一種溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】一種溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基及其制備方法，該培養(yǎng)基由下述成分制成：殼聚糖1-5重量份，交聯(lián)劑0-2重量份，溫敏劑20-50重量份，微生物特異性顯色劑0.2-0.4重量份，微生物鑒別培養(yǎng)基100重量份和pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH值至7.0-7.2。該溫敏水凝膠培養(yǎng)基在常溫條件下(0-30℃)為液體，在生理溫度或微生物培養(yǎng)溫度(33-38℃)下，5-10min內(nèi)能凝固成固體，其中加有微生物特異性顯色劑，微生物培養(yǎng)過(guò)程中微生物特異性顯色劑能使菌落顯色，易于區(qū)分菌落和樣品固態(tài)殘?jiān)奖阌?jì)數(shù)。殼聚糖原料豐富易得，價(jià)格便宜，制備的水凝膠培養(yǎng)基無(wú)毒、生物相容性好，能降解。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新型微生物培養(yǎng)基，具體涉及一種溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基及其 制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 自20世紀(jì)40年代以來(lái)，有關(guān)水凝膠的理化性質(zhì)、合成、在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域 的研究十分活躍（參見(jiàn)文獻(xiàn)：翟茂林，哈鴻飛；水凝膠的合成、性質(zhì)及應(yīng)用，[J].大學(xué)化學(xué)， 2001 ;16(5) :22-27)。水凝膠在水中能溶脹保持大量水分而又不溶解的交聯(lián)聚合物，根據(jù) 絡(luò)合健的不同分為物理凝膠與化學(xué)凝膠，根據(jù)材料的不同又分為化學(xué)合成凝膠與天然高分 子凝膠。天然高分子凝膠具有良好的生物相容性、對(duì)環(huán)境敏感性、豐富的原料和低廉的價(jià) 格，因而正引起越來(lái)越多學(xué)者的重視。徐斌等研制的殼聚糖水凝膠，可用于組織工程化心肌 的支架材料（參見(jiàn)文獻(xiàn)：徐斌，段翠密，郝彤，等；殼聚糖水凝膠的研制及其與C2C12細(xì)胞粘 附、支持作用的實(shí)驗(yàn)研究，[J].生物醫(yī)學(xué)工程研究，2008 ;27 (2) :122-124)。殼聚糖與磷酸 甘油三鈉按一定的比例混合，制成溫敏性水凝膠，用于組織工程支架材料（參見(jiàn)文獻(xiàn)：聞繼 紅，孫海梅，尚宏偉，等；可注射性殼聚糖基溫敏性凝膠的制備及其生物相容性，[J].吉林 農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011 ;33(5) :522-526)。水凝膠的主要應(yīng)用包括：日用品，作為一種高吸水 性材料，廣泛用于婦女衛(wèi)生巾、兒童尿不濕、緩釋型香精、紙巾等。工業(yè)用品主要用于溶劑脫 水、金屬離子濃集、空氣過(guò)濾、廢水處理等。農(nóng)業(yè)土建上主要用于保水、污泥固化、水泥添加 齊U、綠化沙漠等。生物醫(yī)學(xué)上主要用于燒傷涂敷物、藥物傳輸、補(bǔ)齒材料、移植、隱型眼鏡、細(xì) 胞固化等。
[0003] 傳統(tǒng)的固體及半固體微生物培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入凝固劑，如瓊脂、明膠、硅膠 等，其原料價(jià)格較貴。由于殼聚糖公知的抑菌功能，作為微生物培養(yǎng)基的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的研究者意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)殼聚糖用作溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基時(shí)，經(jīng)培養(yǎng) 的菌落數(shù)量和生長(zhǎng)的速度與常規(guī)方法培養(yǎng)結(jié)果基本一致，進(jìn)而研發(fā)了一種殼聚糖基溫敏水 凝膠微生物培養(yǎng)基及其制備工藝。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明包括如下技術(shù)方案：
[0006] -種溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由下述成分制成：殼聚糖1-5重量份，交 聯(lián)劑0-2重量份，溫敏劑20-50重量份，微生物特異性顯色劑0. 2-0. 4重量份，微生物鑒別 培養(yǎng)基100重量份和pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH值為7. 0-7. 2。
[0007] 如上所述的溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基，優(yōu)選地，所述殼聚糖為N-脫乙酰度在70? 90 %的殼聚糖及其衍生物。
[0008] 如上所述的溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基，優(yōu)選地，所述交聯(lián)劑選自聚乙烯醇、戊二醛 和異丁醇中的至少一種。
[0009] 如上所述的溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基，優(yōu)選地，所述溫敏劑選自α甘油磷酸鈉、 β甘油磷酸鈉和無(wú)水甘油磷酸鈉中的至少一種。
[0010] 如上所述的溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基，優(yōu)選地，所述微生物特異性顯色劑 為T(mén)TC指示劑、碘、三糖鐵、磷鑰酸、磷酸鉍鉀、甲基紅、考馬斯亮藍(lán)G-250、七葉靈、 5_溴-4-氯-3-吲哚-肌醇磷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚-葡萄糖吡喃糖苷酸、鄰硝基酚β -D 葡萄糖苷酸酶、丙烯乙二醇、5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D半乳糖吡喃糖苷酸、甲苯胺藍(lán)、甲基 綠、丫啶橙和5-溴-4-氯-3-吲哚-胸苷-3-磷酸中的至少一種。
[0011] 如上所述的溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基，優(yōu)選地，所述微生物鑒別培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉 湯培養(yǎng)液、酪素培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、H2S試驗(yàn)培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、遠(yuǎn)藤氏培 養(yǎng)基或伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基。
[0012] 如上所述的溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基，優(yōu)選地，所述磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯 化銨、碳酸鈉或碳酸氫鈉。
[0013] 另一方面，本發(fā)明提供如上所述的溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基的制備方法，該方法 包括如下步驟：
[0014] Α.按照權(quán)利要求1所述成分和配比稱(chēng)取試劑，將各試劑和容器進(jìn)行無(wú)菌處理；
[0015] Β.殼聚糖溶于微生物鑒別培養(yǎng)基中；在室溫條件下往該培養(yǎng)基中加交聯(lián)劑，持續(xù) 攪拌下交聯(lián)反應(yīng)10-45分鐘，形成清亮液體；
[0016] C.在冰浴條件下往交聯(lián)反應(yīng)后的液體中逐滴加入溫敏劑，攪拌30-60min至清亮 溶液，加入微生物特異性顯色劑，攪拌溶解，用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)體系pH值到7. 0-7. 2。
[0017] 再一方面，本發(fā)明提供一種溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基，其是采用如上所述方法制 備的。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于以下幾個(gè)方面：1、溫敏水凝膠培養(yǎng)基在常溫條件下 (0-30°C )為液體，在生理溫度或微生物培養(yǎng)溫度（33-38°C )下，5-10min內(nèi)能凝固成固體， 該特性在培養(yǎng)細(xì)菌方面的主要用途是分離純化細(xì)菌，細(xì)菌在固化的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落，分 離純化時(shí)挑出單個(gè)菌落即可。2、各組分分裝前均經(jīng)無(wú)菌處理，用于微生物培養(yǎng)可以直接使 用，無(wú)需要再次滅菌，使用方便。3、加有微生物特異性顯色劑，微生物培養(yǎng)過(guò)程中微生物特 異性顯色劑能使菌落顯色，易于區(qū)分菌落和樣品固態(tài)殘?jiān)?，方便?jì)數(shù)。4、殼聚糖原料豐富易 得，制備的水凝膠培養(yǎng)基無(wú)毒、生物相容性好，能降解。而傳統(tǒng)培養(yǎng)基的凝固劑原料緊缺價(jià) 格1?。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以下所舉實(shí)施例是為便于更好地理解本 發(fā)明，但并不用來(lái)限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下 述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店或廠(chǎng)商購(gòu)買(mǎi)得到。
[0020] 以下實(shí)施例、實(shí)驗(yàn)例中所使用的試劑來(lái)源為：
[0021] 殼聚糖，濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司生產(chǎn)，60目；
[0022] 甘油磷酸鈉，阿法埃莎天津化學(xué)有限公司；
[0023] 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司；
[0024] 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司，批號(hào)20121123。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] 2g水溶性殼聚糖、45g β甘油磷酸鈉，經(jīng)鈷60輻射滅菌；0· 3g TTC溶于30ml蒸餾 水中，經(jīng)0. 45 μ m除菌濾膜過(guò)濾除菌，備用。
[0027] 取100ml經(jīng)121°C高壓滅菌20min的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，室溫條件下先溶入2g水溶 性殼聚糖，然后在25°C條件下往殼聚糖營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中加交聯(lián)劑聚乙烯醇0. 8g，持續(xù)攪 拌成清亮液體，逐滴加入戊二醒〇. 2ml，交聯(lián)反應(yīng)lOmin，形成清亮液體。在冰浴條件下往交 聯(lián)反應(yīng)后的液體中逐步加入45g β甘油磷酸鈉，邊加邊攪拌45min至清亮溶液，然后加20ml TTC溶液，攪拌，用磷酸氫二鈉飽和溶液調(diào)節(jié)體系pH值到7. 1左右，混勻分裝至無(wú)菌離心管 中，每管20ml，即成溫敏水凝膠培養(yǎng)基（一）。
[0028] 使用時(shí)按常規(guī)方法在培養(yǎng)皿中加1ml待培養(yǎng)樣品，取一管溫敏水凝膠培養(yǎng)基，倒 入培養(yǎng)皿中，搖勻，放37°C孵箱中培養(yǎng)48h左右，有紅色菌落顯現(xiàn)，即可計(jì)數(shù)。
[0029] 實(shí)施例2
[0030] 1. 5g水溶性殼聚糖、30gi3甘油磷酸鈉，經(jīng)鈷60輻射滅菌；0. 3gTTC溶于30ml蒸 餾水中，經(jīng)0. 45 μ m除菌濾膜過(guò)濾除菌，備用。
[0031] 取100ml經(jīng)121°C高壓滅菌20min的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，室溫條件下先溶入1. 5g水 溶性殼聚糖，然后在25°C條件下往殼聚糖營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中加交聯(lián)劑聚乙烯醇0. 4g，持續(xù) 攪拌成清亮液體，交聯(lián)反應(yīng)40min，形成清亮液體。在冰浴條件下往交聯(lián)反應(yīng)后的液體中逐 步加入30g β甘油磷酸鈉，邊加邊攪拌45min至清亮溶液，然后加20ml細(xì)菌指示劑TTC溶 液，攪拌，用磷酸氫二鈉飽和溶液調(diào)節(jié)體系pH值到7. 1左右，混勻分裝至無(wú)菌離心管中，每 管20ml，即成溫敏水凝膠培養(yǎng)基（二）。
[0032] 實(shí)施例3
[0033] 4g水溶性殼聚糖、50gi3甘油磷酸鈉，經(jīng)鈷60輻射滅菌；0. 3gTTC溶于30ml蒸餾 水中，經(jīng)0. 45 μ m除菌濾膜過(guò)濾除菌，備用。
[0034] 取100ml經(jīng)121°C高壓滅菌20min的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，室溫條件下先溶入4g水溶 性殼聚糖，然后在25°C條件下往殼聚糖營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中加交聯(lián)劑聚乙烯醇1. 4g，持續(xù)攪 拌成清亮液體，逐滴加入戊二醒〇. 6ml，交聯(lián)反應(yīng)lOmin，形成清亮液體。在冰浴條件下往交 聯(lián)反應(yīng)后的液體中逐步加入50g β甘油磷酸鈉，邊加邊攪拌45min至清亮溶液，然后加20ml 細(xì)菌指示劑TTC溶液，攪拌，用磷酸氫二鈉飽和溶液調(diào)節(jié)體系pH值到7. 1左右，混勻分裝至 無(wú)菌離心管中，每管20ml，即成溫敏水凝膠培養(yǎng)基（三）。
[0035] 實(shí)驗(yàn)例1
[0036] 1.實(shí)驗(yàn)方法
[0037] 將沙門(mén)氏菌ATCC13311、糞鏈球菌CMCC1. 1030、銅綠假單胞菌ATCC25619和大腸埃 希氏菌ATCC29522的新鮮肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行10倍梯度稀釋至ΚΓ8,分別吸取lmL稀釋液，力口 入無(wú)菌平皿，傾注20mL實(shí)施例1-3制備的溫敏水凝膠培養(yǎng)基，混勻，于37°C正置培養(yǎng)24h? 48h，觀(guān)察結(jié)果。同時(shí)以常規(guī)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)照培養(yǎng)。
[0038] 2.試驗(yàn)結(jié)果
[0039] 表 1
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基由下述成分制成：殼聚糖1-5 重量份，交聯(lián)劑0-2重量份，溫敏劑20-50重量份，微生物特異性顯色劑0. 2-0. 4重量份，微 生物鑒別培養(yǎng)基100重量份和pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH值為7. 0-7. 2。
2. 如權(quán)利要求1所述的溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基，其特征在于，所述殼聚糖為N-脫乙 酰度在70?90 %的殼聚糖及其衍生物。
3. 如權(quán)利要求1所述的溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基，其特征在于，所述交聯(lián)劑選自聚乙 烯醇、戊二醛和異丁醇中的至少一種。
4. 如權(quán)利要求1所述的溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基，其特征在于，所述溫敏劑選自α甘 油磷酸鈉、β甘油磷酸鈉和無(wú)水甘油磷酸鈉中的至少一種。
5. 如權(quán)利要求1所述的溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基，其特征在于，所述微生物特異性 顯色劑為T(mén)TC指示劑、碘、三糖鐵、磷鑰酸、磷酸鉍鉀、甲基紅、考馬斯亮藍(lán)G-250、七葉靈、 5_溴-4-氯-3-吲哚-肌醇磷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚-葡萄糖吡喃糖苷酸、鄰硝基酚β -D 葡萄糖苷酸酶、丙烯乙二醇、5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D半乳糖吡喃糖苷酸、甲苯胺藍(lán)、甲基 綠、丫啶橙和5-溴-4-氯-3-吲哚-胸苷-3-磷酸中的至少一種。
6. 如權(quán)利要求1所述的溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基，其特征在于，所述微生物鑒別培養(yǎng) 基為營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液、酪素培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、H2S試驗(yàn)培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng) 基、遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基或伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基。
7. 如權(quán)利要求1所述的溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基，其特征在于，所述pH調(diào)節(jié)劑為磷酸 氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化銨、碳酸鈉或碳酸氫鈉。
8. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基的制備方法，其特征在 于，該方法包括如下步驟： A. 按照權(quán)利要求1所述成分和配比稱(chēng)取試劑，將各試劑和容器進(jìn)行無(wú)菌處理； B. 殼聚糖溶于微生物鑒別培養(yǎng)基中；在室溫條件下往該培養(yǎng)基中加交聯(lián)劑，持續(xù)攪拌 下交聯(lián)反應(yīng)10-45分鐘，形成清亮液體； C. 在冰浴條件下往交聯(lián)反應(yīng)后的液體中逐滴加入溫敏劑，攪拌30-60min至清亮溶液， 加入微生物特異性顯色劑，攪拌溶解，用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)體系pH值到7. 0-7. 2。
9. 一種溫敏水凝膠微生物培養(yǎng)基，其特征在于，其是采用權(quán)利要求8所述方法制備的。
【文檔編號(hào)】C12Q1/06GK104099283SQ201410350404
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】張維, 陳春田 申請(qǐng)人:張維, 陳春田