社會最關(guān)心的問題之一。因此，進(jìn)入21世紀(jì)以來，各國 政府和植物保護(hù)工作者更加重視生物農(nóng)藥的開發(fā)和應(yīng)用，已成為研究熱點(diǎn)。
[0005] 微生物農(nóng)藥的特性賦予了農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，為保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，保障食品 安全提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐；同時微生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)也是未來經(jīng)濟(jì)中具有發(fā)展?jié)摿Φ男略?長點(diǎn)之一。研究微生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展對于政府部門科學(xué)制定促進(jìn)微生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的政 策體系，實現(xiàn)農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，促進(jìn)循環(huán)經(jīng)濟(jì)和可持續(xù)社會發(fā)展戰(zhàn)略，保障我省經(jīng)濟(jì)建設(shè) 和農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的協(xié)調(diào)發(fā)展，以及建設(shè)我省農(nóng)產(chǎn)品安全體系等都將具有十分重要的理論意 義和實踐意義。
[0006] 小麥赤霉病是長江流域小麥穗部主要病害，有的年份可造成小麥的嚴(yán)重減產(chǎn)。小 麥（Triticum aestivum)是一種主要的糧食和飼料作物，草本科植物，也是世界上總產(chǎn) 量占第二位的糧食（僅次于玉米）。在小麥種植區(qū)，小麥赤霉病，小麥銹病和小麥全蝕 病是阻礙小麥豐產(chǎn)的瓶頸。據(jù)報道，我國小麥赤霉病病原菌有多種，根據(jù)致病性強(qiáng)弱分 為強(qiáng)致病性種類為，小麥赤霉病禾谷鐮孢（Fusarium graminearum Schw.)分布最廣，占 94.5<%;硫色鎌乃菌（卩.5111卩111^6111113(31116(3111:)占0.45 (%;黃色鎌刀菌[卩.(31111]1〇1'11111(￥· G. Sm.) Saec.]占 0· 65 % ;彎角鎌刀菌（F. camptoceras Wr. Rg.)占 0· 12 % ;木賊鎌刀 菌緊密變種1^.6911丨861：；[(0(13.)336(3.￥31'.(30115^(31：111110￥1'.)]〇€€6]占0.04 (%。中等致 病的有燕麥鎌刀菌谷類變種[F. avenaceum (Cda. ex Fr. ) var. graminum (Cda. ) Saec.]占 0.12% ;燕麥刀菌草類變種[F.avenaceum var.herba;rum(Cda.)Saec]占 0.61% ;三線鎌 刀菌[F·tricinctum(Cda·)Saec·]占0·08(%;銳頂鎌刀菌（F·acuminatumEletEv·)占 0.33%;雪腐鐮刀菌[F.nivale(Fr.)Ces.]占0.41%。而在江蘇句容地區(qū)是亞細(xì)亞鐮孢菌 (Fusarium asiaticum)，本發(fā)明專利的試驗是以該菌為測試菌株。
[0007] 從保護(hù)生態(tài)環(huán)境和食品安全的角度出發(fā)，小麥生產(chǎn)需要有低毒、污染少，對人體安 全的微生物制劑來控制小麥赤霉病害，已達(dá)到安全食用的目的。也符合生物農(nóng)業(yè)發(fā)展和政 府、社會與生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一目的在于提供一種對小麥赤 霉菌具有拮抗作用的枯草芽孢桿菌。
[0009] 本發(fā)明的第二目的在于提供一種枯草芽孢桿菌在防治小麥赤霉病中的應(yīng)用。
[0010] 技術(shù)方案：為了解決上述第一目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種枯草芽孢 桿菌B33,其分類命名為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，在中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC)保藏，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院 3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼為100101，其保藏編號為：CGMCCNo. 7540,保藏日 期為2013年04月28日。
[0011]為了解決上述的第二目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：所述的枯草芽孢桿菌在 防治小麥赤霉病中的應(yīng)用。
[0012] 所述的枯草芽孢桿菌B33在抑制小麥赤霉病菌生長中的應(yīng)用。
[0013] 具體應(yīng)用為：將枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B33接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基 中，在28°C -33°C下發(fā)酵培養(yǎng)48-72小時，得到的發(fā)酵液作為防治小麥赤霉病菌的菌劑。
[0014] 本發(fā)明中所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：1000mL蒸餾水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g， 氯化鈉 4-5g，pH6.5-7.5。
[0015] 所述的枯草芽孢桿菌B33在抑制草莓根腐病菌生長中的應(yīng)用。
[0016] 所述的枯草芽孢桿菌B33在抑制草莓灰霉菌生長中的應(yīng)用。
[0017] 所述的枯草芽孢桿菌B33在抑制膠孢炭疽菌生長中的應(yīng)用。
[0018] 所述的枯草芽孢桿菌B33在抑制鐵皮石斛根腐病菌生長中的應(yīng)用
[0019] 本發(fā)明中所述的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B33的生理活性特征如下：
[0020] 所述枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B33在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上菌落 較大，乳白色，直徑一般4-6mm，表面隆起，干燥，有皺褶，邊緣較規(guī)則，菌體桿狀，兩端鈍圓， 具周生鞭毛，大小為1. 93-2. 61X0. 62-1. 12 μ m，平均2. 2X0. 83 μ m ;芽孢兩端生，橢圓形， 大小為 0· 89-1. 01X0. 41-0. 65 μ m，平均 0· 83X0. 51 μ m。
[0021] 革蘭氏染色表現(xiàn)為陽性；酪蛋白水解、淀粉水解、明膠液化為陽性，V. P反應(yīng)可變， 吲哚反應(yīng)陰性；糖類產(chǎn)酸發(fā)酵。
[0022] 解淀粉芽孢桿菌的16SrDNA序列如SEQ ID No. 1所示。將所測16SrDNA序列通過 BLAST比對，鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)。
[0023] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：
[0024] (1)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B33對多種植物病原菌具有抑制作用，在 拮抗細(xì)菌對植物病害生物防治中起到非常重要的作用，例如種類和數(shù)量眾多；對病原菌的 作用方式多樣化；繁殖速度快；能夠人工培養(yǎng)，易于操作，便于生產(chǎn)應(yīng)用；抗逆能力強(qiáng)等優(yōu) 點(diǎn)，尤其是對真菌引起的小麥赤霉病的防治具有重要意義；也是保證糧食安全重要手段。
[0025] (2)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B33培養(yǎng)條件簡單、容易保存，易于工業(yè) 化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖la枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)B33的形態(tài)圖；
[0027] 圖lb為本發(fā)明中枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B33芽孢形態(tài)圖（在一端或兩端折 光體）；
[0028] 圖2a為本發(fā)明中枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B33對小麥赤霉病菌（Fusarium asiaticum)的抑制作用；
[0029] 圖2b為本發(fā)明中枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B33對草莓根腐病（Fusarium oxsporum)的抑制作用；
[0030] 圖2c為本發(fā)明中枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B33對草莓灰霉菌（Botrytis cinerea)的抑制作用；
[0031] 圖2d為本發(fā)明中枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B33對膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporiodes)的抑制作用；
[0032] 圖2e為本發(fā)明中枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B33鐵皮石斛根腐病菌（Fusarium proliferatum)的抑制作用；
[0033] 圖3a為本發(fā)明中枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B33的防治試驗，在4月20日再剛 開花時間進(jìn)行處理，同時設(shè)對照處理）；
[0034] 圖3b為本發(fā)明中枯草芽孢桿菌（B. subtilis)B33菌液處理小麥，發(fā)病率降低約 70%。

【具體實施方式】
[0035] 下面結(jié)合實驗例詳細(xì)闡述本發(fā)明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B33的應(yīng)用。
[0036] 實驗例1 :枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)B33對小麥赤霉病菌（Fusarium asiaticum)、草莓根腐病(Fusarium oxsporum)、草莓灰霉菌（Botrytis cinerea)、草莓炭 疽菌（Colletotrichum gloeosporiodes)、鐵皮石斛根腐病菌（Fusarium proliferatum)的 平板抑菌作用。
[0037] 將用LB斜面活化的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtil is) B33菌株劃線接種于PDA 平板一側(cè)，再將小麥赤霉病菌、草莓根腐病、草莓灰霉菌、草莓炭疽菌和鐵皮石斛根腐病菌 PDA平板培養(yǎng)物用直徑5_的打孔器打取同質(zhì)同量的菌塊，接種于平板另一側(cè)。30土 1°C培 養(yǎng)10天觀察抑菌能力，并記錄其寬度（如表1)，實驗效果如圖2a至圖2e所示。試驗結(jié)果 表明，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)B33對5種病原菌均有較好的拮抗作用，以占據(jù) 培養(yǎng)皿的直徑判斷擬制效果，用無菌的PDA圓塊作為對照。
[0038] 表1 B33對小麥赤霉菌和其他4種病原菌10天的抑制作用
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 一種枯草芽孢桿菌B33,其特征在于，其分類命名為枯草芽孢桿菌 sMii/is)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC No. 7540,保藏日期為2013年04月28日。
2. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌B33在防治小麥赤霉病中的應(yīng)用。
3. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌B33在抑制小麥赤霉病菌生長中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，將枯草芽孢桿菌 Β33接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C -33°C下發(fā)酵培養(yǎng)48-72小時，得到的發(fā)酵液作為防治小 麥赤霉病菌的菌劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：1000 mL蒸餾 水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g，氯化鈉4-5g，ρΗ6· 5-7. 5。
6. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌Β33在抑制草莓根腐病菌生長中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌Β33在抑制草莓灰霉菌生長中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌Β33在抑制膠孢炭疽菌生長中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌Β33在抑制鐵皮石斛根腐病菌生長中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/125GK104195071SQ201410385445
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】趙桂華, 楊鶴同, 趙楠 申請人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院