一種高效固定化脂肪酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效固定化脂肪酶的制備方法，屬于酶化學【技術領域】。本發(fā)明所公開的方法是分別用磷酸鹽緩沖溶液溶解脂肪酶和經(jīng)預處理的大孔吸附樹脂，再將脂肪酶溶液加入到大孔吸附樹脂溶液中震蕩均勻后，進行吸附處理，吸附后再加入戊二醛溶液進行固定處理，固定后經(jīng)真空抽濾、洗滌和干燥后得到固定化脂肪酶。利用本發(fā)明的方法所制備的固定化酶，具有高酸解活性、1，3-位專一性和穩(wěn)定性的特點，其酸解活性是游離酶的2.88倍，且專一性僅損失1.7％，同時在熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性和pH耐受范圍方面也有顯著提高。本發(fā)明公開的方法具有工藝簡單，制備周期短，產(chǎn)品催化效率高，專一性和穩(wěn)定性強的特點，適用于產(chǎn)業(yè)化推廣。
【專利說明】一種高效固定化脂肪酶的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效固定化脂肪酶的制備方法，屬于酶化學【技術領域】。 技術背景
[0002] 脂肪酶是一種生物催化劑，與化學催化試劑相比具有反應速度快、反應效率高、反 應條件溫和、底物專一性強以及可在中性pH條件下操作等優(yōu)點，同時脂肪酶本身也是一種 蛋白質(zhì)，可以被微生物生物降解，符合綠色化學的要求，其已在食品、醫(yī)藥、輕工和農(nóng)業(yè)等許 多領域得到應用，尤其在食品加工中的應用越來越廣泛。其中更以具有位置特異性的脂肪 酶為代表，這類脂肪酶對于三酰甘油特定位置的脂肪酸優(yōu)先水解，主要作用于三酰甘油的1 位和3位，因此也被稱為snl，3位專一性脂肪酶，因其獨特的性質(zhì)被廣泛應用于合成結(jié)構(gòu)油 月旨，如合成低熱量油脂、母乳脂肪替代品及新型脂質(zhì)衍生物等。
[0003] 雖然在合成結(jié)構(gòu)油脂方面snl，3脂肪酶具有反應高效，合成率高等優(yōu)點，但脂肪 酶的價格昂貴，在反應過程中也比較不穩(wěn)定，而且很難回收重復再利用，種種缺陷使其在大 規(guī)模應用上受到限制，因此目前用于工業(yè)生產(chǎn)結(jié)構(gòu)油脂產(chǎn)品的主要還是化學方法。而酶的 固定化就是為了克服以上限制，使酶能像化學催化劑一樣在反應過程中穩(wěn)定操作，且利于 回收和反復使用而發(fā)展起來的一項技術。通過固定化可以改善酶的某些性質(zhì)，如熱穩(wěn)定性 和操作穩(wěn)定性等，使其達到重復使用的目的，在一定程度上降低成本，推動了其在工業(yè)上的 大規(guī)模應用。許多國內(nèi)外學者采用吸附、交聯(lián)、包埋及共價結(jié)合等固定化方法來提高脂肪酶 的活性及穩(wěn)定性，而吸附法是最常用的一種固定化方法。
[0004] 目前，大多研究都是關于固定化提高脂肪酶的水解活性和酯交換活性，關于提高 脂肪酶酸解活性的研究鮮見報道。酸解活性是指脂肪酶催化甘油三酯與脂肪酸之間發(fā)生酰 基轉(zhuǎn)移，從而改變甘油三酯結(jié)構(gòu)組成的活性。脂肪酶酸解活性的提高在甘油三酯與脂肪酸 作用合成結(jié)構(gòu)油脂的研究中具有積極的意義。但是，在現(xiàn)有技術中一般的固定過程會對脂 肪酶的高效性和專一性造成負面影響。對于1，3位專一性脂肪酶來說，固定化常常會使其 專一性發(fā)生改變，從而失去在結(jié)構(gòu)油脂合成方面的優(yōu)越性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種高效固定化脂肪酶的制備方法，所采取的技 術方案如下：
[0006] -種高效固定化脂肪酶的制備方法，是分別用磷酸鹽緩沖溶液溶解脂肪酶和經(jīng)預 處理的大孔吸附樹脂，再將脂肪酶溶液加入到大孔吸附樹脂溶液中震蕩均勻后，進行吸附 處理，吸附后再加入戊二醛溶液進行固定處理，固定后經(jīng)真空抽濾、洗滌和干燥后得到固定 化脂肪酶。
[0007] 所述方法的步驟如下：
[0008] 1)大孔吸附樹脂的預處理：將大孔吸附樹脂加入到乙醇溶液中脹潤，用去離子水 洗滌后，再用分別用酸和堿交替處理樹脂，蒸餾水沖洗至中性后，干燥，獲得預處理大孔吸 附樹脂；
[0009] 2)磷酸鹽緩沖溶液的溶解：用磷酸鹽緩沖溶液浸泡步驟1)所得預處理大孔吸附 樹脂，再用磷酸鹽緩沖溶液溶解脂肪酶，獲得脂肪酶溶液；
[0010] 3)吸附處理：將步驟2)所得脂肪酶溶液加入到經(jīng)預處理的大孔吸附樹脂磷酸鹽 溶液中，震蕩混合后吸附處理，獲得吸附樹脂脂肪酶溶液；
[0011] 4)交聯(lián)處理：向步驟3)所得吸附樹脂脂肪酶溶液中加入戊二醛溶液進行固定化 處理，處理完后進行真空抽濾，用去離子水洗滌后干燥，得到固定化脂肪酶。
[0012] 所述方法的步驟1)中所述大孔吸附樹脂為NKA-9大孔吸附樹脂；所述乙醇溶液濃 度為90-95%，脹潤時間為23-25h ;所述用酸和堿交替處理是用4-5%的鹽酸和1-2%的氫 氧化鈉溶液每處理4h交替；所述干燥，溫度為37-40°C，時間為12-15h。
[0013] 所述方法的步驟2)中所述磷酸鹽緩沖溶液pH為6. 7-7. 0,濃度為0. 05M ;所述脂 肪酶的添加量為34-35mg/100mg載體。
[0014] 所述方法的步驟3)中所述吸附處理，吸附溫度為40-45°C，吸附時間為4-4. 5h，在 吸附處理過程中每隔5-10min進行震蕩混勻。
[0015] 所述方法的步驟4)中所述戊二醛溶液濃度為0. 25-0. 75% ;所述固定化處理，固 定時間為2-3h ;所述干燥，干燥溫度為37-40°C，干燥時間12-15h。
[0016] 所述方法的具體步驟如下：
[0017] 1)稱取500mg的NKA-9樹脂，加入95 %乙醇溶液浸泡脹潤24h，用去離子水洗滌去 除雜質(zhì)，再分別用5%鹽酸和2%氫氧化鈉溶液處理NKA-9樹脂，每處理4h交替，交替處理 1次，再用蒸餾水沖洗至中性后，于37°C干燥15h，獲得預處理NKA-9樹脂；
[0018] 2)取100mg步驟1)所得的預處理NKA-9樹脂，用pH6. 5 0. 05M的磷酸鹽緩沖溶液 溶解，再取34. 6mg脂肪酶用pH6. 5 0. 05M的磷酸鹽緩沖溶液溶解，獲得脂肪酶溶液；
[0019] 3)將步驟2)所得脂肪酶溶液加入到預處理NKA-9樹脂磷酸鹽溶液中，震蕩混合均 勻后，在45°C恒溫水浴中吸附處理4. lh，處理期間每隔lOmin進行震蕩混勻，吸附處理后獲 得吸附樹脂溶液；
[0020] 4)向步驟3)所得吸附樹脂溶液中加入0. 5 %的戊二醛溶液3ml，交聯(lián)固定2. 5h， 真空抽濾后用去離子水洗滌，37°C干燥15h得到固定化脂肪酶。
[0021] 本發(fā)明采用NKA-9大孔吸附樹脂為載體對脂肪酶進行固定化。該樹脂具有選擇 性好，吸附容量大，機械強度高，再生處理方便，吸附速度快及解析容易等優(yōu)點。本發(fā)明以 NKA-9樹脂和戊二醛對脂肪酶進行吸附-交聯(lián)固定化，一方面可以通過樹脂的孔隙吸附脂 肪酶，另一方面，利用戊二醛交聯(lián)可以使酶分子與載體分子間實現(xiàn)多點交聯(lián)，從而提高其反 應穩(wěn)定性。與吸附法相比，吸附-交聯(lián)固定化制備的固定化酶的穩(wěn)定性更好；與交聯(lián)法相 t匕，吸附-交聯(lián)固定化得到的固定化酶的活性更高。
[0022] 本發(fā)明以米根霉脂肪酶的酸解活性為評價指標，對固定化工藝進行優(yōu)化，不僅提 高了脂肪酶在催化反應中的穩(wěn)定性和重復利用性，而且還提高了脂肪酶的酸解活性。目前 關于固定化提高脂肪酶酸解活性的研究鮮有報道，普遍的固定化研究中是致力于提高脂肪 酶的水解活性和酯化活性，不適合應用于結(jié)構(gòu)油脂的合成方面。本發(fā)明米根霉脂肪酶的酸 解活性及穩(wěn)定性的提高為結(jié)構(gòu)油脂合成方面的大規(guī)模應用提供了技術參考，在獲得高純度 及高產(chǎn)率結(jié)構(gòu)油脂產(chǎn)物方面起到積極促進的作用。
[0023] 本發(fā)明的有益效果：
[0024] 首先，本發(fā)明顯著的提高了米根霉脂肪酶的酸解活性。發(fā)明人通過單因素實驗 和響應面優(yōu)化，確定了米根霉脂肪酶固定化的最佳工藝參數(shù)。在最佳工藝參數(shù)條件下，固 定化酶最佳酸解活性為31. 78%，而未進行固定化的游離酶在相同條件下的酸解活性只有 11. 02%。
[0025] 其次，本發(fā)明在提高脂肪酶酸解活性的同時有效地保護了脂肪酶的專一性。利用 本發(fā)明提供方法制備的固定化米根霉脂肪酶的1，3位專一性幾乎沒有損失。通過對固定化 米根霉脂肪酶酶解產(chǎn)物的氣相分析，固定化米根霉脂肪酶的專一性能夠達到原始游離米根 霉脂肪酶的98. 3%，表現(xiàn)出良好的1，3-位專一性。
[0026] 此外，通過固定化技術，本發(fā)明提高了米根霉脂肪酶的反應穩(wěn)定性。通過對制備的 產(chǎn)品固定酶穩(wěn)定性的測定。利用本發(fā)明所提供方法制備的固定化脂肪酶具有良好的熱穩(wěn) 定性、貯存穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性和更寬的pH耐受范圍。具體為：當溫度升高至70°C時，固定 化酶仍能保持31. 8%的相對活性，而此時游離酶已失活；固定化酶在貯存15d后，活性損失 僅為26. 5%，而游離酶的活性損失高達86. 5% ;固定化酶在經(jīng)過6次重復利用后仍能保持 50. 8%的相對活性；固定化酶對的pH耐受范圍為pH4-9,而游離酶的pH范圍只有pH5-8。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為給酶量和吸附時間對固定化脂肪酶酸解活性的影響；
[0028] (A，給酶量；B，吸附時間）。
[0029] 圖2為給酶量和pH對固定化脂肪酶酸解活性的影響；
[0030] (A，給酶量；C，pH)。
[0031] 圖3為吸附時間和pH對固定化脂肪酶酸解活性的影響；
[0032] (B，吸附時間；C，pH)。
[0033] 圖4為溫度對固定化酶及游離酶活性的影響。
[0034] 圖5為pH對固定化酶及游離酶活性的影響。
[0035] 圖6為貯存時間對固定化酶及游離酶活性影響。
[0036] 圖7為催化反應次數(shù)對固定化酶活性的影響。

【具體實施方式】
[0037] 本發(fā)明采用吸附-交聯(lián)法固定化米根霉脂肪酶，先進行吸附固定再進行交聯(lián)固 定，較傳統(tǒng)的吸附交聯(lián)固定中的吸附交聯(lián)同時進行方法相比，縮短了交聯(lián)劑對脂肪酶的作 用時間，減少了交聯(lián)劑對snl，3位專一性的影響，同時又提高了米根霉脂肪酶酸解活性和 穩(wěn)定性。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0038] 實施例1脂肪酶固定化工藝的主要影響因素分析
[0039] 在單因素實驗的基礎上，確定了影響脂肪酶固定化工藝五個因素的最佳值是 給酶量35mg/100mg載體，pH為7,吸附時間4h，交聯(lián)劑濃度0.5%，交聯(lián)時間2.5h，采用 Plackett-Burman設計來確定對固定化脂肪酶性質(zhì)影響的主次因素，以每個因素的活性最 高點為中心點，并以此5個因素為自變量，以-1，0, +1分別代表自變量的高、中、低3個水 平，以固定化脂肪酶的酸解活性為指標。每個因素取其中心點兩側(cè)的兩個值，下表為水平編 碼表。[0040] 表1主要影響因素水平編碼表

【權(quán)利要求】
1. 一種高效固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于，分別用磷酸鹽緩沖溶液溶解脂肪 酶和經(jīng)預處理的大孔吸附樹脂，再將脂肪酶溶液加入到大孔吸附樹脂溶液中震蕩均勻后， 進行吸附處理，吸附后再加入戊二醛溶液進行固定處理，固定后經(jīng)真空抽濾、洗滌和干燥后 得到固定化脂肪酶。
2. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟如下： 1) 大孔吸附樹脂的預處理：將大孔吸附樹脂加入到乙醇溶液中脹潤，用去離子水洗滌 后，再用分別用酸和堿交替處理樹脂，蒸餾水沖洗至中性后，干燥，獲得預處理大孔吸附樹 脂； 2) 磷酸鹽緩沖溶液的溶解：用磷酸鹽緩沖溶液浸泡步驟1)所得預處理大孔吸附樹脂， 再用磷酸鹽緩沖溶液溶解脂肪酶，獲得脂肪酶溶液； 3) 吸附處理：將步驟2)所得脂肪酶溶液加入到經(jīng)預處理的大孔吸附樹脂磷酸鹽溶液 中，震蕩混合后吸附處理，獲得吸附樹脂脂肪酶溶液； 4) 交聯(lián)處理：向步驟3)所得吸附樹脂脂肪酶溶液中加入戊二醛溶液進行固定化處理， 處理完后進行真空抽濾，用去離子水洗滌后干燥，得到固定化脂肪酶。
3. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟1)中所述大孔吸附樹脂為NKA-9大孔吸 附樹脂；所述乙醇溶液濃度為90-95%，脹潤時間為23-25h ;所述用酸和堿交替處理是用 4-5%的鹽酸和1-2%的氫氧化鈉溶液每處理4-5h交替；所述干燥，溫度為37-40°C，時間為 12-15h。
4. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟2)中所述磷酸鹽緩沖溶液pH為6. 7-7.0， 濃度為〇. 05M ;所述脂肪酶的添加量為34-35mg/100mg載體。
5. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟3)中所述吸附處理，吸附溫度為40-45°C， 吸附時間為4. 0-4. 5h，在吸附處理過程中每隔5-10min進行震蕩混勻。
6. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟4)中所述戊二醛溶液濃度為0.25-0. 75%; 所述固定化處理，固定時間為2-3h ;所述干燥，干燥溫度為37-40°C，干燥時間12-15h。
7. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，具體步驟如下： 1) 稱取500mg的NKA-9樹脂，加入95%乙醇溶液浸泡脹潤24h，用去離子水洗滌去除雜 質(zhì)，再分別用5 %鹽酸和2 %氫氧化鈉溶液處理NKA-9樹脂，每處理4h交替，交替處理1次， 再用蒸餾水沖洗至中性后，于37°C干燥15h，獲得預處理NKA-9樹脂； 2) 取100mg步驟1)所得的預處理NKA-9樹脂，用pH6. 50. 05M的磷酸鹽緩沖溶液溶解， 再取34. 6mg脂肪酶用pH6. 50. 05M的磷酸鹽緩沖溶液溶解，獲得脂肪酶溶液； 3) 將步驟2)所得脂肪酶溶液加入到預處理NKA-9樹脂磷酸鹽溶液中，震蕩混合均勻 后，在45°C恒溫水浴中吸附處理4. lh，處理期間每隔lOmin進行震蕩混勻，吸附處理后獲得 吸附樹脂溶液； 4) 向步驟3)所得吸附樹脂溶液中加入0.5%的戊二醛溶液3ml，交聯(lián)固定2. 5h，真空 抽濾后用去離子水洗滌，37°C干燥15h得到固定化脂肪酶。
【文檔編號】C12N11/08GK104046609SQ201410288956
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】劉寧, 李春, 張聞修 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學