一種穩(wěn)定的液體復(fù)配酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種穩(wěn)定的液體復(fù)配酶及其制備方法，屬于液體復(fù)配酶制備【技術(shù)領(lǐng)域】，以啤酒釀造用液體酶制劑為主要原料，科學(xué)復(fù)配糖、多元醇、氨基酸、增稠劑、白蛋白、金屬離子等穩(wěn)定劑和促進酶制劑更加穩(wěn)定的酒花提取物、中草藥提取液、抗菌肽等具有防腐作用的物質(zhì)，完全替代了防腐劑的添加，不僅有效的抑制了有害微生物的繁殖和生長，而且能夠和其它組分協(xié)同穩(wěn)定液體復(fù)配酶的活性，從根本上提高了液體復(fù)配酶的生物穩(wěn)定性和酶活力穩(wěn)定性，有效延長了液體酶制劑的保質(zhì)期。制備的液體復(fù)配酶在室溫儲存12個月菌落總數(shù)為168-214CFU/mL；在40℃和0℃條件下儲存12個月，酶活損失率分別為2-2.5％和1-1.7％。
【專利說明】一種穩(wěn)定的液體復(fù)配酶

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及液體復(fù)配酶，具體涉及一種穩(wěn)定的液體復(fù)配酶。

【背景技術(shù)】
[0002] 液體酶制劑是一種使用方便，綠色環(huán)保，生物降解性良好的原料。專一的催化特性 及溫和的反應(yīng)條件，在工業(yè)界得到越來越多的使用和重視。在使用方面液體酶制劑具有以 下優(yōu)點：1)液體酶制劑以分子或微粒狀態(tài)分散在底物中，分散度大，吸收快，能較迅速地發(fā) 生酶解反應(yīng)，酶活性高；2)易于分劑量，容易復(fù)配和二次加工，使用方便；3)有利于提高酶 制劑的利用率，4)直接使用，無須溶解和活化；5)純度高、雜質(zhì)含量低；6)生產(chǎn)過程短、成本 低；7)生產(chǎn)加工和使用過程中不會造成粉塵污染，有利于保護環(huán)境；但是，液體酶制劑體積 較大，攜帶、運輸、貯存都不方便，酶活性容易受到高溫、冷凍、光照、酸堿性、氧化、濕度等貯 存環(huán)境的影響而顯著降低，并且因為液體酶制劑的水分活度較高，很容易受到微生物的污 染而失活。因此，液體酶制劑的應(yīng)用受到限制，最主要的原因就是其穩(wěn)定性較差，包括生物 穩(wěn)定性和物理、化學(xué)穩(wěn)定性。
[0003] 為了解決上述問題，現(xiàn)有的酶制劑生產(chǎn)廠家便將經(jīng)濃縮、分離后的液體酶制劑添 加穩(wěn)定劑、防腐劑、表面活性劑、金屬離子等，以提高液體酶制劑的生物穩(wěn)定性、非生物穩(wěn)定 性和使用效果，拓寬其在食品、紡織、造紙、洗滌、飼料等領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，由此，液體復(fù)配酶 應(yīng)運而生，總體來說，液體復(fù)配酶分為兩種，一種是單一液體復(fù)配酶，即由一種液體酶制劑 和添加劑加工而成；另一種是多種液體復(fù)配酶，是由多種液體酶制劑和添加劑加工而成。因 為酶制劑作用底物的單一性和作用條件的多樣性、差異性，目前，市場上用于工業(yè)化的液體 酶制以單一液體復(fù)配酶為主，多種液體復(fù)配酶較少，幾乎沒有。
[0004] 液體復(fù)配酶復(fù)配的首要前提條件是應(yīng)用領(lǐng)域，要具體到加工成品的產(chǎn)品特性，如 果不考慮產(chǎn)品特性的因素而進行盲目的為了提高穩(wěn)定性的復(fù)配，不但不會有效發(fā)揮酶制劑 的作用，反而會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，甚至?xí)劤芍卮笊a(chǎn)事故。因此液體復(fù)配酶的制備要綜 合考慮多方面的因素。
[0005] 目前，市場上的液體復(fù)配酶主要集中在造紙、洗滌、食品、飼料、酒精制備等技術(shù)領(lǐng) 域，且以單種液體復(fù)配酶為主，其中添加穩(wěn)定劑有甘油等多元醇和黃原膠、明膠，CMC等表面 活性劑、聚醇類表面活性劑、脂肪醇聚氧乙烯醚化合物、pvp等高分子化合物、氯化鈉等金屬 氯化物、陰陽離子表面活性劑、苯甲酸鈉等防腐劑等，添加劑的種類還與酶的種類、同一酶 的作用底物和條件、添加劑的物理和化學(xué)性質(zhì)、酶作用效果等多種因素有關(guān)，并非能夠統(tǒng)一 添加、使用。
[0006] 與其它發(fā)酵工業(yè)不同的是，在轟轟烈烈的消泡戰(zhàn)役中，啤酒釀造自始至終在最大 限度的保持泡沫，啤酒泡持性是啤酒的重要理化和感官指標(biāo)之一。啤酒在外觀上不同于其 它飲料的一個重要特點：就是在倒入杯中時，會產(chǎn)生潔白細(xì)膩的泡沫，給人以潔凈、清爽 感，促進人們的飲欲。因此啤酒的泡持性成為消費者認(rèn)識啤酒品牌的重要特征。啤酒的泡 持性通常是指：啤酒的起泡性，持久性和附著性。液體復(fù)配酶某些穩(wěn)定劑和表面活性劑會 起到強力消泡劑的作用，氯化鈉的添加會是啤酒產(chǎn)生咸味，影響口感，防腐劑的添加會對人 體產(chǎn)生毒害……。
[0007] 因此，對于啤酒釀造工業(yè)來說，制備一種安全、穩(wěn)定、作用效果顯著的液體復(fù)配酶 限制條件較多，尤其顯得困難，制備一種適合啤酒釀造的多種液體復(fù)配酶更加困難，目前， 還未見公開的啤酒多種液體復(fù)配酶的報道。中國專利CN 101617740B公開了一種酶活保有 率高的飼用液體植酸酶制劑。本發(fā)明是在植酸酶原酶液中加入聚乙二醇6000、海藻糖、苯甲 酸鈉、純水，調(diào)節(jié)PH值為4. 5?5. 5 :其中聚乙二醇6000中的羥基與酶蛋白分子表面及其活 性中心的羧基、氨基等以共價鍵、氫鍵及范德華力等結(jié)合，從而使酶蛋白分子的活性中心和 整個酶蛋白分子得到保護；海藻糖（穩(wěn)定劑），提高酶溶液的滲透壓，使酶蛋白分子的舒展 度降低，分子相對處于脫水狀態(tài)而收縮，從而提高穩(wěn)定性；苯甲酸鈉（防腐劑）及優(yōu)選pH范 圍（4. 5?5. 5)，均起到提高液體酶的生物穩(wěn)定性的作用。中國專利CN 101717765B公開一 種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)配酶制劑，其特征在于該酶制劑是一種液體酶制劑；其組成為： 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、甘油、CaC12、PEG400以及明膠；所述環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶為蛋 白質(zhì)含量為3g/L-5g/L的發(fā)酵液，甘油濃度為10% -20% (體積分?jǐn)?shù)），CaC12濃度為0. lg/ 1^-0.28/1^6400濃度為5<%-10(%(體積分?jǐn)?shù)），明膠濃度為0.5 (%-1(%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。具 有極其優(yōu)異的儲存穩(wěn)定性，在40°C保存60天，其酶活保留率仍高達95%以上，解決了由于 產(chǎn)品運送或儲存時間較長導(dǎo)致產(chǎn)品應(yīng)用性能下降的問題。本發(fā)明提供的液體酶制劑復(fù)配方 法簡單，原料來源豐富并且成本低，特別適合在工業(yè)上推廣。中國專利CN 103131557B公開 了一種液體洗滌劑用酶制劑復(fù)合穩(wěn)定劑，涉及酶穩(wěn)定劑，解決現(xiàn)有液體洗滌劑中酶穩(wěn)定性 差，且傳統(tǒng)酶穩(wěn)定劑主要使用硼砂，對人體存在潛在危害的問題。一種液體洗滌劑用酶制劑 復(fù)合穩(wěn)定劑，由以下重量份的各組分組成：環(huán)糊精〇. 05?20、氯化鈣0. 05?20、甘油和丙 二醇混合物1?10、非離子表面活性劑脂肪醇聚氧乙烯醚1?60、陰離子表面活性劑烷基 苯磺酸鈉1?60 ;其中所述的甘油與丙二醇混合物中甘油：丙二醇的重量比為2:6?10。本 發(fā)明可簡化液體洗滌劑的生產(chǎn)及配方過程，顯著提高和延長液體洗滌劑中酶制劑的活性， 原料安全無毒，對人體無害。上述公開的液體酶制劑及穩(wěn)定劑均不適合啤酒釀造生產(chǎn)。
[0008] 綜上，制備一種適合啤酒釀造的安全、穩(wěn)定、效果顯著的多種液體復(fù)配酶具有廣闊 的市場空間和良好的市場價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是將一種或多種經(jīng)濃縮、分離的液體酶制劑按照啤酒釀 造用途合理調(diào)配，并科學(xué)復(fù)配糖、多元醇、氨基酸、增稠劑、白蛋白、金屬離子等穩(wěn)定劑和促 進酶制劑更加穩(wěn)定的酒花提取物、中草藥提取液、抗菌肽等具有防腐作用的物質(zhì)，有效地提 高了液體復(fù)配酶的酶活力穩(wěn)定性和生物穩(wěn)定性，在啤酒釀造中發(fā)揮了重要的催化劑作用， 同時還改善了啤酒的口感和泡沫性能等質(zhì)量指標(biāo)，無須添加防腐劑，制備出一種適合啤酒 釀造的安全、穩(wěn)定、效果顯著的液體復(fù)配酶。
[0010] 本發(fā)明的首要目的是提供一種穩(wěn)定的液體復(fù)配酶。
[0011] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0012] 一種穩(wěn)定的液體復(fù)配酶，由以下重量份數(shù)的原料制備：
[0013] 液體酶制劑40-60份，啤酒花提取液10-15份，糖5-10份，天然抗氧化劑6-10份， 中草藥提取液6-10份，抗菌肽8-10份，增稠劑3-5份，β -環(huán)糊精3-5份，多兀醇2-5份，谷 胱甘肽2-4份，金屬氯化物1-3份，硫酸銨1-2份，半胱氨酸0. 5-1份，牛血清白蛋白0. 1-0. 3 份。
[0014] 所述液體酶制劑的適宜溫度為35-115°C，適宜pH值為2. 5-6 ;
[0015] 進一步地，所述液體酶制劑選自由葡聚糖酶、木聚糖酶、中溫淀粉酶、α -淀粉酶、 耐高溫α-淀粉酶、真菌α-淀粉酶、異淀粉酶、糖化酶、β-淀粉酶、普魯蘭酶、木瓜蛋白 酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、脯氨酸蛋白酶、無花果蛋白酶、β-葡聚糖酶、耐 溫β -葡聚糖復(fù)合酶、β -葡聚糖復(fù)合酶、甘露聚糖酶、戊聚糖酶、酸性磷酸酶、脂肪酶、磷酸 酯酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖異構(gòu)酶、單寧酶、乳糖酶、過氧化氫酶、α -乙酰乳酸脫羧酶組成的 組中的任一種或幾種，但不局限于這些酶，也可適用于其他工業(yè)酶制劑。液體酶不僅包括來 自自然條件下的菌株產(chǎn)生的酶，而且包括通過基因工程改造的工程菌產(chǎn)生的酶；
[0016] 優(yōu)選地，所述液體酶制劑由中溫淀粉酶、葡聚糖酶、木聚糖酶按體積比 5- 6:2-4:1-3均勻混合；
[0017] 進一步地，所述啤酒花提取液的制備方法為：將啤酒花置超聲波清洗機中于 200W、40KHz清洗10-15min，浙干，于-18--22°C冷凍l_2h后立即進行粉碎，冷凍料層厚度 3-5cm，粉碎粒度0. 5-3mm，加入粉碎啤酒花重量1-3倍的乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇 混合的質(zhì)量比為2-4:1-3,用乳酸調(diào)節(jié)pH值為3. 0-3. 5,在功率150-300W、頻率2000Hz、溫 度20-35°C條件下進行微波提取20-30min，同時在功率200-300W，頻率30-40KHZ條件下進 行超聲波輔助提??；保溫l_3h，然后，在功率200-400W、頻率2000Hz條件下進行微波提取 15-20min，同時在功率300-500W，頻率40-50KHZ條件下進行超聲波輔助提取，最后自然降 溫至室溫，過濾，濾液于電場強度35-45kV/cm，脈沖時間400-600 μ s，脈沖頻率200-300HZ 條件下進行高壓脈沖電場（PEF)殺菌20-30min即得啤酒花提取液；
[0018] 所述啤酒花為新鮮成熟啤酒花、壓縮片花或壓縮顆粒酒花，優(yōu)選新鮮成熟啤酒花； 在采用顆粒酒花時，無須清洗；
[0019] 優(yōu)選地，所述超聲波清洗采用質(zhì)量百分比濃度為0. 2-0. 8%的碳酸氫鈉溶液為清 洗劑；
[0020] 優(yōu)選地，所述乙醇和丙醇混合的質(zhì)量比為3:2 ;
[0021] 優(yōu)選地，所述微波提取采用間歇式提取，即微波輻照20s，停止10s，如此循環(huán)；
[0022] 所述乙醇濃度彡75%。
[0023] 進一步地，所述糖為海藻糖、靈芝多糖、葡萄糖中一種或多種；
[0024] 優(yōu)選地，所述糖為海藻糖、靈芝多糖、葡萄糖按質(zhì)量比8-10:1-3:5-9均勻混合。
[0025] 進一步地，所述天然抗氧化劑為葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏葉提取物中 的任 種或幾種組合；
[0026] 優(yōu)選地，所述葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏葉提取物混合的質(zhì)量比為 6- 8:5-7:2-4 ；
[0027] 進一步地，所述中草藥提取液的制備方法為：按重量份數(shù)計，準(zhǔn)確稱取黃芪60-70 份，當(dāng)歸55-65份，黨參40-45份，甘草40-45份，魚腥草35-45份，神曲35-45份，金銀花 25-35份，茯苓20-30份，遠(yuǎn)志15-25份，炒茴香15-25份，白術(shù)10-20份，厚樸10-20份；分別 將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控 制溫度70°C -90°C保持2-4h，然后降溫至45-60°C，加入混合物料總重量5-10%的混合酶制 劑進行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5. 5-6. 8,酶解2-4h，最后添加混合物料0. 5-3倍重量乙醇 和丙醇的混合物，控制溫度至60°C -78°C保持3-4h，過濾，得第一濾液；添加濾渣1-3倍重 量的水，控制溫度85°C -95°C保持l_3h，然后降溫至25-35°C，過濾，得第二濾液；將第一濾 液和第二濾液按照質(zhì)量比2-3:1-2合并，于電場強度35-45kV/cm，脈沖時間400-600 μ s， 脈沖頻率300-400ΗΖ條件下進行高壓脈沖電場（PEF)殺菌20-30min即得中草藥提取液；
[0028] 優(yōu)選地，所述第一濾液和第二濾液合并的質(zhì)量比為2. 5:1. 5 ;
[0029] 所述混合酶的重量份數(shù)組成為：內(nèi)β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20 份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份， β-淀粉酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，果膠酶10-15份，甘露糖酶10-15份，葡萄糖氧 化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份，脂肪酶5-8份；
[0030] 所述乙醇和丙醇混合的質(zhì)量比為1:1-2,所述乙醇濃度彡75%。
[0031] 進一步地，所述多元醇為聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫蘇糖醇、疏基乙醇中的一 種或幾種；
[0032] 優(yōu)選地，所述多元醇由聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫蘇糖醇按質(zhì)量比 8-10:4-6:2-4:1-3 均勻混合。
[0033] 進一步地，所述增稠劑為卡拉膠、阿拉伯膠、明膠、黃原膠、海藻膠、CMC、瓊脂、蜂 膠、紫膠、果膠、瓜爾豆膠、皂莢糖膠、亞麻子膠、魔芋膠中一種或者多種；
[0034] 優(yōu)選地，所述增稠劑由卡拉膠、阿拉伯膠、明膠、黃原膠、CMC按質(zhì)量比 3-5:2-4:1-3:1-2:0. 5-1 均勻混合。
[0035] 進一步地，所述金屬氯化物為氯化鋅、氯化鈣、氯化鈉、氯化鎂、氯化鐵中的一種或 多種；
[0036] 優(yōu)選地，所述金屬氯化物為氯化鋅、氯化鈣、氯化鈉、氯化鎂、氯化鐵按質(zhì)量比 3-5:2-3:1-3:1-2:0· 1-0. 3 均勻混合。
[0037] 本發(fā)明另一目的是提供一種穩(wěn)定的液體復(fù)配酶的制備方法，包括如下步驟：
[0038] 以重量份數(shù)計，按照上述配方首先準(zhǔn)確稱取增稠劑，加入其質(zhì)量4-6倍的無菌水， 室溫浸泡3-8h，邊升溫邊攪拌，80-90°C保溫20-30min，攪拌，充分溶解，繼續(xù)保溫，邊攪拌 邊依次加入β-環(huán)糊精、多元醇、糖、金屬氯化物，然后降溫至25-35°C，邊攪拌邊依次加入 硫酸銨、半胱氨酸、谷胱甘肽、抗菌肽、天然抗氧化劑、牛血清白蛋白、中草藥提取液、啤酒花 提取液、液體酶制劑充分溶解、混合，用乳酸調(diào)節(jié)液體復(fù)配酶pH值為2. 5-6,穩(wěn)定0. 5-2h，同 時于電場強度35-45kV/cm，脈沖時間400-600μ s，脈沖頻率300-400HZ條件下進行高壓脈 沖電場（PEF)殺菌，除菌過濾、無菌灌裝即得液體復(fù)配酶。
[0039] 本發(fā)明還有一個目的是液體復(fù)配酶在啤酒釀造中的應(yīng)用。
[0040] 使用方法：
[0041] 糖化階段將本發(fā)明啤酒液體復(fù)配酶加入糖化鍋
[0042] 添加量：根據(jù)麥芽質(zhì)量的不同和釀造輔料的比例高低，每t干麥芽添加 500-1000ml ；
[0043] 作用條件：最適PH值4. 5-5. 5 ;最適溫度35-68°C ;最佳料水質(zhì)量比1:4. 5-5. 5。
[0044] 有益效果：
[0045] 1.本發(fā)明制備的啤酒花提取液、中草藥提取液采用低溫提取技術(shù)，最大限度地將 酒花和中草藥中的有效成分保留，并與抗菌肽科學(xué)復(fù)配，完全替代了防腐劑的添加，不僅有 效的抑制了有害微生物的繁殖和生長，而且能夠和其它組分協(xié)同穩(wěn)定液體復(fù)配酶的活性， 從根本上提高了液體復(fù)配酶的生物穩(wěn)定性和酶活力穩(wěn)定性，有效延長了液體酶制劑的保質(zhì) 期。制備的液體復(fù)配酶在室溫儲存12個月菌落總數(shù)為168-214CFU/mL ;在40°C和0°C條件 下儲存12個月，酶活損失率分別為2-2. 5%和1-1. 7%。
[0046] 2.本發(fā)明在長時間的試驗基礎(chǔ)上，科學(xué)復(fù)配了具有消泡劑作用的多元醇，多元醇 是一類效果較好的酶制劑穩(wěn)定劑，與其它組分如啤酒花提取液、糖、增稠劑、β -環(huán)糊精、中 草藥提取液等一起，不僅沒有對糖化麥汁、發(fā)酵液、成品的泡沫性能和口感產(chǎn)生影響，反而 有所提升，取得了意想不到的效果。與市售液體糖化酶相比，麥芽香味與酒花香味明顯、柔 和協(xié)調(diào)，泡沫性能優(yōu)良，泡持性時間長；濁度較低，雙乙酰含量較低，發(fā)酵良好，酒精度較高， 成品啤酒無論是感官指標(biāo)還是理化指標(biāo)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)先于普通啤酒復(fù)配酶，達到或超過了國家 現(xiàn)行啤酒優(yōu)級標(biāo)準(zhǔn)。
[0047] 3.本發(fā)明將天然抗氧化劑與谷胱甘肽科學(xué)復(fù)配于液體酶制劑中，不僅起到了較強 的抗氧化作用，避免了液體酶制劑中的溶解氧對酶分子蛋白和其它組分的氧化，更重要的 是天然抗氧化劑中的原花青素有效抑制了酶制劑蛋白的硝基化反應(yīng)和非酶糖基化反應(yīng)，顯 著提高了液體酶制劑蛋白的活力穩(wěn)定性。
[0048] 4.本發(fā)明中的牛血清白蛋白是牛血清中的一種球蛋白，包含583個氨基酸殘基， 可有效防止酶的分解和非特異性吸附，對有些內(nèi)切酶效果更加顯著，與其它組分如：谷胱甘 肽、金屬氯化物、多元醇、硫酸銨等科學(xué)復(fù)配，大大提高了液體復(fù)配酶的酶活穩(wěn)定性。
[0049] 5.本發(fā)明的液體復(fù)配酶的制備方法工藝簡單、操作方便、可規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)，采用 高壓脈沖電場低溫殺菌技術(shù)（PEF)，既保證了液體酶制劑蛋白的生化活性，又有效殺滅和抑 制了微生物的繁殖和生長，顯著提高了液體酶制劑的酶活穩(wěn)定性和生物穩(wěn)定性，有效延長 了液體酶制劑的保質(zhì)期。

【具體實施方式】
[0050] 下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段 均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也 屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0051] 以下主要原料來源：
[0052] 1.經(jīng)分離、濃縮的液體中溫淀粉酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、糖化酶均由湖南鴻鷹生 物科技股份有限公司生產(chǎn)，其中：
[0053] 中溫淀粉酶的活力為500-2000U/mL，最適反應(yīng)溫度為60-70°C，最適pH值為5-6 ;
[0054] 葡聚糖酶的活力為5000-12000U/mL，最適反應(yīng)溫度為40-65°C，最適pH值為 4-5. 5 ；
[0055] 木聚糖酶的活力為5000-20000U/mL，最適反應(yīng)溫度為50-65°C，最適pH值為 3. 5-6 ；
[0056] 糖化酶的活力為150000-200000U/mL，最適反應(yīng)溫度為60-70°C，最適pH值為5-6。
[0057] 2.新鮮成熟啤酒花采自新疆啤酒花股份有限公司種植基地。
[0058] 3.糖、增稠劑、β_環(huán)糊精、半胱氨酸均購自上海權(quán)旺生物科技有限公司。
[0059] 4.葡萄籽原花青素購買于河南安陽晶森生物科技有限公司，有效成分：0PC/ Polyphenol, Assay 0PC95% /polyphenol90% ；
[0060] 銀杏葉提取物購買于徐州恒凱銀杏制品有限公司，中國藥典2010版銀杏葉提取 物，總黃酮醇苷彡24%，產(chǎn)品注冊商標(biāo)：公孫堂Ginkgo Town ;
[0061] 迷迭香提取物購買于河南森源本草天然產(chǎn)物股份有限公司，主要成分：迷迭香酸、 迷迭香酚等，含量85 %，注冊商標(biāo)森源本草；
[0062] 上述產(chǎn)品均為固體粉末。
[0063] 5.抗菌肽購自廣東天浩生物工程股份有限公司，為食品用抗菌肽K-100,型號 K-100。
[0064] 6.谷胱甘肽購自西安融升生物科技有限公司，為食品用谷胱甘肽，谷胱甘肽含量 99%，產(chǎn)品編號：P0200375。
[0065] 7.牛血清白蛋白購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，lg國產(chǎn)cas:9048-46-8。
[0066] 實施例1啤酒花提取液的制備
[0067] 所述啤酒花提取液的制備方法為：將新鮮成熟啤酒花置超聲波清洗機中于200W、 40KHz清洗12min，浙干，于-20°C冷凍1. 5h后立即進行粉碎，冷凍料層厚度4cm，粉碎粒度 2mm,加入粉碎啤酒花重量2倍的乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的質(zhì)量比為3:2， 用乳酸調(diào)節(jié)pH值為3. 2,在功率200W、頻率2000Hz、溫度30°C條件下進行微波間歇式提取 25min，同時在功率300W，頻率35KHz條件下進行超聲波輔助提?。槐?h，然后，在功率 300W、頻率2000Hz條件下進行微波提取18min，同時在功率400W，頻率45KHz條件下進行超 聲波輔助提取，最后自然降溫至室溫，過濾，濾液于電場強度40kV/cm，脈沖時間500 μ s，脈 沖頻率250Hz條件下進行高壓脈沖電場（PEF)殺菌25min即得啤酒花提取液；
[0068] 所述超聲波清洗采用質(zhì)量百分比濃度為0. 2-0. 8%的碳酸氫鈉溶液為清洗劑；
[0069] 所述間歇式提取為微波輻照20s，停止10s，如此循環(huán)；
[0070] 所述乙醇濃度為80%。
[0071] 實施例2中草藥提取液的制備
[0072] 所述中草藥提取液的制備方法為：按重量份數(shù)計，準(zhǔn)確稱取黃芪65份，當(dāng)歸60份， 黨參42份，甘草42份，魚腥草40份，神曲40份，金銀花30份，茯苓25份，遠(yuǎn)志20份，炒茴 香20份，白術(shù)15份，厚樸15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器 中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至50°C，加入混合物料總 重量8%的混合酶制劑進行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為6. 2,酶解3h，最后添加混合物料1. 8 倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的質(zhì)量比為1:2,控制溫度至70°C保持4h，過 濾，得第一濾液；添加濾渣2倍重量的水，控制溫度90°C保持2h，然后降溫至30°C，過濾，得 第二濾液；將第一濾液和第二濾液按照質(zhì)量比2. 5:1. 5合并，于電場強度40kV/cm，脈沖時 間500 μ s，脈沖頻率350Hz條件下進行高壓脈沖電場（PEF)殺菌25min即得中草藥提取 液；
[0073] 所述混合酶的重量份數(shù)組成為：內(nèi)葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶18份， β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶12份， 酸性蛋白酶12份，果膠酶12份，甘露糖酶12份，葡萄糖氧化酶6份，酸性磷酸酶8份，脂肪 酶6份；
[0074] 所述乙醇濃度為75%。
[0075] 實施例3
[0076] -種穩(wěn)定的液體復(fù)配酶，由以下重量份數(shù)的原料制備：
[0077] 液體酶制劑50份，啤酒花提取液12份，糖8份，天然抗氧化劑8份，中草藥提取液 8份，抗菌肽9份，增稠劑4份，β -環(huán)糊精4份，多元醇3份，谷胱甘肽3份，金屬氯化物2 份，硫酸銨2份，半胱氨酸0. 8份，牛血清白蛋白0. 2份。
[0078] 所述液體酶制劑由中溫淀粉酶、葡聚糖酶、木聚糖酶按體積比5. 5:3:2均勻混合；
[0079] 所述糖為海藻糖、靈芝多糖、葡萄糖按質(zhì)量比9:2:7均勻混合；
[0080] 所述天然抗氧化劑由葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏葉提取物按質(zhì)量比 7:6:3均勻混合；
[0081] 所述增稠劑由卡拉膠、阿拉伯膠、明膠、黃原膠、CMC按質(zhì)量比4:3:2:1.5:0. 8均勻 混合；
[0082] 所述多元醇由聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫蘇糖醇按質(zhì)量比9:5:3:2均勻混 合；
[0083] 所述金屬氯化物為氯化鋅、氯化鈣、氯化鈉、氯化鎂、氯化鐵按質(zhì)量比 4:2. 5:2:1. 5:0. 2 均勻混合；
[0084] 所述啤酒花提取液由實施例1制備；
[0085] 所述中草藥提取液由實施例2制備；
[0086] 制備方法：以重量份數(shù)計，按照上述配方首先準(zhǔn)確稱取增稠劑，加入其質(zhì)量5倍的 無菌水，室溫浸泡6h，邊升溫邊攪拌，85°C保溫25min，攪拌，充分溶解，繼續(xù)保溫，邊攪拌 邊依次加入β-環(huán)糊精、多元醇、糖、金屬氯化物，然后降溫至30°C，邊攪拌邊依次加入硫酸 銨、半胱氨酸、谷胱甘肽、抗菌肽、天然抗氧化劑、牛血清白蛋白、中草藥提取液、啤酒花提取 液、液體酶制劑充分溶解、混合，用乳酸調(diào)節(jié)液體復(fù)配酶pH值為5. 2,穩(wěn)定1. 5h，同時于電場 強度40kV/cm，脈沖時間500 μ s，脈沖頻率350Hz條件下進行高壓脈沖電場（PEF)殺菌，除 菌過濾、無菌灌裝即得液體復(fù)配酶。
[0087] 經(jīng)上述方法制備的液體復(fù)配酶在室溫儲存12個月菌落總數(shù)為168CFU/mL ;在40°C 和〇°C條件下儲存12個月，酶活損失率分別為2 %和1%。
[0088] 實施例4
[0089] -種穩(wěn)定的液體復(fù)配酶，由以下重量份數(shù)的原料制備：
[0090] 液體酶制劑40份，啤酒花提取液10份，海藻糖5份，葡萄籽原花青素6份，中草藥 提取液6份，抗菌肽8份，明膠3份，β -環(huán)糊精3份，多元醇2份，谷胱甘肽2份，金屬氯化 物1份，硫酸銨1份，半胱氨酸〇. 5份，牛血清白蛋白0. 1份。
[0091] 所述液體酶制劑由中溫淀粉酶、葡聚糖酶、木聚糖酶按體積比5:2:1均勻混合；
[0092] 所述多元醇由聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫蘇糖醇按質(zhì)量比8:4:2:1均勻混 合；
[0093] 所述金屬氯化物為氯化鋅、氯化鈣、氯化鈉、氯化鎂、氯化鐵按質(zhì)量比3:2:1:1:0. 1 均勻混合；
[0094] 所述啤酒花提取液由實施例1制備；
[0095] 所述中草藥提取液由實施例2制備；
[0096] 制備方法同實施例3。
[0097] 經(jīng)上述方法制備的液體復(fù)配酶在室溫儲存12個月菌落總數(shù)為208CFU/mL ;在40°C 和〇°C條件下儲存12個月，酶活損失率分別為2. 2 %和1.3%。
[0098] 實施例5
[0099] -種穩(wěn)定的液體復(fù)配酶，由以下重量份數(shù)的原料制備：
[0100] 液體酶制劑60份，啤酒花提取液15份，糖10份，天然抗氧化劑10份，中草藥提取 液10份，抗菌肽10份，黃原膠5份，β -環(huán)糊精5份，二硫蘇糖醇5份，谷胱甘肽4份，氯化 鋅3份，硫酸銨2份，半胱氨酸1份，牛血清白蛋白0. 3份。
[0101] 所述液體酶制劑由中溫淀粉酶、葡聚糖酶、木聚糖酶按體積比6:4:3均勻混合；
[0102] 所述糖為海藻糖、靈芝多糖、葡萄糖按質(zhì)量比10:3:9均勻混合；
[0103] 所述天然抗氧化劑由葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏葉提取物按質(zhì)量比 8:7:4均勻混合；
[0104] 所述啤酒花提取液由實施例1制備；
[0105] 所述中草藥提取液由實施例2制備；
[0106] 制備方法同實施例3。
[0107] 經(jīng)上述方法制備的液體復(fù)配酶在室溫儲存12個月菌落總數(shù)為214CFU/mL ;在40°C 和〇°C條件下儲存12個月，酶活損失率分別為2. 5 %和1.7%。
[0108] 實施例6
[0109] 一種穩(wěn)定的液體糖化酶，由以下重量份數(shù)的原料制備：
[0110] 糖化酶50份，啤酒花提取液12份，糖8份，天然抗氧化劑8份，中草藥提取液8份， 抗菌肽9份，增稠劑4份，β -環(huán)糊精4份，多元醇3份，谷胱甘肽3份，金屬氯化物2份，硫 酸銨2份，半胱氨酸0.8份，牛血清白蛋白0.2份。
[0111] 所述糖為海藻糖、靈芝多糖、葡萄糖按質(zhì)量比9:2:7均勻混合；
[0112] 所述天然抗氧化劑由葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏葉提取物按質(zhì)量比 7:6:3均勻混合；
[0113] 所述增稠劑由卡拉膠、阿拉伯膠、明膠、黃原膠、CMC按質(zhì)量比4:3:2:1.5:0. 8均勻 混合；
[0114] 所述多元醇由聚乙二醇、丙三醇、山梨醇、二硫蘇糖醇按質(zhì)量比9:5:3:2均勻混 合；
[0115] 所述金屬氯化物為氯化鋅、氯化鈣、氯化鈉、氯化鎂、氯化鐵按質(zhì)量比 4:2. 5:2:1. 5:0. 2 均勻混合；
[0116] 所述啤酒花提取液由實施例1制備；
[0117] 所述中草藥提取液由實施例2制備；
[0118] 制備方法同實施例3。
[0119] 經(jīng)上述方法制備的液體糖化酶在室溫儲存12個月菌落總數(shù)為168CFU/mL ;在40°C 和〇°C條件下儲存12個月，酶活損失率分別為2 %和1%。
[0120] 實施例7液體復(fù)配酶的生物穩(wěn)定性
[0121] 以本發(fā)明實施例6制備的液體糖化酶與市售相同生產(chǎn)日期的同規(guī)格液體糖化酶 為試驗對象，在相同儲藏條件（室溫、通風(fēng)、避光）下，采用《GB8726-2006食品添加劑糖化 酶制劑》中檢測方法檢測了 pH值、菌落總數(shù)、致病菌等衛(wèi)生指標(biāo)，結(jié)果如表1 :
[0122] 表1儲存12個月微生物指標(biāo)檢測結(jié)果
[0123]

【權(quán)利要求】
1. 一種穩(wěn)定的液體復(fù)配酶，由以下重量份數(shù)的原料制備：液體酶制劑40-60份，啤酒花 提取液10-15份，糖5-10份，天然抗氧化劑6-10份，中草藥提取液6-10份，抗菌肽8-10份， 增稠劑3-5份，β -環(huán)糊精3-5份，多元醇2-5份，谷胱甘肽2-4份，金屬氯化物1-3份，硫 酸銨1-2份，半胱氨酸0. 5-1份，牛血清白蛋白0. 1-0. 3份。
2. 如權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的液體復(fù)配酶，其特征在于，所述液體酶制劑由中溫淀粉 酶、葡聚糖酶、木聚糖酶按體積比5-6:2-4:1-3均勻混合。
3. 如權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的液體復(fù)配酶，其特征在于，所述啤酒花提取液的制備 方法為：將啤酒花置超聲波清洗機中于200W、40KHz清洗10-15min，浙干，于-18 --22°C 冷凍l-2h后立即進行粉碎，冷凍料層厚度3-5cm，粉碎粒度0. 5-3mm，加入粉碎啤酒花重 量1-3倍的乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的質(zhì)量比為2-4:1-3,用乳酸調(diào)節(jié)pH值 為3. 0-3. 5,在功率150-300W、頻率2000Hz、溫度20-35°C條件下進行微波提取20-30min， 同時在功率200-300W，頻率30-40KHZ條件下進行超聲波輔助提取；保溫l-3h，然后，在 功率200-400W、頻率2000Hz條件下進行微波提取15-20min，同時在功率300-500W，頻 率40-50KHZ條件下進行超聲波輔助提取，最后自然降溫至室溫，過濾，濾液于電場強度 35-45kV/cm，脈沖時間400-600μ s，脈沖頻率200-300HZ條件下進行高壓脈沖電場殺菌 20-30min即得啤酒花提取液。
4. 如權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的液體復(fù)配酶，其特征在于，所述糖為海藻糖、靈芝多糖、 葡萄糖中一種或多種。
5. 如權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的液體復(fù)配酶，其特征在于，所述天然抗氧化劑為葡萄籽 原花青素、迷迭香提取物和杏葉提取物中的任一一種或幾種。
6. 如權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的液體復(fù)配酶，其特征在于，所述中草藥提取液的制備方 法為：按重量份數(shù)計，準(zhǔn)確稱取黃芪60-70份，當(dāng)歸55-65份，黨參40-45份，甘草40-45 份，魚腥草35-45份，神曲35-45份，金銀花25-35份，茯苓20-30份，遠(yuǎn)志15-25份，炒 茴香15-25份，白術(shù)10-20份，厚樸10-20份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以 下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C -90°C保持2-4h，然后 降溫至45-60°C，加入混合物料總重量5-10%的混合酶制劑進行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值 為5. 5-6. 8,酶解2-4h，最后添加混合物料0. 5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙 醇混合的質(zhì)量比為1:1-2,控制溫度至60°C -78°C保持3-4h，過濾，得第一濾液；添加濾 渣1-3倍重量的水，控制溫度85°C -95°C保持l_3h，然后降溫至25-35°C，過濾，得第二濾 液；將第一濾液和第二濾液按照質(zhì)量比2-3:1-2合并，于電場強度35-45kV/cm，脈沖時間 400-600μ s，脈沖頻率300-400HZ條件下進行高壓脈沖電場殺菌20-30min即得中草藥提取 液； 所述混合酶的重量份數(shù)組成為：內(nèi)β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份， β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀 粉酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，果膠酶10-15份，甘露糖酶10-15份，葡萄糖氧化酶 5-10份，酸性磷酸酶5-10份，脂肪酶5-8份； 所述乙醇濃度彡75%。
7. 如權(quán)利要求1-6任一所述穩(wěn)定的液體復(fù)配酶的制備方法，其特征在于，包括如下步 驟：以重量份數(shù)計，按照配方首先準(zhǔn)確稱取增稠劑，加入其質(zhì)量4-6倍的無菌水，室溫浸泡 3-8h，邊升溫邊攪拌，80-90°C保溫20-30min，攪拌，充分溶解，繼續(xù)保溫，邊攪拌邊依次加 入β-環(huán)糊精、多元醇、糖、金屬氯化物，然后降溫至25-35°C，邊攪拌邊依次加入硫酸銨、半 胱氨酸、谷胱甘肽、抗菌肽、天然抗氧化劑、牛血清白蛋白、中草藥提取液、啤酒花提取液、液 體酶制劑充分溶解、混合，用乳酸調(diào)節(jié)液體復(fù)配酶pH值為2. 5-6,穩(wěn)定0. 5-2h，同時于電場 強度35-45kV/cm，脈沖時間400-600μ s，脈沖頻率300-400HZ條件下進行高壓脈沖電場殺 菌，除菌過濾、無菌灌裝即得液體復(fù)配酶。
8. 如權(quán)利要求7所述穩(wěn)定的液體復(fù)配酶的制備方法，其特征在于，所述糖為海藻糖、靈 芝多糖、葡萄糖按質(zhì)量比8-10:1-3:5-9均勻混合。
9. 如權(quán)利要求7所述穩(wěn)定的液體復(fù)配酶的制備方法，其特征在于，所述天然抗氧化劑 由葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏葉提取物按質(zhì)量比6-8:5-7:2-4均勻混合。
10. 如權(quán)利要求1-6任一所述穩(wěn)定的液體復(fù)配酶在啤酒釀造中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/16GK104099314SQ201410345910
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】段仲達 申請人:紹興上虞宏晟技術(shù)轉(zhuǎn)讓服務(wù)有限公司